專利名稱：一種可維持細胞活性的組織凍存液的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，具體地，涉及一種可維持細胞活性的組織凍存液。
背景技術：
低溫冷凍保存是活體組織長期保存的一種有效方法，主要通過降低細胞的代謝率來起到保護作用，凍傷是低溫保護最大的負反應，其原因可能為冰晶所致的機械性損傷和滲透性損傷。目前組織的凍存主要有兩種方法快速凍存法，即玻璃化法；慢速凍存法，即程序降溫法。慢速凍存法較為常用。但是如果沒有采取合適的凍存方法和合適的冷凍保護齊U，組織在凍存過程中容易被凍傷·
超低溫冷凍保存是在液氮(_196°C )中使保存的活細胞物質代謝和生長幾乎完全停止的保存方法。在這樣冷凍的條件下，調節和控制細胞生長代謝的各類酶的作用受到極大抑制，使細胞內部的生化反應十分緩慢，甚至停止，從而避免細胞遺傳性狀的改變，細胞和組織不會喪失形態發生的潛能。但是，單純的超低溫保存會對細胞造成兩方面的損傷。其一，在低溫保存的過程中，細胞外部的水分首先結冰，使得未結冰的溶液中電解質濃度升高，造成細胞死亡，這種因保存溶液中溶質濃度升高而導致的細胞損傷稱為溶質損傷；其二，隨著溫度的降低，細胞內的水分也會結冰，所形成的冰晶進一步破壞細胞膜和細胞器，這種因細胞內部結冰而導致的細胞損傷稱為細胞內冰晶的損傷。影響損傷程度的因素主要有冷凍速度、融凍速度及冷凍保護劑。冷凍保護劑是指可以保護細胞免受冷凍損傷的物質，一般可分為滲透性與非滲透性兩類。一般非滲透性保護劑是大分子聚合物，不能滲透到細胞內部，通過稀釋胞外電解質的濃度，減少溶質損傷和結合水分子，降低胞外自由水的含量，減少冰晶損傷。常用的有蔗糖、聚乙烯卩比咯燒酮(PVP)、聚乙二醇(PEG)、葡聚糖(dextran)、白蛋白(albumin)及輕乙基淀粉(hydroxyephylstarch, HES)等。而滲透性保護劑則主要為小分子物質,多易溶于水，與水分子結合的能力強，易穿透細胞膜進入細胞內部，在細胞內能降低細胞的冰點；并提高細胞膜對水的通透性，減少冰晶形成；復蘇時促進細胞外水分進入細胞，緩解滲透性腫脹引起的損傷；稀釋未結冰溶液中電解質的濃度，減少溶質損傷。主要有以下幾種甘油、二甲基亞諷(DMSO)、丙_■醇、乙_■醇等。在前兩種因素冷凍速度和融凍速度受目前工藝條件的限制，無法在短期內有較大改進的前提下，冷凍保護劑的正確選擇及應用就成為了決定凍存效果的最關鍵因素。脂肪干細胞(adipose-derived stem cells, ADSCs)是近年來從脂肪組織中分離得到的一種具有多向分化潛能的干細胞。研究發現ADSCs細胞能夠在體外穩定增殖且衰亡率低，同時它具有取材容易、少量組織即可獲取大量干細胞，適宜大規模培養，對機體損傷小等優點，而且其來源廣泛，體內儲備量大，適宜自體移植，逐漸成為近年來新的研究熱點之一。采用合適的方法凍存脂肪組織，并從中取得干細胞，可以為臨床應用提供良好的條件，因此本領域迫切需要開發新穎有效的且適合脂肪組織的凍存液。
發明內容
