專利名稱：枳轉錄因子PtrbHLH及在提高植物抗寒中的應用的制作方法
技術領域：
本專利屬于植物基因工程領域。具體涉及一種從積(Poncirus trifoliata)中分離、克隆的一個bHLH (basic helix-loop-helix,堿性螺旋-環-螺旋)家族轉錄因子PtrbHLH,還涉及一種轉錄因子PtrbHLH在提高植物抗寒中的應用。
背景技術：
植物經常遭受一系列的環境脅迫，包括干旱、高溫、低溫、鹽堿、淹水等，其中，低溫是影響作物生長發育和產量及限制植物地理分布最為重要的因素之一。在漫長的進化過程中，植物已經形成一套復雜的機制來適應和生存非生物逆境。近二十年來，國內外科學家在對植物響應非生物逆境分子機制解析方面已經取得了很大的進步(Qin et al.，2011)。現 在清楚的是，植物逆境響應是一個非常復雜的多個信號途徑的過程。外界脅迫信號由已知或未知的傳感元件識別，激活第二信使(如鈣離子，活性氧和肌醇磷酸鹽)。之后，由不同的信號元件轉導、傳達、放大脅迫信號，最終導致一系列的生理和代謝改變。人們在鑒定參與逆境響應答的信號轉導元件中已經取得了巨大的進步。大量的證據表明，復雜的逆境信號傳導途徑包括了大量的逆境響應基因，根據基因產物的功能大體上可以分為兩類。第一類是由直接保護細胞免受損傷的功能蛋白組成，第二類是由在信號轉導和基因表達起調控作用的調節蛋白組成(Agarwal etal. , 2006;Chinnusamy et al. ,2006;Shinozaki and Yamaguchi-Shinozaki 2007;Lataand Prasad, 2011)。對逆境響應基因的研究不僅能夠了解逆境響應機制，而且也使得人們通過轉基因創造抗性增強的轉基因植物(Wang et al. , 2003; Qin et al. , 2011; Lata andPrasad, 2011)。大量研究表明，通過過量表達功能基因和調控基因能夠顯著提高植物的抗逆性。但是，功能基因和轉錄因子在組成性表達的結果可能不同(Agarwal et al.，2006)。與功能基因相比，轉錄因子在提高植物的抗性功能更強大。一個轉錄因子的超表達能夠激活一系列的靶基因，它們可以會一起在應對逆境上起作用，而不是一個轉入的功能基因起作用。因此，轉錄因子遺傳轉化是植物抗性遺傳改良的一種重要途徑和手段。植物基因組擁有大量的轉錄因子；例如，擬南芥中有多于1500個轉錄因子，占它的基因組將近 6%(Riechmann et al.，2000),其中 bHLH(basic helix-loop-helix,喊性螺旋-環-螺旋)類轉錄因子是調控網絡中重要的成員，該家族蛋白具有bHLH域，HLH區域位于b HLH模體的C端，由約60個氨基酸組成的兩個功能明顯不同bHLH模體組成。HLH模體參與同型二聚體或異質二聚體的形成是由于α -螺旋的相互作用。堿性區域位于bHLH模體的N端,含有大約15個堿性氨基酸,它決定著DNA和蛋白互作的特異性(Buck and Atchley,2003; Toledo-Ortiz et al. , 2003; Li et al.，2006)。bHLH 轉錄因子在真核生物中廣泛分布，如在擬南芥和水稻中分別有147和167個基因(Li et al.，2006 ；ToIedo-Ortiz etal.，2003)。在動物中，bHLH家族成員的功能已經被廣泛研究，但在植物中的研究相對較少。自第一個植物bHLH蛋白(Lc)在玉米中被報道(Ludwig et al.，1989)以來，在一些植物中鑒定了部分bHLH轉錄因子。