專利名稱：一種適用于鮭魚類全雌二倍體育種的方法
技術領域：
本發明涉及適用于鮭魚類全雌二倍體育種的方法。
背景技術：
自從上個世紀末以來，國內曾有過關于鯉科魚類(鯉、鯽等)和虹鱒的三倍體誘導試驗報導，試驗方法是靜水壓力法或溫度(低溫、高溫)休克法誘導三倍體，但僅僅是試驗室規模的小型試驗，迄今尚無生產性試驗及投入生產的報導。鮭魚全雌二倍體的主要用途是制備性逆轉雄魚，因為全雌二倍體的制備是誘導性逆轉雄魚的前提條件，因此，必須解決全雌二倍體的制備方法。針對鮭魚類進行的染色體操 作僅有一家國內公司和日本一些相關科研單位實施過熱休克法誘導虹鱒魚三倍體的實驗。目前，對于鮭魚類全雌二倍體育種的方法國內尚無可與之相比較的技術實例。
發明內容
本發明是要解決現有不存在鮭魚類全雌二倍體育種方法的問題，而提出一種適用于鮭魚類全雌二倍體育種的方法。本發明中的一種適用于鮭魚類全雌二倍體育種的方法按以下步驟進行一、首先挑選體健成熟的鮭魚類雌魚和雄魚用人工方法分別采集魚卵和精液，將魚卵和精液放置于不同的燒杯中；二、用生理鹽水洗滌魚卵I次 2次后，將洗滌干凈的魚卵放入產卵盤中，加入濃度為IN的NaOH;按人工精漿與精液的體積比為(80 100) :1的比例向燒杯里的精液中加入人工精漿進行稀釋后放入培養皿中；將稀釋后的精液施加紫外線照射，照射強度為3000ergs/mm2 4000ergs/mm2,照射時間為50s 70s,其中，生理鹽水的配制將7. 5g的NaCUO. 2g 的 KCl、0. 2g 的 CaCl2 2H20 和 0. 02g 的 NaHCO3 加入到 IOOOml 蒸餾水制成生理鹽水；人工精漿的配制將7. 6g的NaCl,2. 98g的KC1、0. 37g的CaCl2 2H20、0. 31g的MgCl2 6H20和0. 21g的NaHCO3加入到1000ml蒸餾水制成溶液，再向該溶液中加入濃度為IN的NaOH溶液將該溶液的pH值調整為8. 2 8. 6，獲得人工精漿；三、按魚卵與稀釋后并施加紫外線照射的精液體積比為I: (2(T30)的比例向產卵盤中加入稀釋后并施加紫外線照射的精液進行混合后，立即按清水與稀釋后并施加紫外線照射的精液的體積比為I: (3^5)的比例加入溫度為9°C 11°C的清水，用羽毛攪勻之后靜止2mirT3min后，用清水反復沖洗受精卵4次飛次，洗掉殘余的精液，放入盛有清水的燒杯內；四、對經步驟三洗凈后的受精卵在受精后5mirTl0min進行熱休克誘導處理，將受精卵放入熱休克誘導處理設備中，調節其內部溫度為25 °C 30°C，熱休克誘導處理時間為18mirT22min,然后將受精卵放入盛有清水的孵化桶中進行孵化,孵化溫度為9. 5°C ^10. 5°C ;對經步驟三洗凈后的受精卵在受精后7. 5h^8. 5h用靜水壓力設備進行處理5. 5mirT6. 5min，靜水壓力為550KPa飛50Kpa，然后將受精卵放入盛有清水的孵化桶中進行孵化，孵化溫度為9. 50C 10. 50C ；五、當孵化積溫達到220度日 230度日，即達到發眼卵階段從孵化桶內將孵化后的魚卵取出，去除未受精和未發育的死魚卵，再將發眼卵放入盛有清水的孵化桶中進行孵化，孵化溫度為9. 5°C ^12. 5°C，發眼卵發育至300度日，稚魚孵化出膜，即完成鮭魚類全雌二倍體育種過程。本發明全雌二倍體育種的工作原理鮭魚類的成熟卵細胞內，含有一個攜帶I倍數染色體(n)的卵核和I個攜帶I倍數染色體(n)的第二極體(第一極體此前已被排出)。