高蛋白沙漠綠藻的工業化培養方法
【專利摘要】本發明涉及微生物藻類的培養方法，是一種高蛋白沙漠綠藻的工業化培養方法，該方法按下述步驟進行：第一步，分離出沙漠綠藻培養物；第二步，將單個沙漠綠藻落接種在固體平板上重復培養直至接種8代至10代，得藻體；第三步，將藻體接種到液體培養基中，工業化密閉培養3天至15天。本發明先對沙漠綠藻進行培養，提高沙漠土壤培養液中細胞濃度，獲得目的藻種生物量高的目的藻種沙漠土壤培養液后再進行分離目的藻種，然后進行純化獲得高產的目的藻種后，最后進行大規模的工業化培養，這樣能保證成功分離目的藻株，并且本發明采用的培養方法為全無菌培養，不會受到污染源及有害菌的污染，在保證沙漠綠藻產量的情況下，能夠大規模培養沙漠綠藻。
【專利說明】高蛋白沙漠綠藻的工業化培養方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及微生物藻類的培養方法，是一種高蛋白沙漠綠藻的工業化培養方法。【背景技術】
[0002]藻類(Algae)是植物界中有光合作用色素的一類自養原植體植物，既沒有葉子，種子或根，也沒有花。有些藻類極小，只有幾微米，但有些是很大的，很復雜的組織，像寬大的飄帶，例如海帶。藻類用孢子進行繁殖，形態各異，大小不一，大多是距今20億年以上的原始植物。大部分的藻類從遠古時期就存在，至今仍存在。藻類的適應性很強，即便在極端惡劣的氣候條件下(如在咸鹽或冰海地區)，它們也能存活。
[0003]眾所周知，蛋白質飼料是指自然含水率低于45%，干物質中粗纖維又低于18%，而干物質中粗蛋白質含量達到或超過20%的豆類、餅柏類、魚粉等均劃歸蛋白質飼料。在飼料中的所含氮化合物叫做“粗蛋白質”，并不是完全意義上的蛋白質，還含有其他復雜的蛋白質、多肽、氨基酸、酰胺、硝酸鹽等等，飼料工業上所有的蛋白質飼料幾乎都是成熟了的籽實以及籽實的加工產物，它們的含氮化合物主要是蛋白質。蛋白質飼料的另一個制約條件是粗纖維含量在18%以下，就意味著蛋白質飼料含有相當高的可利用能量。
[0004]按照主要來源不同，蛋白質飼料可分為植物性蛋白飼料、動物性蛋白飼料、單細胞蛋白飼料和非蛋白氮飼料四大類。單細胞生物蛋白質飼料主要包括一些微生物或單細胞藻類。
[0005]塔克拉瑪干沙漠綠藻作為極端環境微藻，所分離得到的綠藻作為極端環境微藻，在幾十萬年的進化中必然會積累出其它綠藻所沒有的獨特的生理生化及藥理特性。塔克拉瑪干沙漠綠藻細胞蛋白質含量平均為59.23%，具有作為蛋白質飼料開發的潛力，但是目前沒有一套成熟完善的進行分離培養沙漠綠藻的工藝方法，傳統的10倍稀釋法的分離原理是分離后進行培養，但是此方法中，目的藻種在沙漠土樣中的生物量很低，不能保證成功分離目的藻種以及保證目的藻種的生長，同時，在現有的沙漠綠藻培養方法中，現有的培養方法為開放式培養，很容易受到污染源及有害菌的污染。
【發明內容】
[0006]本發明提供了一種高蛋白沙漠綠藻的工業化培養方法，克服了上述現有技術之不足，其能有效解決現有的沙漠綠藻培養方法分離培養方法不穩定以及培養沙漠綠藻產量低的問題。
[0007]本發明的技術方案是通過以下措施來實現的:一種高蛋白沙漠綠藻的工業化培養方法，按下述步驟進行:第一步，分離，稱取沙漠土壤樣品，按每50g至100g沙漠土壤樣品中加入200ml至400ml的TAP液體培養基計，向沙漠土壤樣品中加入TAP液體培養基，在轉速為IOOrpm至120rpm條件下用搖床搖5 min至15min,使樣品與培養基充分混合,將混合物在溫度為25°C至31°C、光照為2000Lux至3000Lux條件下培養3天至15天，等培養物上清液變綠后，按每200 μ L至300 μ L上清液涂布在25ml至30ml TAP固體培養基上計，在無菌條件下吸取上清液，涂布在含有TAP固體培養基的培養皿中，并在溫度為25°C至31°C、光照為2000Lux至3000Lux條件下培養3天至15天得到沙漠綠藻培養物；