已經表明，植物bHLH蛋白在不同的生物學過程起轉錄調控作用，包括皮毛或根毛發育(Berhardt et al. , 2003; Tominaga-ffada et al. , 2012;Karasetal.，2009)、葉綠體發育(Monte et al.，2004),類黃酮生物堿和花青素合成(Nesi etal. , 2000; Yamada et al.，2011)。一些bHLH蛋白，諸如PIF3 (光敏色素相互作用因子3)、PIF4 及 HFRl 參與光誘導的信號轉導(Ni et al. , 1998;Huq and Quail, 2002;Fairchildet al.，2000)。然而，植物bHLH轉錄因子在環境脅迫應答方面卻不多。目前，研究得最為清楚的逆境應答bHLH轉錄因子是ICEl (inducer of CBF expression 1)，它編碼一個MYC類似的轉錄因子，它通過調控CBF3啟動子中的順式作用元件來提高植物的抗寒能力(Chinnusamy et al.，2003)。之后，鑒定了 2個與ICEl有較高同源性的bHLH基因，即擬南芥ICE2 及蘋果 MdCibHLHKFursova et al. , 2009;Feng et al.，2012)。其它與脅迫應答有關的bHLH轉錄因子包括AtbHLH38、AtbHLH39、FIT，它們能被缺鐵所誘導，AtbHLH38、AtbHLH39的過量表達能增強植物對鐵或鎘的吸收(Yuan et al. , 2008; Lignam et al. , 2011 ；ffuetal.，2012)，表明它們在重金屬毒害應答中起作用。此外，水稻的一個bHLH基因也被發現參與干旱脅迫應答(Seo et al.，2011)。所有這些研究表明，bHLH轉錄因子在非生物逆境響應中發揮著重要作用，在利用基因工程提高植物抗逆性方面有很大的潛力。
發明內容
本發明目的是提供了一種從極抗寒的積(Poncirus trifoliata)中分離、克隆出的一個bHLH類轉錄因子(申請人將其命名為PtrbHLH)，其核苷酸序列為SEQ ID NO. I所示。本發明的另一個目的是提供了一種bHLH類轉錄因子PtrbHLH在提高植物抗寒中的應用，通過農桿菌介導的遺傳轉化將其導入煙草和檸檬，鑒定其抗寒功能，為植物抗逆分子設計育種提供新的基因資源，為實施綠色農業、節水農業提供新的遺傳資源，該遺傳資源的開發利用有利于降低農業生產成本和實現環境友好。為了達到以上目的，本發明采用以下技術手段以bHLH為關鍵詞搜索柑橘EST數據庫(HarvEST =Citrus ver. 0. 51)，搜索到17個和bHLH高度同源的EST序列，利用其重疊部分進行拼接，利用拼接軟件DNAstart將其拼接成一條序列，序列分析發現拼接后的序列包括一個完整的ORF閱讀框，根據這條拼接好的序列作為一個參考序列，設計引物在枳上擴增出基因PtrbHLH，其核苷酸序列為SEQ IDNO I所示，在SEQ ID NO 1所示序列的253-1824bp處為該基因的編碼區；其編碼的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO :2所示，它包含1464bp的開放閱讀框，編碼487個氨基酸，等電點為