本發明的目的是提供一種有效的可用于脂肪組織的凍存液及脂肪組織的凍存方法。在本發明的第一方面，提供一種凍存液，包含以下組分海藻糖、二甲基亞砜和血清替代物KSR。在另一優選例中，所述海藻糖的濃度為0.05 2mol/l ;所述二甲基亞砜與所述血清替代物KSR的體積比為I: f 10。在另一優選例中，所述海藻糖的濃度為O. Γ0. 5mol/l ;所述二甲基亞砜與所述血清替代物KSR的體積比為I:廣5。·本發明的凍存液可以由海藻糖的KSR溶液，二甲基亞砜與KSR混合均勻后配制而成，其中，所述海藻糖的KSR溶液的濃度為O. 5 20mol/l，所述海藻糖的KSR溶液，二甲基亞砜與KSR的體積比為1-4 :1-4 :13-18。在另一優選例中，所述海藻糖的KSR溶液的濃度為O. 5^10mol/l，較佳地為05 8mol/l。在另一優選例中，所述二甲基亞砜與KSR的體積比為1-4 :1-4 :13_18 ;較佳地，二甲基亞砜與KSR的體積比為1-1. 5 1-1. 5 :9-11。本發明的第二方面，提供第一方面所述的凍存液的用途，被用于長期保存脂肪組織和/或建立脂肪組織庫。本發明的第三方面，提供一種脂肪組織混合物，所述混合物包括以下組分脂肪組織，和第一方面所述的凍存液。在另一優選例中，所述脂肪組織與所述凍存液的體積比為1:0. 5-5，較佳地，為I: O. 8_2 ο在另一優選例中，所述脂肪組織與所述凍存液的體積比為1:1-1. 5。本發明的第四方面，提供一種脂肪組織庫，含有第三方面所述的脂肪組織混合物。本發明的第五方面，提供第四方面所述的脂肪組織庫的用途，它被用于長期保存脂肪組織。本發明的第六方面，提供一種脂肪組織的凍存方法，包括步驟(i)對獲得的含脂肪干細胞的脂肪組織材料進行洗滌，從而獲得去除了表面雜細胞的脂肪組織；(ii)將步驟⑴得到的脂肪組織剪碎，得到O. 8^1. 5mm3的組織塊；(iii)將步驟(ii)得到的組織塊與第一方面所述的凍存液進行混合，得到脂肪組織混合物；(iv)將步驟(iii)得到的脂肪組織混合物降溫后，于-70°C _200°C保存。在另一優選例中，所述步驟(iii)中所述組織塊與所述凍存液的體積比為1:0. 8 2。在另一優選例中，所述步驟(iv)中將脂肪組織混合物放入程序降溫盒，采用程序降溫法梯度降溫，_80°C冰箱或液氮內保存。在另一優選例中，所述步驟(iv)使用程序降溫法梯度降溫，較佳地降溫速率為-I至-2 °C /min。在另一優選例中，所述步驟(iv)當溫度到達_25°C以下時，降溫速率調至-5至-10°C /min。在另一優選例中，所述步驟(iv)中當溫度達到-40°C時，將裝有脂肪組織混合物的程序降溫盒直接保存于_80°C冰箱中。在另一優選例中，所述步驟(iv)中當溫度達到-100°C時，將裝有脂肪組織混合物的程序降溫盒直接保存于液氮中 。本發明提供了一種適宜凍存組織，并維持組織內細胞活性的凍存液，采用滲透劑與非滲透劑結合的方法凍存組織，能夠保證從復蘇的組織中培養出適用于臨床的干細胞。應理解，在本發明范圍內中，本發明的上述各技術特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特征之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
圖I為顯微鏡下觀察培養第6、9、12天后、從新鮮脂肪組織中爬出的細胞的生長狀態圖。圖2為顯微鏡下觀察培養第6、9、12天后、從凍存復蘇后的脂肪組織中爬出的細胞的生長狀態圖。圖3為用流式細胞儀檢測由復蘇后的脂肪組織獲得的干細胞傳至第3代時表面標志抗原蛋白的鑒定結果，表明該脂肪干細胞的純度很高。