第二步，純化，按每單個沙漠綠藻落接種在25ml至30mlTAP固體培養基上計，用已滅過菌的接種環在沙漠綠藻培養物中挑取單個沙漠綠藻落，劃線法接種在含有TAP固體培養基的固體平板上，在溫度為25°C至31°C、光照為2000Lux至3000Lux條件下培養3天至15天得到一代沙漠綠藻藻體，再用已滅過菌的接種環在一代沙漠綠藻藻體中挑取單個沙漠綠藻落接種在含有新的TAP固體培養基的固體平板上，在溫度為25°C至31°C、光照為2000Lux至3000LUX條件下培養3天至15天得到二代沙漠綠藻藻體，重復直至接種8代至10代，最后得到純沙漠綠藻藻體；
第三步，工業化培養，按每個單藻落接種到100ml至500ml TAP液體培養基上計，在純沙漠綠藻藻體中挑取單藻落，接種到TAP液體培養基中，在溫度為25°C至31 °C、光照為2000Lux至4000 Lux條件下進行密閉培養3天至15天制備得到生物量達到IO11個細胞/ml至IO12個細胞/ml的沙漠綠藻母種子懸浮液，按每50L至500L TAP液體培養基中接入1%至3%體積的沙漠綠藻母種子懸浮液計，向新的TAP液體培養基中接入沙漠綠藻母種子懸浮液，在溫度為25°C至31°C、光照為2000Lux至4000Lux條件下進行工業化密閉培養3天至15天。
[0008]下面是對上述發明技術方案的進一步優化或/和改進:
上述 TAP 液體培養基為 0.4gNH4Cl、0.156gMgS04、0.05gCaCl2.Η20、0.142gK2HP0.3Η20、
2.42gTris Base、1.5mlHCl、l.0ml 冰乙酸、2g CH3COONa.3H20 和 Iml 微量元素溶于水配制成IL的溶液得到TAP液體培養 基，該TAP液體培養基的PH范圍為6.8至7.0。
[0009]上述TAP固體培養基按下述方法得到:將0.4gNH4Cl、0.156gMgS04、0.05gCaCl2.Η20、0.142gK2HP0.3Η20、2.42gTris Base、1.5mlHCl、1.0ml 冰乙酸、2gCH3COONa.3Η20和Iml微量元素溶于水配制成IL的溶液，向該溶液中加入溶液總體積1.8%至2%的瓊脂粉，并將該溶液的PH范圍調節到6.8至7.0，將該溶液在溫度為121°C、壓力為
0.1lMPa進行高壓濕熱滅菌20min后，在40°C下冷卻并凝固，使其成為固體狀態即得到TAP固體培養基。
[0010]上述沙漠土壤樣品為塔克拉瑪干沙漠中采集過來的沙漠土壤樣品。
[0011]本發明先對沙漠綠藻進行培養，提高沙漠土壤培養液中細胞濃度，獲得目的藻種生物量高的目的藻種沙漠土壤培養液后再進行分離目的藻種，然后進行純化獲得高產的目的藻種后，最后進行大規模的工業化培養，這樣能保證成功分離目的藻株，并且本發明采用的培養方法為全無菌培養，不會受到污染源及有害菌的污染，在保證沙漠綠藻產量的情況下，能夠大規模培養沙漠綠藻。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0012]附圖1為本發明中沙漠綠藻sp.HTL-10的光學顯微鏡圖。
[0013]附圖2為本發明中沙漠綠藻泛7<3?_70^0/7<35.寧HTL-10的掃描電鏡圖。
[0014]附圖3為本發明中沙漠綠藻麗瓜as sp.HTL-10在GENEBANK上注冊號為FJ888523.1基因序列。【具體實施方式】