5.3，預測的分子量為53. 6kD。申請人:設計了克隆上述的基因PtrbHLH的cDNA序列的引物對，其核苷酸序列如下所示正向引物5，-TTGTCGACGCAGCGAGTAAAGTATGGCCAATGG-3，；反向引物5’ -ATGGTACCGGATCCATGATACCATTACCCTACCAC-3，。利用農桿菌介導的遺傳轉化方法轉化煙草和檸檬，獲得的轉基因植株經生物學功能驗證，表明本發明所克隆的PtrbHLH基因具有提高抗寒性的功能。在本發明的實施例部分，我們闡述了枳PtrbHLH轉錄因子的分離、功能驗證和應用。與現有技術相比，本發明具有以下優點本發明利用轉基因技術得到抗寒性提高的植株，突破了傳統育種手段的障礙；此外，本發明的基因在多種植物中抗性穩定，為植物抗寒基因工程提供了重要的基因資源。
圖I為一種本發明的技術流程圖。圖2為一種PtrbHLH基因在低溫、鹽脅迫和脫水迫下的表達。其中圖2A是枳田間苗(未轉基因)在4°C處理下，相應時間點取樣，采用實時定量PCR分析本發明基因的相對表達量；圖2B是枳田間苗(未轉基因)在200mM氯化鈉處理下，相應時間點取樣，采用實時定量PCR分析本發明基因的相對表達量；圖2C是枳田間苗(未轉基因)室溫下脫水不同時間點下本發明基因的表達模式。圖3為一種PtrbHLH基因亞細胞定位示意圖。圖3A，GFP基因(對照)在明場(圖左)、暗場(中)下的成像，右圖為二者疊加后的成 像；圖3B，PtrbHLH基因在明場(左)、暗場(中)下的成像，右圖為二者疊加后的成像。圖4為一種PtrbHLH基因轉錄激活鑒定示意圖。圖4A是空載體(pDEST 32)轉化的酵母在不同培養基上的生長情況；圖4B是融合載體PtrbHLH轉化的酵母在不同培養基上的生長情況。圖5為一種PtrbHLH基因載體構建示意圖。圖6為一種PtrbHLH基因轉化檸檬過程示意圖。左上為共培養的莖段，右上為在篩選培養基上長出抗性芽，左下為芽伸長培養基上的叢芽，右下為生根培養苗。圖7為一種PtrbHLH基因轉化煙草和檸檬再生植株PCR鑒定示意圖。圖7APtrbHLH轉化煙草后得到的再生植株PCR鑒定圖(左為NPTII基因特異引物PCR擴增圖，右為35S正向引物和PtrbHLH特異引物PCR擴增圖)。圖7B是PtrbHLH轉化檸檬后得到的再生植株利用NPTII基因特異引物PCR擴增圖。圖7C是PtrbHLH轉化檸檬后得到的再生植株利用35S正向引物和PtrbHLH特異引物PCR擴增圖。圖8為一種鑒定陽性轉基因植株中轉基因PtrbHLH的表達量分析示意圖。圖8A為轉基因煙草PtrbHLH的表達量分析，圖8B是轉基因檸檬PtrbHLH的過量表達分析。圖9為一種30天大小的PtrbHLH轉基因煙草苗(0E8和OElO兩個系)與野生型抗寒性比較及成活率統計示意圖。圖9A (左)是轉基因煙草和對照低溫處理前的表型-M (中)是0°C處理23小時后的表型；9A (右)是0°C處理23小時并在25°C下恢復10天后的表型。圖9B是煙草轉基因系和野生型0°C處理23小時并在25°C下恢復10天后的成活率。圖10為一種60天大小的PtrbHLH轉基因煙草苗(0E8和OElO兩個系)與野生型抗寒性比較示意圖。左圖(上)是PtrbHLH基因轉化煙草和野生型在低溫處理前；(中)0°C處理23小時后的表型；(下)25°C恢復生長5天后的表型。右圖是另一組重復。圖11為一種30天大小的PtrbHLH轉基因煙草苗(0E8和OElO兩個系)與野生型(TC處理23小時后細胞壞死染色、電導率測定示意圖。圖IlA是細胞壞死染色；圖IlB是電導率測定。圖12為一種PtrbHLH轉基因檸檬(#2和#8)與野生型抗寒性比較示意圖。
(上)野生型和兩個轉基因系低溫處理前的表型；(中)是0°C處理48小時轉入_3°C處理2小時后的表型；(下)是25°C恢復生長5天的表型。圖13為一種轉基因檸檬與野生型低溫0°C處理48h小時轉入_3°C處理2小時的電導率測定及細胞壞死染色示意圖。圖13A電導率測定；圖13B細胞壞死染色。圖14為一種PtrbHLH轉基因煙草和檸檬及對應的野生型在低溫處理后的DAB染色示意圖。指示H2O2含量，染色越深表明H2O2越多；圖14A顯示轉基因煙草(0E8和0E10)和野生型在低溫處理后的DAB染色；圖14B顯示轉基因檸檬(#2和#8)和野生型在低溫處理后的DAB染色。
