專利名稱：與豬生長速度相關的遺傳標記及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程及分子生物學領域，具體地說，涉及一種與豬生長速度相關的遺傳標記及其應用。
背景技術：
養豬業是我國畜牧業生產的主體，其產值長期以來始終都是畜牧業總產值的第一位。隨著人們生活水平的提高，對肉食品的數量和質量需求不斷提高，如何培育出生長速度 快并且肉質風味好的豬種成為當前豬育種工作的熱點。我國豬種資源豐富，為豬育種提供良好的素材，也為研究重要的與經濟相關性狀的基因和分子標記提供良好的材料。藏豬是我國特有的高原型豬種，體小皮薄、肉嫩味美，風味濃郁，肉質細膩、風味獨特，素有“高原之珍”的美譽(劉軒，強巴央宗，王強等.藏豬繁殖性狀多基因效應分析.遺傳，2010，32 (5) :480-485)。藏豬產于我國青藏高原海拔250(T4300m區域，對高原低氧、低溫和粗放的飼養環境有較強的適應性，是發展我國高海拔地區養豬業的重要品種資源。滇南小耳豬是云南省西雙版納州小型地方品種，具有適應熱帶雨林地區高溫潮濕的生態環境，早熟易肥、屠宰率高、抗逆性強、皮薄骨細、肉質鮮嫩、營養豐富等優點。藏豬和滇南小耳豬均是小型地方品種，是研究豬生長和肉質性狀基因的良好材料。隨著分子數量遺傳學、分子生物學技術的飛速發展，有關分子遺傳標記和標記輔助選擇的研究被廣泛開展，并在畜禽育種中應用，產生了巨大的影響。生長性狀是豬育種中選擇的主要目標之一，不同品種或類型的豬生長速度有明顯的差別。從分子水平上鑒定影響生長速度的基因或標記是目前豬功能基因研究的熱點之一(姜運良，李寧，杜立新，吳常信.豬肌肉生長抑制素基因5’調控區T —A突變與生長性狀的關系分析.遺傳學報.2002，29(5):413 416)。研究者曾通過對基因的多態性與生長性狀的關聯分析，認為生長激素基因(PaszekAA, Wilkie P J, Wilkie P J, Flickinger G H, et al. Intervalmappingof growth in divergent swine cross. Mamm Genome. 1999,10(02) :117 122 ;Bidanel J P， Milan D， Iannuccelli N， et al.Detection ofquantitative traitloci for growth and fatness in pigs. Genet SeIEvoI. 2001,5-6,33 (03) :289 309 ;LEE S J，McPherron A C. Myostatinand the control of skeletal muscle mass. CurrOpin Genet Dev. 1999，9 (05) :604-607)、類胰島素生長因子 I 基因、PITl 基因(Yu T P，SchmitzC B，Rothschild M F，Tuggle C K. Association of PITl poIymorphismswithgrowth and carcass traits in pigs. J Anim Sci. 1995，73(05):1282 1288)、MC4R基因(Kim K S，Larsen N，Short T，et al. Amissense variant of the porcinemelanocortin-4receptor(MC4R)gene isassociated with fatnsee growth,and feedintake traits. Mamm Genome. 2000，11:131 135)和痩素受體(Kennes Y M，Murphy B D，PothierFiPalin M F. Characterization of swine leptin(LEP)polymorphisms andtheirassociation with production traits. Anim Genet. 2001，32 (04) : 215-218)等與豬的生長速度有關。但目前，在豬分子育種實踐中仍然缺少功能明確、效應顯著的主效基因和分子標記。生長激素促分泌素受:體(growthhormone secretagogue receptor, GHSR)屬于α 螺旋 7 次跨膜的 G 蛋白偶聯受體(Herrington J, Hille B. Growth hormone-releasinghexapeptide elevates intracellular calciumresponse in rat somalotrophes bytwo mechanisms. Endocrinology. 