專利名稱：一種魚腥草地上莖組織培養快速繁殖的方法
技術領域：
本發明涉及ー種植物離體培養與快速繁殖的方法，特別是一種魚腥草地上莖組織培養進行快速繁殖的方法。
背景技術：
魚腥草學名蕺菜，屬三白草科蕺菜屬，是宿根性多年生草本植物，原產我國，主要分布于我國中部、東南及西南部各省區，東起臺灣、西南至云南、西藏、北達陜西、甘肅，尤以四川、湖北、湖南、江蘇等省居多。以嫩莖葉和地下莖作蔬菜食用，全株可鮮用或曬干入藥，已被國家衛生部正式確定為“既是藥品，又是食品”的極具開發潛カ的資源之一。魚腥草歷來為野生植物，從上世紀80年代初開始進行人工栽培，以無性繁殖為主，通常采用地下莖繁殖。但不同來源和不同時期的魚腥草品系在產量和品質上的差異較 大，利用組織培養技術進行魚腥草的快速繁殖培養，既可培育大量的魚腥草優質種苗，做到生產周年化和標準化，滿足生產的需要；又可解決魚腥草的種性退化問題，加速優良種苗的產業化發展。根據大量資料統計，Tsuzuki等用魚腥草葉誘導出愈傷組織和植株，移入地中栽培直至成熟。Handique等用魚腥草莖節作外植體在MS+6-BA的培養基上培養獲得叢生芽，獲得的芽在MS+IAA的培養基上生根，有根的小植株被成功地移栽到大田。袁藝等得出適于魚腥草側芽分化生長的最佳培養基為MS+6-BA I. 0-2. 0mg/L+NAA0. 1-0. 5mg/L，適宜魚腥草生根的最佳培養基為MS+NAA1. 0mg/L+6-BA0. 25mg/L。吳衛等的魚腥草快速繁殖體系結果表明，魚腥草快速繁殖的外植體以地上莖節和莖尖較適宜，其中，MS+1. 0mg/L6-BA培養基則對莖尖愈傷組織誘導作用較佳；MS+0. 5-1. 0mg/L6-BA+0. 2mg/LNAA培養基對地上莖節叢生芽的誘導速度快，數目多；生根培養基則以MS+0.2mg/LIAA最好。龔偉等的結果表明，初代培養以 MS+6-BA1. 0mg/L+NAA0. 05mg/L 為最佳，30d 側芽誘導率可達 66. 7% ；MS+6-BA2. Omg/L+2, 4-DO. 2mg/L+NAA0. 2mg/L對芽苗的繼代增殖效果最好，40d芽苗的增殖倍數可達7. 4，且芽苗較高；以沙和蛭石(I 1)為基質瓶外生根效果最好，30d芽苗生根率可達84%。縱觀以上組織培養方面的研究，其所選的外植體多祥化、接種的時間也各異，且進行魚腥草離體組織培養時很易污染的問題普遍存在，極大地限制了效果。
發明內容
本發明的目的是針對現有技術的不足，提供一種簡單易行的、快速繁殖的、且有效降低污染率問題的魚腥草地上莖節組織培養方法。一種魚腥草地上莖組織培養快速繁殖的方法，包括如下步驟(I)消毒處理首先，剪下帯節的魚腥草植株地上莖用清水沖洗干凈，先將莖切割成5-lOcm長帶有1-2個腋芽的莖段，用0. 1%升汞進行第一次消毒處理12min ;然后將莖段用鏈霉素和青霉素鈉的混合液浸泡24h，混合液中鏈霉素和青霉素鈉的濃度均為0. 5g/L ；70%酒精浸泡30s后,再在0. 1%升萊中進行第二次消毒處理IOmin ;最后無菌水沖洗30s即可；(2)不定芽誘導培養在無菌條件下將消毒好的帶有1-2個腋芽的莖段接種到不定芽誘導培養基上誘導不定芽；培養基為MS+0. 