具體實施例方式以下結合具體實施對本發明做出詳細的描述。根據以下的描述和這些實施，本領域技術人員可以確定本發明的基本特征，并且在不偏離本發明精神和范圍的情況下，可以對本發明做出各種改變和修改，以使其適用各種用途和條件。實施例I PtrbHLH基因分離克隆及表達分析以bHLH為關鍵詞搜索柑橘EST數據庫(HarvEST =Citrus ver. O. 51)，搜索到17個和bHLH高度同源的EST序列，利用其重疊部分進行拼接，利用拼接軟件DNAstart將其拼接成一條序列,序列分析發現拼接后的序列包括一個完整的ORF閱讀框，根據這條拼接好的序列作為一個參考序列，設計引物在枳上擴增出基因PtrbHLH。使用Trizol試劑盒抽提積葉片4°C處理48小時的RNA (試劑盒購自Invitrogen公司，抽提按照提供的說明書操作)，將抽提的IugS RNA樣品經IU的DNaseI (購自Fermentas公司)室溫處理30分鐘后，加入I μ I EDTA (25mM),于65°C溫育10分鐘。用MBI反轉錄試劑盒合成第一鏈cDNA(貨號K1621，購自Fermentas公司，按照試劑盒說明書操作)，所得的第一鏈cDNA用于擴增PtrbHLH基因全長。50 μ I的反應體系中包括200ng cDNAUX緩沖液(TransStart FastPfu緩沖液)、10mM dNTPUU Taq聚合酶(前述緩沖液和聚合酶購自TRANS公司)及I. O μ M引物。正向引物5 ’ -TTGTCGACGCAGCGAGTAAAGTATGGCCAATGG-3 ’ ；反向引物5 ’ -ATGGTACCGGATCCATGATACCATTACCCTACCAC-3’。PCR反應在ABI 7500 (Applied Biosystem)擴增儀上按以下程序完成95°C I分鐘；95°C變性20秒、58°C退火20秒、72°C延伸60秒(共40個循環)；循環完成后72°C延伸5分鐘。產生一條PCR條帶產物，經1%的瓊脂糖凝膠電泳后，用E.Z.N.A t)NA凝膠回收試劑盒(購自Omega公司，美國)回收特異帶(提取步驟參照使用說明)。回收純化的DNA溶液與pMD18-T載體(購自寶生物工程大連有限公司，即TaKaRa公司)進行連接反應(按說明書操作)，連接反應體系中PtrbHLH基因與pMD18-T載體的摩爾比為3 :1，連接反應總體積是10 μ 1，包括5 μ I的2Χ緩沖液(購自寶生物工程大連有限公司)，4. 5 μ I純化的PCR產物和O. 5 μ I T載體。16 °C連接過夜。取10 μ I連接產物，熱激法轉化大腸桿菌DH5 α，在含有50mgL氨芐霉素的LB固體平板中篩選陽性克隆，挑取2_4個克隆測序。為分析PtrbHLH基因是否對脅迫有響應，采用實時定量PCR分析該基因在低溫、鹽 和脫水處理下的表達。結果表明，低溫(見圖2A)、鹽(見圖2B)和脫水處理(見圖2C)均能誘導該基因表達，表明它是一個逆境應答基因。實施例2PtrbHLH基因亞細胞定位、轉錄激活分析由于PtrbHLH基因有I個核定位信號(NLS)，本研究利用洋蔥表皮來研究PtrbHLH基因的亞細胞定位。利用RT-PCR擴增出PtrbHLH基因整個ORF (閱讀框)，并在其擴增引物兩端分別加上NcoI和SpeI兩個酶切位點。