具體實施例方式本發明人經過廣泛而深入的研究，意外地發現，采用含有海藻糖、二甲基亞砜、KSR的凍存液凍存脂肪組織，復蘇后可以獲得的生長狀況良好且純度高的脂肪間充質干細胞。在此基礎上，完成了本發明。脂肪組織和脂肪干細胞(ADSCs)如本文所用，術語“脂肪干細胞”指分離自脂肪組織的干細胞，具體地，脂肪干細胞是從脂肪組織中分離得到的一種具有多向分化潛能的干細胞。在本發明中，脂肪組織或脂肪原料沒有特別限制，可以是來源于動物或人的任何部位的脂肪組織，優選人的脂肪組織。較佳地，脂肪組織可以是腰部、臀部、腹部、大腿、上臂等部位的組織。二甲基亞砜(DMSO)二甲基亞砜是一種含硫有機化合物，常溫下為無色無臭的透明液體，具有高極性、高沸點、熱穩定性好、非質子、與水混溶的特性，能溶于乙醇、丙醇、苯和氯仿等大多數有機物。在細胞培養中，DMSO可以作為滲透性保護劑，能夠降低細胞冰點，減少冰晶的形成，減輕自由基對細胞損害，改變生物膜對電解質、藥物、毒物和代謝產物的通透性。海藻糖海藻糖是由兩個葡萄糖分子以1，I-糖苷鍵構成的非還原性糖。可應用于研究用生物試劑的保存，例如各種工具酶、細胞膜、細胞器、抗體、抗原及病毒等等。凍存液
本發明提供了一種有效的可用于脂肪組織的凍存液，包括組分海藻糖、二甲基亞諷(DMSO)和血清替代物Knockout Serum Replacement (KSR)。通常，凍存液中海藻糖的濃度為O. 05^2mol/l ;所述二甲基亞砜與所述血清替代物KSR的體積比為1:廣10。在另一優選例中，所述海藻糖的濃度為O. Γ0. 5mol/l ;所述二甲基亞砜與所述血清替代物KSR的體積比為I:廣5。在一優選配制方式中，所述凍存液由海藻糖的KSR溶液，二甲基亞砜與KSR混合均勻后配制而成，其中，所述海藻糖的KSR溶液的濃度為O. 5 20mol/l，所述海藻糖的KSR溶液，二甲基亞砜與KSR的體積比為1-4 :1-4 13-18 ;較佳地，所述海藻糖的KSR溶液的濃度為O. 5 10mol/l，所述海藻糖的KSR溶液，二甲基亞砜與KSR的體積比為1-4 :1_4 :13-18 ；更佳地，所述海藻糖的KSR溶液的濃度為O. 5 8mol/l，所述海藻糖的KSR溶液，二甲基亞砜與 KSR 的體積比為 1-1. 5 :1-1. 5 : 9-11。在另一優選例中，所述凍存液由海藻糖的KSR溶液，二甲基亞砜與KSR混合均勻后配制而成，其中，所述海藻糖的KSR溶液的濃度為廣3 mol/Ι，所述海藻糖的KSR溶液，二甲基亞砜與KSR的體積比為I :0. 8-1. 2 :7-10。在另一優選例中，所述凍存液由海藻糖的KSR溶液，二甲基亞砜與KSR混合均勻后配制而成，其中，所述海藻糖的KSR溶液的濃度為2mol/l，所述海藻糖的KSR溶液，二甲基亞砜與KSR的體積比為I :1 :8。組織凍存凍存技術是生物學保存物種的重要手段。如果在不加任何條件下直接凍存組織/細胞時，細胞內和外環境中的水都會形成冰晶，導致細胞內發生機械損傷、電解質升高、滲透壓改變、脫水、PH改變、蛋白變性等，嚴重時引起細胞死亡。如向培養液加入保護劑，可使冰點降低。在緩慢的凍結條件下，能使細胞內水份在凍結前透出細胞，貯存在-130°C以下的低溫中能減少冰晶的形成。組織/細胞凍存中最重要的部分是凍存液。本發明采用滲透劑與非滲透劑結合的方法凍存組織，能夠保證從復蘇的組織中培養出適用于臨床的干細胞。組織凍存時可采用常規的設備和方法進行。在優選例中，可采用程序降溫法，降溫盒材質通常為聚碳酸脂、高密度聚乙烯和泡沫，并需要異丙醇和機械冷凍裝置。冷卻速率可調，并且可以重復進行，從而滿足了組織凍存和復蘇的需要。一種典型的降溫程序為降溫速率-I至_2°C /min ;當溫度到達_25°C以下時，可調至_5至-10°C /min ;當溫度達到_40°C時，可以放入_80°C冰箱內保存或當溫度達到-100°C時，可以迅速浸入液氮中。組織在_80°C冰箱內可以保存半年或更久，在液氮中可以長期保存達數十年或更久。