[0015]本發明不受下述實施例的限制，可根據本發明的技術方案與實際情況來確定具體的實施方式。本發明中所提到的水，除特別指明外，均為去離子水。
[0016]下面結合實施例對本發明作進一步描述:
實施例1，該高蛋白沙漠綠藻的工業化培養方法按下述步驟進行:第一步，分離，稱取沙漠土壤樣品，按每50g至100g沙漠土壤樣品中加入200ml至400ml的TAP液體培養基計，向沙漠土壤樣品中加入TAP液體培養基,在轉速為IOOrpm至120rpm條件下用搖床搖5min至15min，使樣品與培養基充分混合，將混合物在溫度為25°C至31°C、光照為2000Lux至3000Lux條件下培養3天至15天,等培養物上清液變綠后,按每200 μ L至300 μ L上清液涂布在25ml至30ml TAP固體培養基上計，在無菌條件下吸取上清液，涂布在含有TAP固體培養基的培養皿中，并在溫度為25°C至31°C、光照為2000Lux至3000Lux條件下培養3天至15天得到沙漠綠藻培養物；
第二步，純化，按每單個沙漠綠藻落接種在25ml至30mlTAP固體培養基上計，用已滅過菌的接種環在沙漠綠藻培養物中挑取單個沙漠綠藻落，劃線法接種在含有TAP固體培養基的固體平板上，在溫度為25°C至31°C、光照為2000Lux至3000Lux條件下培養3天至15天得到一代沙漠綠藻藻體，再用已滅過菌的接種環在一代沙漠綠藻藻體中挑取單個沙漠綠藻落接種在含有新的TAP固體培養基的固體平板上，在溫度為25°C至31°C、光照為2000Lux至3000LUX條件下培養3天至15天得到二代沙漠綠藻藻體，重復直至接種8代至10代，最后得到純沙漠綠藻藻體；
第三步，工業化培養，按每個單藻落接種到100ml至500ml TAP液體培養基上計，在純沙漠綠藻藻體中挑取單藻 落，接種到TAP液體培養基中，在溫度為25°C至31 °C、光照為2000Lux至4000 Lux條件下進行密閉培養3天至15天制備得到生物量達到IO11個細胞/ml至IO12個細胞/ml的沙漠綠藻母種子懸浮液，按每50L至500L TAP液體培養基中接入1%至3%體積的沙漠綠藻母種子懸浮液計，向新的TAP液體培養基中接入沙漠綠藻母種子懸浮液，在溫度為25°C至31°C、光照為2000Lux至4000Lux條件下進行工業化密閉培養3天至15天。
[0017]實施例2，該高蛋白沙漠綠藻的工業化培養方法按下述步驟進行:第一步，分離，稱取沙漠土壤樣品，按每50g或100g沙漠土壤樣品中加入200ml或400ml的TAP液體培養基計，向沙漠土壤樣品中加入TAP液體培養基,在轉速為IOOrpm或120rpm條件下用搖床搖5 min或15min，使樣品與培養基充分混合，將混合物在溫度為25°C或31°C、光照為2000Lux或3000Lux條件下培養3天或15天，等培養物上清液變綠后，按每200 μ L或300 μ L上清液涂布在25ml或30ml TAP固體培養基上計，在無菌條件下吸取上清液，涂布在含有TAP固體培養基的培養皿中，并在溫度為25°C或31°C、光照為2000Lux或3000Lux條件下培養3天或15天得到沙漠綠藻培養物；
第二步，純化，按每單個沙漠綠藻落接種在25ml或30mlTAP固體培養基上計，用已滅過菌的接種環在沙漠綠藻培養物中挑取單個沙漠綠藻落，劃線法接種在含有TAP固體培養基的固體平板上，在溫度為25°C或31°C、光照為2000Lux或3000Lux條件下培養3天或15天得到一代沙漠綠藻藻體，再用已滅過菌的接種環在一代沙漠綠藻藻體中挑取單個沙漠綠藻落接種在含有新的TAP固體培養基的固體平板上，在溫度為25°C或31°C、光照為2000Lux或3000Lux條件下培養3天或15天得到二代沙漠綠藻藻體，重復直至接種8代或10代，最后得到純沙漠綠藻藻體；
