專利名稱：一種有效防止綠藻產生的擬南芥水培方法
技術領域：
本發明涉及一種擬南芥的水培方法，特別是涉及ー種在培養室或人工氣候箱內有效防止綠藻產生的擬南芥水培方法。
背景技術：
擬南芥具有生活史短、種子多、形態結構簡單、全部基因組已測序、遺傳轉化體系成熟等優點，作為模式植物廣泛應用于遺傳學、植物營養學、逆境生物學等研究中。擬南芥幼苗脆弱，易受外界環境，特別是培養基組分的影響，致使實驗的重復性較差、影響實驗的進度。另外，由于擬南芥植株小、生物量相對較少，致使許多生理生化方面的實驗難以開展。 因此，在研究過程中，提高擬南芥的生長速度，提供ー種良好且一致的生長環境，培養出健壯而整齊一致的植株，不但是實驗成功的關鍵，而且是實驗順利進行的必要條件。土培和瓊脂固體培養法是目前擬南芥培養的兩種最主要的方法，土培難以精確控制培養基質中的營養成分，且很難獲取完整的根系；而瓊脂固體培養法難以繁殖種子，且植株小，不易獲得大量的實驗材料，尤其是根系。水培不但可以提供ー個一致且可重復的培養系統，而且可以根據實驗要求精確控制水溶液中的營養成分，各部分實驗材料(尤其是根系)容易觀察和收集，可極大的提高擬南芥生長速度，獲取更多的實驗材料。但目前大部分水培方法，易被緑藻污染，致使植株瘦弱，提取擬南芥根系RNA、DNA、蛋白質等組分時，常被緑藻所污染，影響實驗結果，甚至因實驗材料達不到要求而無法開展實驗。因此，目前迫切需要一種在培養室或人工氣候箱內嚴格控制實驗條件的無綠藻污染、根系發達且簡單易行的擬南芥水培方法。
發明內容
本發明的目的是提供一種可在培養室或人工氣候箱內培育出健壯、大小基本一致、無綠藻污染、簡單易行的擬南芥水培方法。本發明提供的擬南芥水培方法，包括以下步驟
I)育苗將消毒、春化的種子播于1/2 MS固體培養基上，培養12 18天。培養條件光周期為14小時光照，10小時黑暗；溫度為白天22±2° C，夜間為18±2° C ;相対濕度為60% 80% ;光照強度為100 400 μ MnT2 s—1，經培育得擬南芥幼苗。2)轉苗將步驟I)所得的幼苗轉至打有一孔的3、平方厘米的小KT板上，使根穿過孔進入培養液。然后將苗轉入裝有1/2 Hoagland營養液的盆中進行馴化，轉苗前2天用玻璃板蓋在盆上密封，以防幼苗干枯，而后每天打開ー些，使苗逐漸適應外部的環境，直至完全移開玻璃板，馴化培養約需5 7天。培養條件與育苗相同。3)自制培養裝置，并將其消毒根據實驗要求，選擇適當大小的培養盤并消毒。剪取比培養盤略小的KT板，在KT板上挖寬約I. 5厘米，兩端約短于KT板各2厘米的長方形小槽，根據KT板大小，每隔51厘米挖ー小槽，也可根據實驗需要，適當的調整小槽間距，各小槽平行排列。在培養盤內裝入適量的1/2 Hoagland培養液，再把上述改造的KT板放入培養盤內。將錫箔紙置于KT板上方,并封住培養盤開ロ，KT板質輕，因而會始終浮于培養液的上方，可防止其上的錫箔紙等物體浸入水中。錫箔紙可遮光，能防止培養液受到光的照射，從而有效防止綠藻滋生。4)幼苗培養將步驟2)所得的帶小KT板的幼苗轉至3)所述的自制培養裝置上，根據錫箔紙下方大KT板上長方形小槽的位置種植擬南芥，每ー小槽上方種植ー排小苗。小苗種植時在錫箔紙上劃ー小ロ，讓小苗的根通過錫箔紙及其下方大KT板上的小槽浸入水中，每隔51厘米轉ー棵小苗，也可根據實驗需要，適當的調整小苗的間距。培養條件與育苗相同。每隔6、天更換一次培養液，每2 3天給培養液充空氣一次，以保證根部有充足的氧氣。在上述培養方法中，步驟I)種子消毒、春化的方法為用75%的酒精表面消毒Imin，2%的次氯酸鈉浸泡10 min，再經滅菌水洗滌5飛次后播種于1/2 MS (O. 52°/Γθ. 58 %瓊脂，3%蔗糖，O. 05%的MES，pH 5. 