5mg/L NAA+2. Omg/L 6_BA ;培養條件為溫度 25±2°C、濕度 80-95%、光照時間 12_14h/d、光照強度 2000_3000Lx ；(3)増殖培養將誘導出的不定芽接種到增殖培養基中進行擴繁增殖，培養基為MS+0. lmg/L NAA+1. Omg/L 6-BA ;培養溫度 25±2°C、濕度 85_95%、光照時間 12_14h/d、光照強度 2000-3000Lx ；(4)生根培養將增殖培養得到的單株芽轉入生根培養基中進行生根培養；培養基為 MS+NAAO. 5mg/L+IBAl. Omg/L ;培養溫度 25±2°C、濕度 85_95%、光照時間 12_14h/d、光照強度 2000-3000Lx ；(5)煉苗與移栽。 上述方法中也可以將步驟(3)増殖培養中脫離叢生狀態，轉向增高生長的苗直接按照步驟(4)進行生根培養；或者將其進行切段繁殖培養，切段時切割成5-lOcm長帶有1-2個腋芽的莖段；切段繁殖培養基為MS+1. Omg/L 6-BA+O. lmg/L NAA+0. 5mg/L GA3 ;培養溫度25±2°C、濕度85-95%、光照時間12_14h/d、光照強度2000_3000Lx ;再按照步驟(4)進行生
根培養。步驟(5)的煉苗與移栽過程具體為苗高10-15cm時進行煉苗，煉苗前首先揭開培養器皿的封ロ，再繼續培養3-4d后將魚腥草苗從培養器皿中取出，洗凈根部附著的培養基，移入裝有河沙蛭石=I: I的盆中，前期適當遮蔭并保持濕度在85-95%，以后逐步降低至75%，7天后于自然光照條件下培養即可。本發明采用的鏈霉素是ー種氨基糖苷類抗生素，對結核分枝桿菌和多種革蘭氏陰性菌(如大腸桿菌、沙門氏菌、布魯氏菌、巴氏桿菌、志賀氏痢疾桿菌等)有抗菌作用；青霉素鈉是ー種抗生素類藥，具有抗菌作用強、療效高及毒性低等優點，主要用于鏈球菌、肺炎球菌、腦膜炎球菌感染等。本發明將兩者合理配比形成組合溶液消毒；并以0. 1%升汞12min —鏈霉素和青霉素鈉混合液浸泡24h — 70%酒精浸泡30s — 0. 1%升汞IOmin的處理方式效果最好，污染率可降低至0%。采用的赤霉素GA3能改變某些作物雌、雄花比例，誘導單性結實，加速果實生長，促進座果；打破種子休眠，提早種子發芽，加快莖的伸長及有些作物的抽苔；擴大葉面積，カロ快幼枝生長，有利于代謝產物在韌皮部內積累，活化形成層；抑制成熟和衰老，控制側芽休眠及塊莖的形成。本發明就是通過適當濃度的GA3來延長不定芽的長度；在切段繁殖時用了 GA3。本發明誘導培養基的組成配比是MS+0. 5mg/L NAA+2. Omg/L 6-BA的誘導效果最好，誘導培養15d后的誘導率高達96. 65% ；本方面增殖培養基的組成配比是MS+0. lmg/L NAA+1. Omg/L 6-BA的增殖效果最好，增殖培養IOd后的增殖率達4. 98倍；本發明切段繁殖培養的組成配比是在MS+l.Omg/L 6-BA+O. lmg/L NAA+0. 5mg/LGA3，切段繁殖培養IOd后的苗長伸長可達2. 56倍；本發明生根培養基的組成配比是MS+NAA0. 5mg/L+IBAl. Omg/L ;生根培養15d后的生根率可達89. 36%。
本發明煉苗與移栽的培養以河沙蛭石=I: I的基質獲得成活的魚腥草植株多。本發明的積極效果是利用組織培養繁殖改變了魚腥草品種退化現象，保持了原品種的優良種性，確保種苗純度；可實現エ廠化育苗、高效率生產；可人為的控制培養生長田間，不受自然條件的影響，取材量小，培養材料經濟，生長周期短，繁殖系數大，管理方便，利于自動化生產和產業化生產。同時，本發明解決了魚腥草初代接種時，污染率高的問題；地上莖培養成苗率高，程序簡單實用，有效解決了魚腥草試管苗的繁殖周期緩慢、生長緩慢的問題；繁殖系數達4. 98倍，快繁生產周期50d，試管苗中加入GA3可獲得長度高的増殖芽叢，便于增殖；同時，本發明解決了規模化生產成本偏高的問題。