第三步，工業化培養，按每個單藻落接種到100ml或500ml TAP液體培養基上計，在純沙漠綠藻藻體中挑取單藻落，接種到TAP液體培養基中，在溫度為25°C或31 °C、光照為2000Lux或4000 Lux條件下進行密閉培養3天或15天制備得到生物量達到IO11個細胞/ml或IO12個細胞/ml的沙漠綠藻母種子懸浮液，按每50L或500L TAP液體培養基中接入1%或3%體積的沙漠綠藻母種子懸浮液計，向新的TAP液體培養基中接入沙漠綠藻母種子懸浮液，在溫度為25°C或31°C、光照為2000LUX或4000Lux條件下進行工業化密閉培養3天或15天。
[0018]實施例3，作為上述實施例的優選，TAP液體培養基為0.4gNH4Cl、0.156gMgS04、
0.05gCaCl2.Η20、0.142gK2HP0.3Η20、2.42gTris Base、1.5mlHCl、1.0ml 冰乙酸、2gCH3COONa.3H20和Iml微量元素溶于水配制成IL的溶液得到TAP液體培養基，該TAP液體培養基的PH范圍為6.8至7.0。
[0019]實施例4，作為上述實施例的優選，TAP固體培養基按下述方法得到:將
0.4gNH4Cl、0.156gMgS04、0.05gCaCl2.H2O,0.142gK2HP0.3Η20、2.42gTris Base、1.5mlHCl、
1.0ml冰乙酸、2g CH3COONa.3H20和Iml微量元素溶于水配制成IL的溶液，向該溶液中加入溶液總體積1.8%至2%的瓊脂粉，并將該溶液的PH范圍調節到6.8至7.0，將該溶液在溫度為121°C、壓力為0.1lMPa進行高壓濕熱滅菌20min后，在40°C下冷卻并凝固，使其成為固體狀態即得到TAP固體培養基。
[0020]實施例5，作為上述實施例的優選，上述沙漠土壤樣品為塔克拉瑪干沙漠中采集過來的沙漠土壤樣品。
[0021]本發明先對沙漠綠藻進行培養，提高沙漠土壤培養液中細胞濃度，獲得目的藻種生物量為IO11個細胞/ml至IO12個細胞/ml的目的藻種沙漠土壤培養液后再進行分離目的藻種，然后進行純化獲得高產的目的藻種后，最后進行大規模的工業化培養，這樣能保證成功分離目的藻株，并且本發明采用的培養方法為全無菌培養，不會受到污染源及有害菌的污染，在保證沙漠綠藻產量的情況下，能夠大規模培養沙漠綠藻。
[0022]在本發明上述實施例中提到的沙漠綠藻屬于衣藻(Chlamydomonas )屬的潛在新種，該沙漠綠藻命名為Chlamydomonas sp.HTL-10,并已進行分子鑒定，發明中沙漠綠藻Chlamydomonas sp.HTL-10的光學顯微鏡圖如附圖1所示，本發明中沙漠綠藻Chlamydomonas sp.HTL-10 的掃描電鏡圖如附圖 2 所不，sp.HTL-10的ITS-DNA序列(如附圖3所示)被注冊在美國國際核酸數據庫中(GENBANK)注冊號FJ888523.1，便于永久保存；采用硫氨酸硫酸銨沉淀(鹽析)法提取該沙漠綠藻的總蛋白質，通過Bradford法蛋白定量試劑盒法所測定出本發明中沙漠綠藻Chlamydomonas sp.HTL-10的細胞蛋白含量平均為59.23%。
[0023]以上技術特征構成了本發明的最佳實施例，其具有較強的適應性和最佳實施效果，可根據實際需要增減非必要的技術特征，來滿足不同情況的需求。
【權利要求】