當精細胞進入卵細胞時，在精細胞的刺激下，第二極體連同他的I倍數的染色體被排出卵外，攜帶I倍數染色體(n)的卵核與攜帶I倍數染色體(n)的精核相互融合，生成具有二倍數染色體的受精卵，該卵將發育成二倍體魚。但當精細胞的遺傳物質被紫外線照射后，精細胞所攜帶的I倍數染色體失去遺傳能力(該套染色體無法與卵細胞內的染色體配對成二倍體)，進入卵細胞后，在適當時機，采 取適當的人工措施(本發明采取的是熱休克處理法)，阻止第二極體的排出，就會生成由卵核、無效精核、第二極體三方融合成的含有二倍數染色體(ln、0n、ln)的受精卵，該卵將發育成全雌二倍體魚。本發明的有益效果如下I、紫外線照射鮭魚精子，使其遺傳物質失活。即保持精子的受精能力，但雄性遺傳物質已經無法參與子代基因組的構建；2、熱休克法阻止受精卵第二極體排出，使受精卵所含有的非同源的全套染色體(遺傳物質)均來自于雌性配子(卵子)，從而保持了后代的二倍性，且所有后代均為XX機制，即均為雌性；3、靜水壓力法阻止第一次卵裂，使受精卵所含有的同源的全套染色體(遺傳物質)均來自于雌性配子(卵子)，從而保持了后代的二倍性，且所有后代均為XX機制，即均為雌性；4、用熱休克法誘導處理受精卵會得到異源全雌二倍體，用靜水壓力法處理受精卵會得到同源全雌二倍體。
具體實施例方式本發明技術方案不局限于以下所列舉具體實施方式
，還包括各具體實施方式
間的任意組合。
具體實施方式
一本實施方式中的一種適用于鮭魚類全雌二倍體育種的方法按以下步驟進行一、首先挑選體健成熟的鮭魚類雌魚和雄魚用人工方法分別采集魚卵和精液，將魚卵和精液放置于不同的燒杯中；二、用生理鹽水洗滌魚卵I次 2次后，將洗滌干凈的魚卵放入產卵盤中，加入濃度為IN的NaOH;按人工精漿與精液的體積比為(80 100) :1的比例向燒杯里的精液中加入人工精漿進行稀釋后放入培養皿中；將稀釋后的精液施加紫外線照射，照射強度為3000ergs/mm2 4000ergs/mm2,照射時間為50s 70s,其中，生理鹽水的配制將7. 5g的NaCl、0.2g的KCl、0. 2g的CaCl2 2H20和0. 02g的NaHCO3加入到1000ml蒸餾水制成生理鹽水；人工精漿的配制將 7. 6g 的 NaCl,2. 98g 的 KC1、0. 37g 的 CaCl2 .2H20、0. 31g 的 MgCl2 *6H20和0. 21g的NaHCO3加入到1000ml蒸餾水制成溶液，再向該溶液中加入濃度為IN的NaOH溶液將該溶液的PH值調整為8. 2^8. 6，獲得人工精漿；三、按魚卵與稀釋后并施加紫外線照射的精液體積比為I: (2(T30)的比例向產卵盤中加入稀釋后并施加紫外線照射的精液進行混合后，立即按清水與稀釋后并施加紫外線照射的精液的體積比為I: (3^5)的比例加入溫度為9°C 11°C的清水，用羽毛攪勻之后靜止2mirT3min后，用清水反復沖洗受精卵4次飛次，洗掉殘余的精液，放入盛有清水的燒杯內；四、對經步驟三洗凈后的受精卵在受精后5mirTl0min進行熱休克誘導處理，將受精卵放入熱休克誘導處理設備中，調節其內部溫度為25°C 30°C，熱休克誘導處理時間為18mirT22min,然后將受精卵放入盛有清水的孵化桶中進行孵化,孵化溫度為 9.5°C ^10. 5°C ;對經步驟三洗凈后的受精卵在受精后7. 5h^8. 5h用靜水壓力設備進行處理