首先將擴增產物裝在pMD 18-T載體上，從而得到一個 PMD18-TN/s-PtrbHLH 重組載體。同時用 NcoI 和 SpeI 雙酶切 PMD18_TN/s-PtrPtrbHLH和pCAMBIA1302，回收產物并連接，從而得到pCAMBIA1302-PtrbHLH_GFP重組載體，并將其轉入農桿菌EHA105。農桿菌侵染洋蔥表皮按如下方法進行(I)劃平板，挑單克隆(含有重組質粒的農桿菌)于3毫升YEB培養基(含卡那霉素40 μ g/ml，利福平25mg/L)，28°C震蕩培養24小時,至OD6tltl約O. 6。(2)用手術刀將洋蔥內表皮劃成Icm2大小,撕下置于MS基本培養基(含3%蔗糖，O. 75%瓊脂，不含激素)上暗培養24小時。(3)按體積比為I :1000比例，接種50 μ I農桿菌菌液于50毫升YEB (含卡那霉素40 μ g/ml，利福平25 μ g/ml)中，28°C振蕩培養12-24小時。(4) 4000rpm，4°C離心10分鐘，棄上清。(5)加入50毫升YEB培養基(含有IOmM MgCl2)，將洋蔥表皮放入菌液中浸泡30分鐘。(6)吸干表面菌液，置于MS基 本培養基(含3%蔗糖，O. 75%瓊脂，不含激素)上28°C暗培養兩天。用Olympus BX61型顯微鏡觀察報告基因定位情況，結果表明，對照載體轉化時整個細胞中均有熒光(圖3A)，而重組載體轉化的細胞中熒光只能在核中檢測到(圖3B)，說明PtrbHLH是一個核定位蛋白。采用PCR擴增PtrbHLH基因ORF (擴增引物5’端和3’端分別加上EcoRI和XhoI兩個酶切位點)，擴增產物用EcoRI和XhoI消化后，回收并亞克隆到用EcoR I和XhoI消化的線性pENTR 3C (購自Invitrogen公司)載體上，得到融合載體pENTR 3C-PtrbHLH，再利用重組技術將pENTR 3C-PtrbHLH重組到pDEST 32表達載體上，從而得到融合表達載體pDEST 32-PtrbHLH。測序確認序列無誤后將融合表達載體及空載體(pDEST 32)分別轉化酵母菌株MV203 (購自invitrogen),然后在不同的缺失培養基上進行培養。結果發現,空載體轉化的酵母細胞只能在缺失培養基SD/-Trp上生長(圖4A)，在添加了不同濃度的3-AT缺失培養基SD/-Leu/-Trp/-His上完全被抑制，而融合載體轉化的酵母細胞能在缺失培養基SD/-Leu/-Trp/-His (含有不同濃度的3-AT)上正常生長(圖4B)，表明PtrbHLH具有轉錄激活活性。實施例3植物轉化超表達載體構建根據PMV載體的多克隆位點和PtrbHLH基因的編碼區序列上的酶切位點分析，選擇SalI和KpnI作為內切酶。首先將以PtrbHLH基因的克隆子為模板進行PCR擴增，再通過TA克隆連接到pMD18-T載體上，從而構建一個重組載體pMD18-T-PtrbHLH。雙酶切體系總體積為 40 μ 1，其中含有 pMD18-T-PtrbHLH 質粒 8μ 1、10ΧΜ 緩沖液(購自 Takana) 4 μ UKpnI及XhoI各2μ I、雙蒸水24 μ I。在37°C酶切3-4h后純化回收。pMV載體的雙酶切體系同上。連接反應體系中PtrbHLH基因與載體pMV分別為6 μ I和2 μ 1，反應總體積為10 μ 1，10ΧΤ4連接緩沖液I μ 1，Τ4連接酶I μ 1，16°C連接14-16小時。連接產物轉化大腸桿菌菌株DH5 α，在含有100mg/L卡那霉素的LB固體平板中篩選，挑單克隆PCR檢測呈陽性后抽提質粒進行酶切，測序確定讀碼框沒有突變后，即PMV-PtrbHLH重組載體構建成功。構建完成的載體圖見圖5。應用凍融法(參照薩姆布魯克，黃培堂譯，《分子克隆實驗指南》第三版，科學出版社，2002年)將重組載體導入到根癌農桿菌EHA105中并保菌。