1994,135 :1100-1108.)與生長激素分泌素(Ghrelin)結合，調節生長激素分泌，進而調節生長速度(Howard A D, Feighner S D, Cully D F, etal. A receptor in pituitary and hypothalamus that functions in growth hormonerelease. Science, 1996, 273(5277) :974-977)。基于該基因在生長發育過程中起到的重要作用，因此將其作為豬生長相 關的候選基因，采用PCR測序技術篩選不同類型豬群體間差異的SNP位點，從而建立起快速檢測方法，為尋找影響豬生長性狀的SNP位點及相關分子遺傳標記的開發提供了新思路。
發明內容
本發明的目的是提供一種與豬生長速度相關的遺傳標記及其應用。本發明的另一目的是提供用于檢測所述與豬生長速度相關的遺傳標記的引物及含有該引物的試劑盒。為了實現本發明目的，本發明的一種與豬生長速度相關的遺傳標記，其位于豬GHSRla基因5’側翼區上，它的核苷酸序列如SEQ IDN0. I所示，其中，151bp處的堿基C與豬快速生長性狀相關，如果該堿基C突變為A，則與豬慢速生長性狀相關。本發明還提供用于檢測上述與豬生長速度相關的遺傳標記的引物，包括正向引物F5’ -AAACGCACTAATAAATGCTTCA-3’ 和反向引物 R5’ -CTTCCTGCCCTCACCTTTT-3’。本發明還提供上述與豬生長速度相關的遺傳標記在鑒定豬種中的應用，其包括步驟1)提取待測豬的基因組DNA ；2)以待測豬的基因組DNA為模版，利用所述引物F和R，通過PCR反應擴增出豬GHSRl a基因5’側翼區177bp片段；3)檢測PCR擴增產物，如果擴增產物序列中151bp處的堿基為C，則待測豬屬于生長速度快的豬品種，如果擴增產物序列中151bp處的堿基為A，則待測豬屬于生長速度慢的豬品種。前述應用中，步驟2)中PCR反應使用的擴增體系以25 μ I計為IOOng/μ I模板DNAl μ l，5pmol/y I 弓丨物 F和 R各 I μ 1，IOmmoI/L dNTPmix2. O μ l,5U/y L Taq DNA聚合酶
0.5 μ 1，10XPCR反應緩沖液2.5 μ 1，余量為水。前述應用中，步驟2)中PCR反應使用的條件為95°C 5分鐘；95°C 30秒，58°C 30秒，720C 20秒，36個循環；72°C 7分鐘。前述應用中，步驟3)中檢測PCR擴增產物采用RFLP法，具體為用內切酶AccII對PCR擴增產物進行酶切，并對酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，如果檢測結果僅為一條帶，則待測豬屬于生長速度慢的豬品種，檢測結果出現兩條帶，則待測豬屬于生長速度快的豬品種。本發明還提供含有所述引物F和R的用于檢測豬生長速度的試劑盒。所述試劑盒還包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反應緩沖液中的一種或多種。優選所述試劑盒還包括標準陽性模板。
本發明進一步提供所述與豬生長速度相關的遺傳標記在豬分子標記輔助育種中的應用。本發明提供了一種與豬生長速度相關的遺傳標記及其應用，既采用聚合酶鏈式反應(PCR)和測序技術篩選到與豬生長速度相關的遺傳標記，并通過限制片段多態性(RFLP)方法來檢測待測豬的基因型，根據基因型進行豬的選育，從而加快豬的育種進程。本發明優點在于(一)本發明提供的分子遺傳標記不受豬的年齡、性別等限制，可用于豬的早期選育，甚至在豬剛出生時就可準確地進行選留，可大大縮短世代間隔，加快豬的育種進程；(二)檢測方法快速、準確。
圖I為本發明較佳實施例大約克豬與藏豬、滇南小耳豬GHSRl α基因5’側翼區序列比對結果。 圖2為本發明豬GHSRl α基因5’側翼區擴增結果；其中，瓊脂糖膠濃度為1% ;圖中泳道M為DM2000plus Marker ;泳道1_4為藏豬，泳道5_7為滇南小耳豬，泳道8_10為大
約克豬。圖3為本發明豬GHSRl α基因AccII-RFLP檢測結果；其中，瓊脂糖膠濃度為3% ；圖中泳道M為DM2000plus Marker ;泳道6為AA基因型，泳道2、5和7為AC基因型，泳道