5.5mirT6. 5min，靜水壓力為550KPa飛50Kpa，然后將受精卵放入盛有清水的孵化桶中進行孵化，孵化溫度為9. 50C 10. 50C ；五、當孵化積溫達到220度日 230度日，即達到發眼卵階段從孵化桶內將孵化后的魚卵取出，去除未受精和未發育的死魚卵，再將發眼卵放入盛有清水的孵化桶中進行孵化，孵化溫度為9. 5°C 12. 5°C，發眼卵發育至300度日 320度日，稚魚孵化出膜，即完成鮭魚類全雌二倍體育種過程。本發明全雌二倍體育種的工作原理鮭魚類的成熟卵細胞內，含有一個攜帶I倍數染色體(n)的卵核和I個攜帶I倍數染色體(n)的第二極體(第一極體此前已被排出)。當精細胞進入卵細胞時，在精細胞的刺激下，第二極體連同他的I倍數的染色體被排出卵外，攜帶I倍數染色體(n)的卵核與攜帶I倍數染色體(n)的精核相互融合，生成具有二倍數染色體的受精卵，該卵將發育成二倍體魚。但當精細胞的遺傳物質被紫外線照射后，精細胞所攜帶的I倍數染色體失去遺傳能力(該套染色體無法與卵細胞內的染色體配對成二倍體)，進入卵細胞后，在適當時機，采取適當的人工措施(本發明采取的是熱休克處理法)，阻止第二極體的排出，就會生成由卵核、無效精核、第二極體三方融合成的含有二倍數染色體(ln、0n、ln)的受精卵，該卵將發育成全雌二倍體魚。本發明的有益效果如下I、紫外線照射鮭魚精子，使其遺傳物質失活。即保持精子的受精能力，但雄性遺傳物質已經無法參與子代基因組的構建；2、熱休克法阻止受精卵第二極體排出，使受精卵所含有的非同源的全套染色體(遺傳物質)均來自于雌性配子(卵子)，從而保持了后代的二倍性，且所有后代均為XX機制，即均為雌性；3、靜水壓力法阻止第一次卵裂，使受精卵所含有的同源的全套染色體(遺傳物質)均來自于雌性配子(卵子)，從而保持了后代的二倍性，且所有后代均為XX機制，即均為雌性；
4、用熱休克法誘導處理受精卵會得到異源全雌二倍體，用靜水壓力法處理受精卵會得到同源全雌二倍體。
具體實施方式
二 本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟二中按人工精漿與精液的體積比為(85 95) : I的比例向燒杯里的精液中加入人工精漿進行稀釋；將稀釋后的精液施加紫外線照射，照射強度為3200ergs/mm2 3800ergs/mm2,照射時間為55s 65s。其它步驟及參數與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
三本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟二中按人工精漿與精液的體積比為90:1的比例向燒杯里的精液中加入人工精漿進行稀釋；將稀釋后的精液施加紫外線照射，照射強度為3500ergs/mm2，照射時間為60s。其它步驟及參數與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
四本實施方式與具體實施方式
一至三之一不同的是步驟二中再向該溶液中加入濃度為IN的NaOH溶液將該溶液的pH值調整為8. 4。其它步驟及參數與具體
實施方式一至三之一相同。
具體實施方式
五本實施方式與具體實施方式
一至四之一不同的是步驟三中按魚卵與稀釋后并施加紫外線照射的精液體積比為I: (22 28)的比例向產卵盤中加入稀釋后并施加紫外線照射的精液進行混合后，立即按清水與稀釋后并施加紫外線照射的精液的體積比為I: (3. 5^4. 5)的比例加入溫度為9. 50C 10. 5°C的清水。其它步驟及參數與具體實施方式
一至四之一相同。
具體實施方式
六本實施方式與具體實施方式
一至四之一不同的是步驟三中按魚卵與稀釋后并施加紫外線照射的精液體積比為1:25的比例向產卵盤中加入稀釋后并施加紫外線照射的精液進行混合后，立即按清水與稀釋后并施加紫外線照射的精液的體積比為1:4的比例加入溫度為10°C的清水。其它步驟及參數與具體實施方式