實施例4煙草遺傳轉化根癌農桿菌介導的煙草遺傳轉化步驟如下I.根癌農桿菌培養取超低溫冰箱中保存的根癌農桿菌菌液，在添加了卡那霉素50mg/L的LB平板上劃線，刮取劃線菌斑，加入液體MS基本培養基中，28°C 180轉/分鐘振蕩培養，待菌液濃度達到0D_=0. 3-0. 8時作浸染。2.浸染取未轉基因的煙草葉片，切成O. 5cmX0. 5cm大小,然后放入制備好的根癌農桿菌菌液中，浸泡8-10分鐘，期間不斷振蕩。3.共培養取浸染后的煙草葉片，無菌濾紙吸干上面的的菌液，然后接種于共培養培養基上(葉背面向下)，25°C暗培養3天。4.篩選培養經共培養3天后的煙草葉片，用500mgL濃度的頭孢霉素溶液洗一遍，然后無菌水沖洗3-5次,再轉移入添加了 100mg/L卡那霉素和500mgL頭孢霉素的篩選
培養基中。5.生根培養待篩選培養基上的不定芽長到Icm左右時，切下并轉入添加了100mg/L Km和500mg/L Cef的生根培養基上。6.煙草苗轉入土培待生根后的轉化苗長滿培養瓶，由生根培養基中取出，用自來水洗凈轉化苗上的培養基，并栽植于滅菌的營養土中。煙草轉化苗所用培養基見表I。表I煙草轉化苗所用培養基配方
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丨工,!,JiifrU-OJ ing/L NAA^HlO nmL Km -5()0 rng^L Ccf7.陽性轉基因煙草初步確定按照上述方法得到轉PtrbHLH煙草抗性芽，提取DNA。方法如下設計引物NPTII和35S+基因內引物進行PCR擴增鑒定陽性苗。鑒定為可能的陽性植株移栽后獨立收獲種子(Tl代種子)，4°C春化處理3天，取O. Ig在I. 5ml的離心管中，先用70%酒精浸泡種子20秒，接著用滅菌雙蒸水洗一次，再加入Iml 2. 5%NaC10表面消毒7分鐘，充分振蕩，棄去NaClO后用滅菌雙蒸水洗3次,最后用接種針將滅好的種子播于50mg/l具有卡那霉素(Km)MS基本培養基的上，結果表明本發明獲得的抗性苗在抗性平板上能正常生長，為綠色，而非抗性苗則黃化死去。成活的植株移栽再收獲Tl代種子，T2代種子用于播種及抗性分析。實施例5朽1檬遺傳轉化I、取檸檬種子，用lmol/L的NaOH浸泡15分鐘后洗凈，再在超凈工作臺上用2%(體積比)的次氯酸鈉浸泡滅菌15-20min，無菌水洗滌3次再在無菌條件下剝去種皮，接種于MT固體培養基上，暗培養3-4周再光照培養3-5d用于轉化。2、農桿菌在含有卡那霉素50mg/L的固體LB培養基上劃線，28°C暗培養兩天；挑取單菌落接種在新的加有卡那霉素的LB平板上，28°C暗培養2-3天；用手術刀刮下已長好的農桿菌，接種在不加抗生素的液MT培養基中，同時加20mg/L (IOOuM) AS，28°C 200r/min振蕩培養2h (同時在這段時間準備切上胚軸)；用分光光度計測量菌液的OD6tltl值，用MT液體培養基調整OD6tltl值到O. 6-0. 8進行侵染。3、取實生苗上胚軸，于超凈工作臺斜切成1-1. 5cm長莖段，切好的莖段暫時放于滅菌的空三角瓶中(加少量水保濕)，待農桿菌菌液制備完成后用于轉化。4、將切好的外植體浸泡在已制備好的農桿菌菌液里，侵染20min，中間搖動幾次。侵染完后用無菌吸水紙吸干外植體表面菌液，再接種到共培養基上21-23°C暗處共培養3天。