8)培養基上。1/2 MS培養基被裝入組培瓶內，組培瓶上方空間較大，在同樣的時間內，所得幼苗蓮座葉要比培養皿內的大且健壯，撒在MS培養基 上的種子要稀，過密相互擁擠會影響植株生長。將上述組培瓶放入4°C冰箱內，使種子春化2^3天，然后再置于培養室或人工氣候箱內里培養。步驟2)小KT板上的孔可用打孔器制作。為防止根損傷，可利用洗瓶擠壓出的水流帶動根穿過孔。擬南芥幼苗的根細弱，若用質地堅硬的鑷子或其它工具使根穿過孔，會給根帶來不可避免的傷害，引起幼苗干枯甚至死亡。而用細的水流帶動根穿過孔不僅不易造成幼苗損傷，而且還可使柔軟的根輕松穿越孔，大大加快轉苗速度。所用KT板可從廣告公司或裝飾材料店購買。KT板厚約O. 5厘米。所用盆在使用前用5%。 10%。的次氯酸鈉消毒Γ2小吋，再用蒸餾水沖洗5飛次。步驟3)中所述的培養盤可用不同顔色但不透光、高約5 10厘米的方形或長方形水果盤。培養盤每次使用前用5%。 10%。的次氯酸鈉消毒f 2小時，再用蒸餾水沖洗干凈。步驟4)中所述的錫箔紙上的小口，可用小刀在錫箔紙適當的位置垂直劃ー小口(形狀如“L”形)，并在根穿過小口后，用透明膠帶將ロ封上。本發明簡單易行、便于操作，所用材料價格低廉易得，實驗重復性好，所得苗健壯、大小基本一致、無綠藻污染，所用培養液可根據實驗需求而適當調整、井能精確控制其成份。上述方法可以培養任何生態型的野生型或突變體擬南芥植株。本發明可在培養室或人エ氣候箱內培育幼苗，也可用來繁殖種子，應用前景廣闊。
下面結合附圖以及具體實施例對本發明作進ー步的詳細說明。圖I為本發明的自制擬南芥培養裝置結構示意圖；1、打有一孔的:Γ5平方厘米的小KT板，2、轉移到I所示小的KT板上的擬南芥幼苗，3、錫箔紙，4、錫箔紙上的“ L”形小口，
5、比培養盤略小的大KT板，6、大KT板上的長方形小槽，7、培養盤。圖2為本發明的自制擬南芥培養裝置剖視示意圖；廣7同圖1，8、培養盤中的培養液。
具體實施方式
實施例I、一種有效防止綠藻產生的擬南芥水培方法，依次進行以下步驟
I)育苗將適量哥倫比亞野生型擬南芥種子置于I. 5毫升離心管中，用I毫升75%的酒精表面消毒I分鐘，倒出酒精，再加入I毫升2%的次氯酸鈉滅菌10分鐘，倒出次氯酸鈉，然后用滅菌水洗滌5次后播于組培瓶內1/2 MS (O. 56%瓊脂，3%蔗糖，O. 05%的MES，PH 5. 8)培養基上。播種密度要稀，防止過于擁擠影響植株生長。將撒有種子的組培瓶放入4°C冰箱內，春化2天，然后再置于培養室培養15天。培養條件光周期為14小時光照，10小時黑暗；溫度為白天22±2° C，夜間為18±2° C ;相対濕度為70% ;光照強度為120 μΜm_2 s—1，經培育得擬南芥幼苗。2)轉苗將步驟I)所得的幼苗轉至打有一孔的約4平方厘米的小KT板上，用洗瓶擠壓出的水流帶動根穿越孔進入培養液。然后將苗轉入內裝1/2 Hoagland營養液的盆(用前已用5%。次氯酸鈉消毒I小時，并用蒸餾水沖洗5次)中進行馴化培養5天，轉苗前2天用玻璃板蓋在盆上密封，以防幼苗干枯，而后每天打開ー些，使苗逐漸適應外部的環境，直至完全移開玻璃板。培養條件與育苗相同。 3)自制培養裝置，并將其消毒選擇適當大小的培養盤并用5%。次氯酸鈉消毒I小時，用蒸餾水沖洗干凈。根據所選培養盤大小，剪取比其略小的KT板，在KT板上挖寬約I. 5厘米，兩端約短于KT板各2厘米的長方形小槽，在KT板上每隔5厘米挖ー小槽。在培養盤內裝入適量的1/2 Hoagland培養液，再把上述改造的KT板放入培養盤內。