1、3、8、9、10、11、12 和 13 為 CC 基因型。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段，所用原料均為市售商品。實施例I豬GHSRl α基因5’側翼序列片段的獲得及SNP位點篩選選擇中國地方品種“藏豬”(采自西藏農牧學院教學實習牧場)、“滇南小耳豬”(采自云南省西雙版納州滇南小耳豬資源保護場)和引進品種“大約克豬”(采自云南省昆明市云南農業大學實習豬場)為試驗材料。藏豬和滇南小耳豬生長速度較慢，大約克豬生長速度較快。根據Genbank中豬的GHSRla基因序列(登錄號NC_010455)，利用PrimerPremier 5. O軟件設計以下引物正向引物F : 5’ -AGCCGCTTAATACCAGTCTG-3’反向引物R : 5’ -TAGAACCTATCATCCGTCGTG-3’用上述弓丨物對藏豬、滇南小耳豬、大約克豬基因組DNA進行PCR擴增，PCR反應體系為 25yL，其中 10\ 0 反應緩沖液2.5 4 1^，10臟01/1(1見13 mix 2. O μ L，5pmol/μ L 的正反向引物各 I μ L, Taq DNA 聚合酶(5U/μ L) O. 5 μ L, DNA 模板 I μ L(DNA 約 IOOng)，加 dd H2O至25 μ L。PCR反應條件為第I步95° C變性5min ;第2步95° C變性30s ;第3步58° C復性30s ;第4步72° C延伸30s ;重復第2至第4步36個循環，之后再72° C延伸7min，最后降溫至4° C保存。對上述3個豬種的PCR產物經Gel Extraction Kit試劑盒(購自上海生物工程技術有限公司，按照試劑盒說明書操作)純化。每個豬種分別選10個個體進行PCR擴增，每個體的PCR產物各取8 μ L，混池成一個樣本進行測序(北京諾賽生物科技公司)。上述PCR擴增片段長度為869bp，如SEQ ID NO. 6所示。三個豬種的測序結果經DNAMAN軟件進行比對，其中位于該PCR擴增片段的第48bp處(位于5’側翼區-1595bp處)的C堿基突變為A堿基(圖I)，該突變位點可被Acc II內切酶(識別序列為CGCG)識別。
實施例2豬GHSRl α基因5’側翼區多態性PCR-RFLP檢測方法建立為了快速方便的檢測豬GHSRl α基因5’側翼區_1595bp處多態性，針對實施例I中發現的SNP位點設計新的擴增引物，引物序列為正向引物F : 5’ -AAACGCACTAATAAATGCTTCA-3’反向引物 R : 5’ -CTTCCTGCCCTCACCTTTT-3’用該對弓丨物對藏豬、滇南小耳豬、大約克豬等基因組DNA進行PCR擴增，PCR反應體系為 25μ L，其中 10XPCR Buffer 2. 5 μ L, 10mmol/L dNTP mix2. O μ L，5pmol/μ L 的引物各
Iμ L, Taq DNA 聚合酶(5U/ μ L) O. 5 μ L，DNA 模板 I μ L (DNA 約 IOOng)，加 dd H2O M 25 μ L0PCR反應條件為第I步95° C變性5min;第2步95° C變性30s ;第3步58° C復性30s ;第4步72° C延伸20s ;重復第2至第4步36個循環，之后再72° C延伸7min，最后降溫至4° C保存。PCR擴增產物用濃度為I. 5%的瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，凝膠成像系統中觀察PCR擴增效果，可見到片段大小為177bp的清晰條帶(圖2)。該PCR產物用AccII內切酶酶切，反應體系為10X反應緩沖液I μ L，AccII內切酶O. 25 μ L(濃度為IOU/μ L)，PCR產物4 μ LjPdd H2O至10 μ L。37° C環境中酶切4_8h。然后，將得到的酶切產物在3%瓊脂糖凝膠中電泳，溴化乙錠染色，凝膠成像系統中觀察(圖3)，判斷基因型。當擴增片段的151bp處堿基均為C時，AccII內切酶可識別該位點，即可將PCR擴增片段切成兩個片段，一個為150bp，另一個片段為27bp，該基因型記為CC型；當151bp處的堿基都為A時，Acc II內切酶不可識別，即PCR擴增片段不能被切開，凝膠中只有一條帶，長度為177bp，該基因型記為AA型；當151bp處既含有C堿基又含有A堿基時，即凝膠電泳中含有三條帶，長度分別為177bp，150bp和27bp，該基因型記為雜合型AC型。實施例3本發明篩選的遺傳標記在不同豬群中的多態性檢測采用實施例2中建立的PCR-RFLP技術，測定藏豬、滇南小耳豬、大約克豬群體GHSRl α基因5’側翼區_1595bp的PCR-Acc II -RFLP多態性分布，檢測結果如表I所示。表I豬GHSRl α基因5 ^偵彳翼區_1595bp位點多態性分布