一至四之一相同。
具體實施方式
七本實施方式與具體實施方式
一至六之一不同的是步驟四中對經步驟三洗凈后的受精卵在受精后6mirT9min進行熱休克處理,將受精卵放入熱休克誘導處理設備中，調節其內部溫度為26°C 29°C，熱休克處理時間為19mirT21min，然后將受精卵放入盛有清水的孵化桶中進行孵化，孵化溫度為9. 8°C 10.2°C ;對經步驟三洗凈后的受精卵在受精后7. 8h^8. 2h用靜水壓力設備進行處理5. SmirTe. 2min,靜水壓力為580KPa飛20Kpa，然后將受精卵放入盛有清水的孵化桶中進行孵化，孵化溫度為
9.8°C ^10. 2°C。其它步驟及參數與具體實施方式
一至六之一相同。
具體實施方式
八本實施方式與具體實施方式
一至六之一不同的是步驟四中對經步驟三洗凈后的受精卵在受精后Smin進行熱休克處理，將受精卵放入熱休克誘導處理設備中，調節其內部溫度為28°C，熱休克處理時間為20min，然后將受精卵放入盛有清水的孵化桶中進行孵化，孵化溫度為10°C ;對經步驟三洗凈后的受精卵在受精后8h用靜水壓力設備進行處理6min，靜水壓力為600KPa，然后將受精卵放入盛有清水的孵化桶中進行孵化，孵化溫度為10°C。其它步驟及參數與具體實施方式
一至六之一相同。
具體實施方式
九本實施方式與具體實施方式
一至八之一不同的是步驟五中孵化積溫達到222度日 228度日，孵化溫度為10°C 12°C，發眼卵發育至305度日 315度日，稚魚孵化出膜。其它步驟及參數與具體實施方式
一至八之一相同。
具體實施方式
十本實施方式與具體實施方式
一至八之一不同的是步驟五中孵化積溫達到225度日，孵化溫度為irc，發眼卵發育至310度日，稚魚孵化出膜。其它步驟及參數與具體實施方式
一至八之一相同。為了驗證本發明的有益效果，進行了以下實驗實驗一一種適用于鮭魚類全雌二倍體育種的方法按以下步驟進行
一、首先挑選體健成熟的鮭魚雌魚和雄魚用人工方法分別采集魚卵和精液，將魚卵和精液放置于不同的燒杯中；二、用生理鹽水洗滌魚卵2次后，將洗滌干凈的魚卵放入產卵盤中，加入濃度為IN的NaOH ;按人工精漿與精液的體積比為90:1的比例向燒杯里的精液中加入人工精漿進行稀釋后放入培養皿中；將稀釋后的精液施加紫外線照射，照射強度為3500ergs/mm2，照射時間為60s，其中，生理鹽水的配制:將7. 5g的NaCl、0. 2g的KC1、0. 2g的CaCl2 CH2O和0. 02g的NaHCO3加入到IOOOml蒸餾水制成生理鹽水；人工精漿的配制將7. 6g的NaCl、2. 98g的KCl、0. 37g 的 CaCl2 2H20、0. 31g 的 MgCl2 6H20 和 0. 21g 的 NaHCO3 加入到 IOOOml 蒸餾水制成溶液，再向該溶液中加入濃度為IN的NaOH溶液將該溶液的pH值調整為8. 4，獲得人工精漿，所用紫外線照射裝置為一個0. 48m3的有機玻璃(I X 0. 6 X 0. 