5、共培養3天后，用無菌水洗3-5次，再用無菌吸水紙吸干表面的農桿菌，轉到加有卡那霉素50mg/L及頭孢霉素400mg/L的篩選培養基上，25°C暗培養4周后再轉到光照條件下培養。在篩選培養基上長出抗性芽，當抗性芽>0. 5cm時，再轉到伸長培養基上促其伸長。待芽有I. 5cm長時，切下并轉入生根培養基誘導生根，檸檬轉化過程見圖6。 常用培養基配方LB固體培養基蛋白胨10g/l+酵母提取物5gl+NaCl IOgl+瓊脂15g/l檸檬生芽及伸長培養基MT+BA1. Omg/1 +瓊脂7. 5g/l+蔗糖35gl (pH為5. 8)檸檬生根培養基1/2MT+IBAO. lmg/1+NAA O. 5mg/l+ 活性炭 O. 5g/l+ 瓊脂 7. 5g/1+鹿糖 35g/l (pH 為 5. 8)實施例6轉化植株分子及生理鑒定I煙草及檸檬葉片DNA提取取適量的葉片放入I. 5mL離心管中，加液氮，充分研磨；然后加入700 μ I 65°C預熱的十六烷基三乙基溴化銨(簡稱CTAB) DNA提取緩沖液(配方100mM Tris-HCl, pH8. 0，
I.5M NaCl, 50mM EDTA, pH 8.0,1% (質量比)聚乙烯吡咯烷酮，2% (質量比)CTAB)，65°C溫浴60-90分鐘(溫浴過程中每15分鐘取出離心管上下輕輕顛倒混勻)；10000Xg離心10分鐘；取上清，加600 μ I氯仿，顛倒混勻靜置3分鐘；10000 Xg離心15分鐘；取上清450 μ 1，加入900μ I預冷無水乙醇，34μ I 5Μ NaCl，混勻后，冰凍30分鐘，10000 X g離心10分鐘；棄上清后，用Iml 75% (體積比)的乙醇，洗滌3次后，加適量雙蒸水溶解。2陽性轉基因植株PCR檢測采用引物NPTII和35S上游引物和基因右側內弓丨物進行PCR擴增。弓丨物序列、反應程序及體系分別見表2、表3和表4。首先采用NPTII引物對煙草再生植株進行PCR鑒定，發現6個轉基因株系均能擴增出NPTII基因的片段，利用35S上游引物和基因右側引物進行PCR，表明選取的5個轉基因株系擴增出預期大小的片段(圖7A)，表明它們為陽性轉基因株系。在檸檬鑒定中，采用NPTII引物對21個再生系進行PCR鑒定，發現13個轉基因株系能擴增出NPTII基因的片段(圖7B)，利用35S上游引物和基因右側引物對其中7個系進行PCR，均擴增出預期大小的片段(圖7C)，表明它們均是轉基因植株。表2、引物序列信息
權利要求
1.一種分離的基因，其特征在于其序列為SEQ ID NO. I所示。
2.—種權利要求I所述的基因在提高植物抗寒中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種枳轉錄因子PtrbHLH及在提高植物抗寒中的應用，以bHLH為關鍵詞搜索柑橘EST數據庫(HarvESTCitrusver.0.51)，搜索到17個和bHLH高度同源的EST序列，利用其重疊部分進行拼接，利用拼接軟件DNAstart將其拼接成一條序列，序列分析發現拼接后的序列包括一個完整的ORF閱讀框，根據這條拼接好的序列作為一個參考序列，設計引物在枳上擴增出基因PtrbHLH利用農桿菌介導的遺傳轉化方法轉化煙草和檸檬，獲得的轉基因植株經生物學功能驗證，表明本發明所克隆的PtrbHLH基因具有提高抗寒性的功能，突破了傳統育種手段的障礙；此外，本發明的基因在多種植物中抗性穩定，為植物抗寒基因工程提供了重要的基因資源。
文檔編號A01H5/00GK102719451SQ201210221920
公開日2012年10月10日 申請日期2012年6月29日 優先權日2012年6月29日
發明者劉繼紅, 黃小三 申請人:華中農業大學