圖I為魚腥草地上莖節的消毒處理；圖2為魚腥草地上莖節的不定芽誘導培養； 圖3為魚腥草地上莖節的增殖培養；圖4為魚腥草地上莖節的切段繁殖培養；圖5為魚腥草地上莖節的生根培養；圖6為魚腥草移栽培養。
具體實施例方式以下結合實施例進ー步說明本發明，而非限制本發明。實施例I消毒處理首先，田間選擇健康幼嫩的魚腥草植株，剪下帶節的地上莖用清水沖洗干凈，用0. 1%升汞進行第一次消毒處理12min ;然后將莖段用鏈霉素和青霉素鈉的混合液浸泡24h，混合液中鏈霉素和青霉素鈉的濃度均為0. 5g/L ;70%酒精浸泡30s后再在0. 1%升汞中進行第二次消毒處理IOmin ;最后無菌水沖洗30s，將地上莖取出放置在消毒好的吸水紙上，污染率可降低至0% (圖I);不定芽誘導培養在無菌條件下將滅菌好的地上5-lOcm長莖段(帶有1-2個腋芽)接種到不定芽誘導培養基上進行誘導培養；培養基配方MS+0. 5mg/L NAA+2. Omg/L 6-BA ；在溫度(25±2)で、濕度85-95%、光照時間12_14h/d、光照強度2000_3000Lx的培養條件下培養14d后，即可轉入增殖培養基(圖2);誘導培養15d后的誘導率高達96. 65%。増殖培養將誘導出的不定芽接種到增殖培養基中進行擴繁增殖，培養基配方為MS+0. lmg/L NAA+1. 0mg/L6-BA ;在培養室內通過40d的增殖培養，不定芽逐漸分化成叢生芽，每個芽點可分化出3-4個芽，此時可進行繼代繁殖，將芽叢從基部切開，重新接種到繼代增殖培養基中；經過7-10d后，又可形成3-4個芽，如此反復進行；芽叢逐漸增多，繁殖體系基部建立起來；培養溫度(25±2)で、濕度85-95%、光照時間12_14h/d、光照強度2000-3000LX (圖3);增殖培養IOd后的增殖率達4. 98倍。切段繁殖培養在培養芽叢的過程中，有的芽從逐漸脫離叢生狀態，轉向增高生長，如果延長培養時間而不轉接，少量可形成根系，此時應將這種苗分離出來単獨生根或者切段繁殖培養后再生根；切段繁殖培養時將高7-lOcm的小苗，用剪刀切成莖節莖段，切段時切割成5-lOcm長帶有1-2個腋芽的莖段，轉入切段繁殖培養基中培養；培養基配方MS+1. 0mg/L6-BA+0. lmg/L NAA+0. 5mg/L GA3, 30d后，又萌發成一株小苗，這樣反復進行，可以大量獲得這樣的小苗，切段繁殖體系建立起來；培養溫度(25±2)で、濕度85-95%、光照時間12-14h/d、光照強度2000-3000LX (圖4);切段繁殖培養IOd后的苗長伸長可達2. 56倍。生根培養選取生長勢強、健壯的増殖得到的魚腥草單株芽或者單株苗或者經過切段繁殖培養得到的單株小苗轉入生根培養基中進行生根培養；培養基配方MS+NAAO. 5mg/L+IBAl. Omg/L ；15d后有89. 36%的植株長出根，待苗長15_20cm時，即可煉苗移栽；培養溫度(25 ±2)で、濕度85-95%、光照時間12_14h/d、光照強度2000_3000Lx (圖5)。煉苗與移栽苗高10-15cm時煉苗，煉苗前首先揭開培養器皿的封ロ，再繼續培養3-4d后將魚腥草苗從培養器皿中取出，洗浄根部附著的培養基，移入裝有河沙蛭石=I: I的盆中，前期適當遮蔭并保持濕度在85-95%，逐步降低至75%，7天后于自然光照條件下培 養，得成活魚腥草植株(圖6)。