1.一種高蛋白沙漠綠藻的工業化培養方法，其特征在于按下述步驟進行:第一步，分離，稱取沙漠土壤樣品，按每50g至100g沙漠土壤樣品中加入200ml至400ml的TAP液體培養基計，向沙漠土壤樣品中加入TAP液體培養基,在轉速為IOOrpm至120rpm條件下用搖床搖5 min至15min，使樣品與培養基充分混合，將混合物在溫度為25°C至31°C、光照為2000Lux至3000Lux條件下培養3天至15天，等培養物上清液變綠后，按每200 μ L至300 μ L上清液涂布在25ml至30ml TAP固體培養基上計，在無菌條件下吸取上清液，涂布在含有TAP固體培養基的培養皿中，并在溫度為25°C至31°C、光照為2000Lux至3000Lux條件下培養3天至15天得到沙漠綠藻培養物； 第二步，純化，按每單個沙漠綠藻落接種在25ml至30mlTAP固體培養基上計，用已滅過菌的接種環在沙漠綠藻培養物中挑取單個沙漠綠藻落，劃線法接種在含有TAP固體培養基的固體平板上，在溫度為25°C至31°C、光照為2000Lux至3000Lux條件下培養3天至15天得到一代沙漠綠藻藻體，再用已滅過菌的接種環在一代沙漠綠藻藻體中挑取單個沙漠綠藻落接種在含有新的TAP固體培養基的固體平板上，在溫度為25°C至31°C、光照為2000Lux至3000LUX條件下培養3天至15天得到二代沙漠綠藻藻體，重復直至接種8代至10代，最后得到純沙漠綠藻藻體； 第三步，工業化培養，按每個單藻落接種到100ml至500ml TAP液體培養基上計，在純沙漠綠藻藻體中挑取單藻落，接種到TAP液體培養基中，在溫度為25°C至31 °C、光照為2000Lux至4000 Lux條件下進行密閉培養3天至15天制備得到生物量達到IO11個細胞/ml至IO12個細胞/ml的沙漠綠藻母種子懸浮液，按每50L至500L TAP液體培養基中接入1%至3%體積的沙漠綠藻母種子懸浮液計，向新的TAP液體培養基中接入沙漠綠藻母種子懸浮液，在溫度為25°C至31°C、光照為2000Lux至4000Lux條件下進行工業化密閉培養3天至15天。
2.根據權 利要求1所述的高蛋白沙漠綠藻的工業化培養方法，其特征在于TAP液體培養基為 0.4gNH4Cl、0.156gMgS04、0.05gCaCl2.H2O,0.142gK2HP0.3Η20、2.42gTris Base、1.5mlHCl、l.0ml冰乙酸、2g CH3COONa.3H20和Iml微量元素溶于水配制成IL的溶液得到TAP液體培養基，該TAP液體培養基的PH范圍為6.8至7.0。
3.根據權利要求1或2所述的高蛋白沙漠綠藻的工業化培養方法，其特征在于TAP固體培養基按下述方法得到:將0.4gNH4Cl、0.156gMgS04、0.05gCaCl2.H2O,0.142gK2HP0.3Η20、2.42gTris Base、1.5mlHCl、l.0ml 冰乙酸、2g CH3COONa.3H20 和 Iml 微量元素溶于水配制成IL的溶液，向該溶液中加入溶液總體積1.8%至2%的瓊脂粉，并將該溶液的PH范圍調節到6.8至7.0，將該溶液在溫度為121°C、壓力為0.1lMPa進行高壓濕熱滅菌20min后，在40°C下冷卻并凝固，使其成為固體狀態即得到TAP固體培養基。
4.根據權利要求1或2所述的高蛋白沙漠綠藻的工業化培養方法，其特征在于沙漠土壤樣品為塔克拉瑪干沙漠中采集過來的沙漠土壤樣品。
5.根據權利要求3所述的高蛋白沙漠綠藻的工業化培養方法，其特征在于沙漠土壤樣品為塔克拉瑪干沙漠中采集過來的沙漠土壤樣品。
【文檔編號】C12N1/12GK103540534SQ201310453181
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2013年9月29日 優先權日:2013年9月29日
【發明者】艾山江, 阿不都克力木白克爾, 古麗山買買提 申請人:新疆葉希麗生物科技有限公司