組織庫如本發明所用，“組織庫” 一詞指經一定程序降溫后、長期保存在特定凍存液中的組織儲存。組織庫中的組織可以來源于人，采用深低溫儲藏組織以保持其活力，供移植用。組織復蘇如本發明所用，“組織復蘇”一詞是指休眠的組織重新活化的過程。一般采用本領域技術人員所熟知的程序即快速復蘇法，將裝有組織和凍存液的冷凍管迅速由液氮或-80°C冰箱轉入到溫水浴中，較佳地37°C _40°C，不定時攪拌加速解凍；組織完全解凍后，對冷凍管進行消毒；將解凍后的組織進行清洗，接種到細胞培養瓶，CO2孵箱中培養，細胞由組織中爬出并生長。細胞貼壁如本發明所用，“細胞貼壁”一詞是指正常細胞的生長必須有可以貼附的支持物表面，細胞依靠自身分泌的或培養基中提供的貼附因子，可以在該表面上生長，繁殖。當細胞在該表面生長后，一般形成兩種形態，即成纖維樣細胞性或上皮樣細胞。貼壁生長有接觸抑制的現象，在動物細胞培養中，要用胰蛋白酶處理，使貼壁細胞脫落。而腫瘤細胞就沒有這些特性，可以懸浮培養。干細胞抗原檢測用本發明方法凍存的脂肪組織在復蘇后，接種到細胞培養瓶，CO2孵箱中培養，干細胞由組織中爬出并貼壁生長，消化傳代，通過細胞表面抗原的檢測加以驗證干細胞的純·度。脂肪干細胞具有多種特異性抗原和受體，主要有⑶29、⑶73、⑶49d、⑶90等。⑶34抗原是一種高度糖基化I型跨膜蛋白，它選擇性的表達于人類造血干細胞(HSC)，祖細胞(PC)和血管內皮細胞(EC)表面，帶有CD34的脂肪干細胞在總干細胞的比例優選為彡2%，更佳地，(I. 5%。⑶45存在于所有造血細胞的表面，包括造血干細胞和破骨細胞。帶有⑶45的脂肪干細胞在總干細胞的比例優選為< O. 1%。CD14是一種存在于單核細胞、巨噬細胞等細胞表面的白細胞分化抗原，帶有CD14的脂肪干細胞在總干細胞的比例優選為< 5%，較佳地，(3% ;更佳地，(I. 5%。⑶29、⑶73、⑶49d、⑶105等主要存在于脂肪間充質干細胞表面。帶有⑶29的脂肪干細胞在總干細胞的比例優選為> 95%，更佳地> 98%，最佳地彡 99. 5%。帶有⑶73的脂肪干細胞在總干細胞的比例優選為彡95%，更佳地彡98%，最佳地
彡 99%ο帶有⑶90的脂肪干細胞在總干細胞的比例優選為> 95%，更佳地> 98%，最佳地
彡 99%ο帶有⑶49d的脂肪干細胞在總干細胞的比例優選為> 95%，更佳地> 98%，最佳地
彡 99%ο本領域內技術人員可以使用通用的方法檢測脂肪干細胞的純度和分化程度，如流式細胞儀法。檢測時，加入不同的與有針對性的特異抗體，抗體可以是完整的單克隆或多克隆抗體，也可以是具有免疫活性的抗體片段，如Fab’或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人,美國專利No. 4，946，778);或嵌合抗體,如具有鼠抗體結合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。加入抗體與細胞表面的抗原結合一定時間，用流式細胞儀對細胞進行自動分析和分選。自體移植組合物和施用方式本發明還提供了一種自體移植組合物，可用于抗衰老等多種用途。自體移植組合物包括有效量的、由本發明凍存液保存后并復蘇的脂肪組織獲得的脂肪干細胞，在一個優選例中還可以包括至少一種藥學上可接受的載體或稀釋劑。在制備這些組合物時，通常將活性成分與賦形劑混合，或用賦形劑稀釋，對于含脂肪干細胞的組合物，優選形式為液態劑型配制好的自體移植組合物可以通過常規途徑進行給藥或施用，其中包括(但并不限于)肌內、腹膜內、靜脈內、皮下、皮內、或局部給藥。使用本發明的自體移植組合物時，是將安全有效量的脂肪干細胞施用于人，其中該安全有效量通常為IO5-IO8細胞/人/次，更佳地為IO6-IO7細胞/人/次。當然，具體劑量還應考慮施用途徑、施用對象的健康狀況等因素，這些都是熟練醫師技能范圍之內的。本發明的主要優點包括