將錫箔紙置于KT板之上，并封住培養盤開ロ。4)幼苗培養將步驟2)得的帶小KT板的幼苗轉至3)所述的自制培養裝置上，將擬南芥種植于小槽上方，沿小槽平行排列。在錫箔紙上劃ー “し”形的小ロ，讓小苗的根通過錫箔紙及其下方大KT板上的小槽浸入水中，每隔5厘米轉ー小苗，錫箔紙上的小口用透明膠帶封上。每隔8天更換一次培養液，每2天給培養液充空氣一次，以保證根部有充足的氧氣。培養條件與育苗相同。從播種到植株開花大約需要4飛周，6周后角果中種子開始成熟。由于培養液經常更換，擬南芥可不斷從培養液中吸取豐富的營養，所以植株開花時間較長，所得種子量大約比土培多20%。根在黑暗的環境中生長，可有效防止緑藻污染。
權利要求
1.一種有效防止綠藻產生的擬南芥水培方法，包括以下步驟1)育苗將消毒、春化的種子播種于組培瓶內的1/2 MS固體培養基上，培養12 18天得幼苗；2)轉苗將I)所得幼苗轉至打有一孔的3飛平方厘米的小KT板上，使根穿過孔進入培養液，馴化培養5 7天；3)自制培養裝置，將培養盤用5%。 10%。次氯酸鈉消毒f 2小時，剪取比培養盤略小的KT板，在KT板上挖寬約I. 5厘米，兩端約短于KT板各2厘米的長方形小槽，根據KT板大小，每隔5^8厘米挖ー小槽，在培養盤內裝入適量的1/2 Hoagland培養液，再把上述KT板放入培養盤內，用錫箔紙封住培養裝置；4)幼苗培養將2)所得帶小KT板的苗轉到3)自制培養裝置上，并使擬南芥根通過錫箔紙和培養裝置浸入培養液中。
2.根據權利要求I所述的有效防止綠藻產生的擬南芥水培方法，其特征是所述步驟2)小KT板上的孔采用打孔器制作。
3.根據權利要求I所述的有效防止綠藻產生的擬南芥水培方法，其特征是所述步驟2)利用洗瓶擠壓出的水流帶動根穿過孔，從而有效防止根損傷。
4.根據權利要求I所述的有效防止綠藻產生的擬南芥水培方法，其特征是所述步驟2)和3)的KT板質輕，可使小苗始終浮于培養液之上。
5.根據權利要求I所述的有效防止綠藻產生的擬南芥水培方法，其特征是所述步驟3)的培養盤為不透光、高約5 10厘米的方形或長方形水果盤。
6.根據權利要求I所述的有效防止綠藻產生的擬南芥水培方法，其特征是所述步驟3)和4)用不透光的培養盤與錫箔紙組成ー個黑暗的空間，使該空間中的培養液和根接觸不到光照，從而有效防止需光才能生長的綠藻在培養液和根上滋生。
7.根據權利要求I所述的有效防止綠藻產生的擬南芥水培方法，其特征是所述步驟4)每隔6、天更換一次培養液，每2 3天給培養液充空氣一次，以保證根部有充足的氧氣。
8.根據權利要求I所述的有效防止綠藻產生的擬南芥水培方法，其特征是所述步驟4)可根據研究的內容，適當調整培養液中的組分，如研究重金屬對擬南芥的影響，可在培養液中添加不同濃度的重金屬。
全文摘要
本發明提供一種有效防止綠藻產生的擬南芥水培方法。該方法包括以下步驟1)育苗將消毒、春化的種子播種于組培瓶內的1/2MS固體培養基上，培養12~18天得幼苗；2)轉苗將1)所得幼苗轉至打有一孔的3~5平方厘米的小KT板上，使根穿過孔進入培養液，馴化培養5~7天；3)自制培養裝置，將其消毒，并用錫箔紙封住培養裝置；4)幼苗培養將2)所得帶小KT板的幼苗轉到3)自制培養裝置上，并使擬南芥根通過錫箔紙和培養裝置浸入培養液中，每隔6~9天更換一次培養液，每2~3天為培養液通氣一次，以保證根部有充足的氧氣。上述培養方法簡單易行，擬南芥生長良好，可有效防止綠藻污染。
文檔編號A01H4/00GK102696463SQ201210185028
公開日2012年10月3日 申請日期2012年6月7日 優先權日2012年6月7日
發明者劉東武, 徐恒戩, 王學 申請人:山東理工大學