8m3)頂部安裝紫外線燈管，下方是可調節高度的電動搖床；三、按魚卵與稀釋后并施加紫外線照射的精液體積比為1:25的比例向產卵盤中加入稀釋后并施加紫外線照射的精液進行混合后，立即按清水與稀釋后并施加紫外線照射的精液的體積比為1:4的比例加入溫度為10°C的清水，用羽毛攪勻之后靜止2min后，用清水反復沖洗受精卵5次，洗掉殘余的精液，放入盛有清水的燒杯內；四、對經步驟三洗凈后的受精卵在受精后Smin進行熱休克處理，將受精卵放入熱休克誘導處理設備中，調節其內部溫度為28°C，熱休克處理時間為20min，然后將受精卵放入盛有清水的孵化桶中進行孵化，孵化溫度為10°C;所用熱休克誘導處理設備為一個Im3大的玻璃缸體，下方有循環水泵、加熱棒、增氧泵和控溫裝置；五、當孵化積溫達到220度日，即達到發眼卵階段從孵化桶內將孵化后的魚卵取出，去除未受精和未發育的死魚卵，再將發眼卵放入盛有清水的孵化桶中進行孵化，孵化溫度為12°C，發眼卵發育至300度日，稚魚孵化出膜，即完成鮭魚全雌二倍體育種過程。經實驗一驗證，采用本發明方法進行鮭魚全雌二倍體育種，全雌率可達85%，為鮭魚類全雌二倍體育種，提供了一種行之有效的方法，填補了國內此領域研究的空白。
權利要求
1.一種適用于鮭魚類全雌二倍體育種的方法，其特征在于它是通過以下步驟實現的 一、首先挑選體健成熟的鮭魚類雌魚和雄魚用人工方法分別采集魚卵和精液，將魚卵和精液放置于不同的燒杯中； 二、用生理鹽水洗滌魚卵I次 2次后，將洗滌干凈的魚卵放入產卵盤中，加入濃度為IN的NaOH ;按人工精漿與精液的體積比為(80 100) : I的比例向燒杯里的精液中加入人工精漿進行稀釋后放入培養皿中；將稀釋后的精液施加紫外線照射，照射強度為3000ergS/mm2 4000ergs/mm2,照射時間為50s 70s,其中，生理鹽水的配制將7. 5g的NaCl、0. 2g的KCl、0. 2g的CaCl2 *2H20和0. 02g的NaHCO3加入到1000ml蒸餾水制成生理鹽水；人工精漿的配制將 7. 6g 的 NaCl,2. 98g 的 KC1、0. 37g 的 CaCl2 .2H20、0. 31g 的 MgCl2 *6H20 和 0. 21g的NaHCO3加入到1000ml蒸餾水制成溶液，再向該溶液中加入濃度為IN的NaOH溶液將該溶液的PH值調整為8. 2^8. 6，獲得人工精漿； 三、按魚卵與稀釋后并施加紫外線照射的精液體積比為I:(20^30)的比例向產卵盤中加入稀釋后并施加紫外線照射的精液進行混合后，立即按清水與稀釋后并施加紫外線照射的精液的體積比為I: (3^5)的比例加入溫度為9°C 11°C的清水，用羽毛攪勻之后靜止.2mirT3min后，用清水反復沖洗受精卵4次飛次，洗掉殘余的精液，放入盛有清水的燒杯內； 四、對經步驟三洗凈后的受精卵在受精后5mirTl0min進行熱休克誘導處理，將受精卵放入熱休克誘導處理設備中，調節其內部溫度為25°C 30°C，熱休克誘導處理時間為18mirT22min,然后將受精卵放入盛有清水的孵化桶中進行孵化，孵化溫度為.9.5°C ^10. 5°C ;對經步驟三洗凈后的受精卵在受精后7. 5h^8. 5h用靜水壓力設備進行處理.5. 5mirT6. 5min，靜水壓力為550KPa飛50Kpa，然后將受精卵放入盛有清水的孵化桶中進行孵化，孵化溫度為9. 50C 10. 50C ； 五、當孵化積溫達到220度日 230度日，即達到發眼卵階段從孵化桶內將孵化后的魚卵取出，去除未受精和未發育的死魚卵，再將發眼卵放入盛有清水的孵化桶中進行孵化，孵化溫度為9. 5°C ^12. 5°C，發眼卵發育至300度日，稚魚孵化出膜，即完成鮭魚類全雌二倍體育種過程。
2.如權利要求I所述的一種適用于鮭魚類全雌二倍體育種的方法，其特征在于步驟二中按人工精漿與精液的體積比為(85 95) :1的比例向燒杯里的精液中加入人工精漿進行稀釋；將稀釋后的精液施加紫外線照射，照射強度為3200ergS/mnT3800ergS/mm2，照射時間為55s 65s。