品- 樣品教基
ΛΛ AC’ CCAC
藏豬45 0.62 0.29 0.09 0,77 0.23
> Η Ι^'ε 40 0.25 0—55 CUO (152 O—4S 龕夏著 45OOIO 藏豬和滇南小耳豬同屬生長速度慢的豬品種，等位基因C頻率分別為23%和48%，而生長速度快的品種大約克豬等位基因C頻率為100%。表I結果表明該基因位點的基因型和等位基因分布在不同生長性能的豬群間差異明顯，可能與生長性能相關。實施例4淮豬新品系GHSRla基因型與生長速度的關聯分析
采集122頭淮豬新品系(采自安徽科鑫養豬育種有限公司，為該新品系的4世代群體)耳組織樣品，個體間無親緣關系，所有個體測定和計算達30kg體重的日齡和達90kg體重的日齡2個生長性狀指標(表2)。表2淮豬新品系4世代生長性能
權利要求
1.一種與豬生長速度相關的遺傳標記，其特征在于，其位于豬GHSRl a基因5'側翼區上，它的核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示，其中，151bp處的堿基C與豬快速生長性狀相關，如果該堿基C突變為A，則與豬慢速生長性狀相關。
2.用于檢測權利要求I所述與豬生長速度相關的遺傳標記的引物，其特征在于，包括正向引物F5 ' -AAACGCACTAATAAATGCTTCA-3 '和反向引物R5' -CTTCCTGCCCTCACCTTTT-3'。
3.權利要求I所述與豬生長速度相關的遺傳標記在鑒定豬種中的應用，其包括步驟 1)提取待測豬的基因組DNA； 2)以待測豬的基因組DNA為模版，利用權利要求2所述引物F和R，通過PCR反應擴增出豬GHSRl a基因5'側翼區177bp片段； 3)檢測PCR擴增產物，如果擴增產物序列中151bp處的堿基為C，則待測豬屬于生長速度快的豬品種，如果擴增產物序列中151bp處的堿基為A，則待測豬屬于生長速度慢的豬品種。
4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于，步驟2)中PCR反應使用的擴增體系以 25 ii I 計為IOOng/ii I 模板 DNA I y 1，5pmol/y I 引物 F 和 R 各 I y 1，10mmol/L dNTPmix2. Ou l,5U/u L Taq DNA 聚合酶 0. 5 yl，10XPCR 反應緩沖液 2. 5 yl，余量為水。
5.根據權利要求4所述的應用，其特征在于，步驟2)中PCR反應使用的條件為95°C5分鐘；95°C 30 秒，58 0C 30 秒，72 °C 20 秒，36 個循環；72°C 7 分鐘。
6.根據權利要求3所述的應用，其特征在于，步驟3)中檢測PCR擴增產物采用RFLP法，具體為用內切酶Acc II對PCR擴增產物進行酶切，并對酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，如果檢測結果僅為一條帶，則待測豬屬于生長速度慢的豬品種，檢測結果出現兩條帶，則待測豬屬于生長速度快的豬品種。
7.含有權利要求2所述引物的用于檢測豬生長速度的試劑盒。
8.根據權利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg2+、PCR反應緩沖液中的一種或多種。
9.根據權利要求7或8所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括標準陽性模板。
10.權利要求I所述與豬生長速度相關的遺傳標記在豬分子標記輔助育種中的應用。
全文摘要
本發明提供了一種與豬生長速度相關的遺傳標記及其應用，其位于豬GHSR1α基因5′側翼區上，它的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中，151bp處的堿基C與豬快速生長性狀相關，如果該堿基C突變為A，則與豬慢速生長性狀相關。本發明采用聚合酶鏈式反應(PCR)和測序技術篩選到與豬生長速度相關的遺傳標記，并通過限制片段多態性(RFLP)方法來檢測待測豬的基因型，根據基因型進行豬的選育，從而加快豬的育種進程。
文檔編號A01K67/027GK102649958SQ20121015726
公開日2012年8月29日 申請日期2012年5月18日 優先權日2012年5月18日
發明者史利華, 吳克亮, 張 浩, 李慶崗, 陶著 申請人:中國農業大學