(I)凍存液成分清晰，包含滲透性保護劑和非滲透性保護劑，不含對脂肪組織有害的成分；(2)凍存液可以維持凍存的脂肪組織內細胞的活性；(3)由凍存復蘇后的脂肪組織后的干細胞生長狀態良好，細胞抗原特征保持穩定，純度高；(4)從復蘇的脂肪組織中培養的干細胞能夠適用于臨床。(5)脂肪組織直接凍存可以保存組織的原始狀態，成分更接近原始組成，維持組織內生物大分子、細胞和組織微觀結構的穩定性。下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數是重量百分比和重量份數。實施例I脂肪組織的凍存實驗材料脂肪組織從手術室取新鮮無菌脂肪組織20ml凍存液80vol%KSR+10vol%DMS0+10vol%海藻糖的KSR溶液，其中海藻糖的KSR溶液的濃度為2mol/l。實驗分組A組從新鮮的脂肪組織提取細胞并培養B組從凍存后的脂肪組織提取細胞并培養實驗方法(I)新鮮脂肪組織的處理無菌條件下將新鮮的脂肪組織置無菌瓶中，用DPBS或生理鹽水洗滌3-4次，以去除脂肪組織表面的雜細胞等。然后用滅過菌的剪刀剪碎組織塊(約Imm3大小即可)，以利于組織的凍存。將剪碎的組織平均分成兩組A組和B組。(2) A組接種培養將A組脂肪組織用細胞完全培養基接種于75ml培養瓶中，置于37°C，CO2培養箱中培養。3天后給組織全量換液，記錄細胞3天后、6天后、9天后、12天后的生長狀況，貼壁率，并拍照記錄，結果如圖I所示。待細胞生長貼壁到一定密度(細胞貼壁面積占培養瓶培養面積的50%-60%)時，將培養瓶中組織去除，繼續生長3天，并對貼壁細胞進行處理、傳代。采用胰蛋白酶將貼壁的細胞進行消化，并將消化后的細胞按照1:3的比例進行接種、傳代。當P3代細胞生長達到貼壁80%_90% (細胞貼壁面積占培養瓶培養面積的比例)時，無菌條件下消化、收集細胞，PBS將細胞懸浮，并吸取少量懸液，臺盼藍染色、計數。將細胞懸液離心，凍存P3代細胞。A組最終獲得的P3代細胞量的結果如表I所示。(3) B 組凍存用含有特定組分的凍存液，采用程序降溫法，將B組脂肪組 織凍存，O. 5ml凍存液+0.5ml脂肪(1:1)，將凍存組織放入程序降溫盒里，置于_80°C冰箱內保存3個月。該程序降溫盒保持_1°C /min的降溫速率，次日移入液氮罐。實施例2脂肪組織的復蘇和接種3個月后，取裝有凍存的脂肪組織的凍存管快速置于37°C水浴中，待組織溶解后，取出組織，采用DMEM (Sigma公司)洗滌殘余的凍存液。將復蘇的組織接種于同A組同樣大小、規格的培養瓶中，加入培養基，置于37°C，CO2培養箱中培養。組織接種，3天后將組織全量換液。鏡下觀察細胞的貼壁生長狀況。同樣每隔3天做一次記錄，并拍照。結果如圖2所示。3天后未發現貼壁細胞；6天后發現極少貼壁細胞，貼壁細胞呈長梭形；9天后細胞貼壁量增加，細胞生長良好；12天后較多貼壁細胞，貼壁約為65% (細胞貼壁面積占培養瓶培養面積的比例)。待細胞生長貼壁到一定密度(貼壁50%_60%)時，將培養瓶中組織去除，繼續生長3天，并對貼壁細胞進行處理、傳代。采用胰蛋白酶將貼壁的細胞進行消化，并將消化后的細胞按照1:3的比例進行接種、傳代。當細胞的P3代細胞生長達到貼壁80%_90%時，無菌條件下消化、收集細胞，PBS將細胞懸浮，并吸取少量懸液，臺盼藍染色、計數。B組最終獲得的P3代細胞量的結果如表I所示,與A組相比,細胞量基本相同。將細胞懸液離心，凍存P3代細胞。表IA組和B組獲得的P3代細胞量