3.如權利要求I所述的一種適用于鮭魚類全雌二倍體育種的方法，其特征在于步驟二中按人工精漿與精液的體積比為90:1的比例向燒杯里的精液中加入人工精漿進行稀釋；將稀釋后的精液施加紫外線照射，照射強度為3500ergs/mm2，照射時間為60s。
4.如權利要求1、2或3所述的一種適用于鮭魚類全雌二倍體育種的方法，其特征在于步驟二中再向該溶液中加入濃度為IN的NaOH溶液將該溶液的pH值調整為8. 4。
5.如權利要求4所述的一種適用于鮭魚類全雌二倍體育種的方法，其特征在于步驟三中按魚卵與稀釋后并施加紫外線照射的精液體積比為I: (22 28)的比例向產卵盤中加入稀釋后并施加紫外線照射的精液進行混合后，立即按清水與稀釋后并施加紫外線照射的精液的體積比為I: (3. 5^4. 5)的比例加入溫度為9. 50C 10. 5°C的清水。
6.如權利要求4所述的一種適用于鮭魚類全雌二倍體育種的方法，其特征在于步驟三中按魚卵與稀釋后并施加紫外線照射的精液體積比為1:25的比例向產卵盤中加入稀釋后并施加紫外線照射的精液進行混合后，立即按清水與稀釋后并施加紫外線照射的精液的體積比為1:4的比例加入溫度為10°C的清水。
7.如權利要求5所述的一種適用于鮭魚類全雌二倍體育種的方法，其特征在于步驟四中對經步驟三洗凈后的受精卵在受精后6mirT9min進行熱休克處理，將受精卵放入熱休克誘導處理設備中，調節其內部溫度為26°C 29°C，熱休克處理時間為19mirT21min，然后將受精卵放入盛有清水的孵化桶中進行孵化，孵化溫度為9. 8°C ^lO. 2V ;對經步驟三洗凈后的受精卵在受精后7. 8h^8. 2h用靜水壓力設備進行處理5. SmirTe. 2min,靜水壓力為580KPa飛20Kpa，然后將受精卵放入盛有清水的孵化桶中進行孵化，孵化溫度為9. 8 0C 10. 2。。。
8.如權利要求5所述的一種適用于鮭魚類全雌二倍體育種的方法，其特征在于步驟四中對經步驟三洗凈后的受精卵在受精后8min進行熱休克處理，將受精卵放入熱休克誘導處理設備中，調節其內部溫度為28°C，熱休克處理時間為20min，然后將受精卵放入盛有清水的孵化桶中進行孵化，孵化溫度為10°C ;對經步驟三洗凈后的受精卵在受精后8h用靜水壓力設備進行處理6min，靜水壓力為600KPa，然后將受精卵放入盛有清水的孵化桶中進行孵化，孵化溫度為I (TC。
9.如權利要求7所述的一種適用于鮭魚類全雌二倍體育種的方法，其特征在于步驟五中孵化積溫達到222度日 228度日，孵化溫度為10°C 12°C，發眼卵發育至305度日 315度日，稚魚孵化出膜。
10.如權利要求7所述的一種適用于鮭魚類全雌二倍體育種的方法，其特征在于步驟五中孵化積溫達到225度日，孵化溫度為11°C，發眼卵發育至310度日，稚魚孵化出膜。
全文摘要
一種適用于鮭魚類全雌二倍體育種的方法，它涉及適用于鮭魚類全雌二倍體育種的方法，本發明要解決現有不存在鮭魚類全雌二倍體育種方法的問題。本發明中一種適用于鮭魚類全雌二倍體育種的方法通過如下步驟來實現一、人工方法分別采集魚卵和精液；二、用生理鹽水清洗魚卵并用人工精漿稀釋精液；三、魚卵受精四、孵化全雌二倍體；五、孵化得到稚魚。采用本發明方法進行鮭魚全雌二倍體育種，全雌率可達85%，本發明可應用于鮭魚類全雌二倍體育種生產領域。
文檔編號A01K61/00GK102715118SQ201210247240
公開日2012年10月10日 申請日期2012年7月17日 優先權日2012年7月17日
發明者徐革鋒, 戶國, 王炳謙, 谷偉 申請人:中國水產科學研究院黑龍江水產研究所