權利要求
1.一種魚腥草地上莖組織培養快速繁殖的方法，其特征在于，包括如下步驟 (1)消毒處理首先，剪下帯節的魚腥草植株地上莖用清水沖洗干凈，先將莖切割成5-10cm長帶有1-2個腋芽的莖段,用0. 1%升汞進行第一次消毒處理12min ;然后將莖段用鏈霉素和青霉素鈉的混合液浸泡24h，混合液中鏈霉素和青霉素鈉的濃度均為0. 5g/L ；70%酒精浸泡30s后，再在0. 1%升汞中進行第二次消毒處理IOmin ;最后無菌水沖洗30s即可； (2)不定芽誘導培養在無菌條件下將消毒好的帶有1-2個腋芽的莖段接種到不定芽誘導培養基上誘導不定芽；培養基為MS+0. 5mg/L NAA+2. Omg/L 6-BA ;培養條件為溫度25±2°C、濕度 80-95%、光照時間 12_14h/d、光照強度 2000_3000Lx ； (3)増殖培養將誘導出的不定芽接種到增殖培養基中進行擴繁增殖，培養基為 MS+0. lmg/L NAA+1. Omg/L 6_BA ;培養溫度 25±2°C、濕度 85_95%、光照時間 12_14h/d、光照強度 2000-3000Lx ； (4)生根培養將增殖培養得到的單株芽轉入生根培養基中進行生根培養；培養基為MS+NAAO. 5mg/L+IBAl. Omg/L ;培養溫度 25±2°C、濕度 85_95%、光照時間 12_14h/d、光照強度 2000-3000Lx ； (5)煉苗與移栽。
2.根據權利要求I所述的魚腥草地上莖組織培養快速繁殖的方法，其特征在于，將步驟(3)増殖培養中脫離叢生狀態，轉向增高生長的苗直接按照步驟(4)進行生根培養；或者將其進行切段繁殖培養，切段時切割成5-lOcm長帶有1-2個腋芽的莖段；切段繁殖培養基為MS+l.Omg/L 6-BA+O. lmg/L NAA+0. 5mg/L GA3 ;培養溫度25±2°C、濕度85_95%、光照時間12-14h/d、光照強度2000-3000LX ;再按照步驟(4)進行生根培養。
3.根據權利要求I所述的魚腥草地上莖組織培養快速繁殖的方法，其特征在于，步驟(5)的煉苗與移栽過程具體為苗高10-15cm時進行煉苗，煉苗前首先揭開培養器皿的封ロ，再繼續培養3-4d后將魚腥草苗從培養器皿中取出，洗凈根部附著的培養基，移入裝有河沙蛭石=1 I的盆中，前期遮蔭并保持濕度在85-95%，以后逐步降低至75%，7天后于自然光照條件下培養即可。
全文摘要
本發明是一種魚腥草地上莖組織培養快速繁殖的方法，經過本發明獨特的消毒、不定芽誘導、增殖、切段培養、生根，移栽等過程，成功的對魚腥草地上莖組織進行了快速繁殖，實現工廠化育苗、高效率生產；人為的控制培養生長，不受自然條件的影響，取材量小，培養材料經濟，生長周期短，繁殖系數大，管理方便。同時，本發明解決了魚腥草初代接種時，污染率高的問題；地上莖培養成苗率高，程序簡單實用，有效解決了魚腥草試管苗的繁殖周期緩慢、生長緩慢的問題；繁殖系數達4.98倍，快繁生產周期50d，試管苗中加入GA3可獲得長度高的增殖芽叢，便于增殖；同時，本發明解決了規模化生產成本偏高的問題。
文檔編號A01H4/00GK102860257SQ201210252069
公開日2013年1月9日 申請日期2012年7月20日 優先權日2012年7月20日
發明者鐘軍, 熊興耀, 李炎林, 周小云, 李愛華, 黃放, 張寒 申請人:湖南農業大學