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P3 代細胞量 2. 43 X IO8~ 2. IXlO8實施例3流式細胞儀檢測取上述凍存的P3代細胞，復蘇后做成細胞懸液，做流式檢測，以測定所獲得細胞為脂肪間充質干細胞，并進行細胞在細胞純度上的鑒定。具體地，取細胞制作成細胞懸液，調整密度為I X IO5IiiI/1,于800r/min (120g)條件下離心5min,棄掉上清,用4°C的冷D-Hanks洗滌重懸細胞，再次將細胞懸液以800r/min，離心5min，之后棄去上清。然后用D-Hanks將細胞重懸至lmL，加入抗體，用流式細胞儀檢測細胞表面標記。加入的抗體分別為人抗CD29、CD73、CD49d、CD90、CD14、CD45、CD34、Actin 和 HLA-DR。結果如圖 3 和表 2 所示。其中 CD29、CD73、CD49d、CD90 均為脂肪干細胞的陽性指標，CD14、CD45、CD34、Actin, HLA-DR均為陰性指標。采用同樣的方法對實施例I中A組最終獲得的P3代細胞進行檢測，結果如表2所
/Jn ο表2流式結果
權利要求
1.一種凍存液，其特征在于，所述凍存液包含以下組分海藻糖、二甲基亞砜和血清替代物KSR。
2.如權利要求I所述的凍存液，其特征在于，所述海藻糖的濃度為O.05^2mol/l ;所述二甲基亞砜與所述血清替代物KSR的體積比為1:廣10。
3.如權利要求2所述的凍存液，其特征在于，所述海藻糖的濃度為O.Γ0. 5mol/l ;所述二甲基亞砜與所述血清替代物KSR的體積比為1:廣5。
4.權利要求f3任一項所述凍存液的用途，其特征在于，它被用于長期保存脂肪組織和/或建立脂肪組織庫。
5.一種脂肪組織混合物，其特征在于，所述混合物包括以下組分 脂肪組織，和 權利要求Γ3任一項所述的凍存液。
6.一種脂肪組織庫，其特征在于，所述組織庫含有權利要求5所述的脂肪組織混合物。
7.權利要求6所述的脂肪組織庫的用途，其特征在于，它被用于長期保存脂肪組織。
8.一種脂肪組織的凍存方法，其特征在于，包括步驟 (i)對獲得的含脂肪干細胞的脂肪組織材料進行洗滌，從而獲得去除了表面雜細胞的脂肪組織； (ii)將步驟(i)得到的脂肪組織剪碎，得到O.8^1. 5mm3的組織塊； (iii)將步驟(ii)得到的組織塊與權利要求廣3任一項所述的凍存液進行混合，得到脂肪組織混合物； (iv)將步驟(iii)得到的脂肪組織混合物降溫后，于_70°C -200°C保存。
9.如權利要求8所述的凍存方法，其特征在于，所述步驟(iii)中所述組織塊與所述凍存液的體積比為1:0. 8 2。
10.如權利要求8所述的凍存方法，其特征在于，所述步驟(iv)中將脂肪組織混合物放入程序降溫盒，采用程序降溫法梯度降溫，_80°C冰箱或液氮內保存。
全文摘要
本發明提供了一種可維持細胞活性的組織凍存液。本發明的凍存液包括海藻糖、二甲基亞砜和血清替代物KSR。用本發明凍存液保存的組織復蘇后獲得的脂肪干細胞具有貼壁生長好、純度高、分化能力強的優點。
文檔編號A01N1/02GK102907416SQ20121027211
公開日2013年2月6日 申請日期2012年8月1日 優先權日2012年8月1日
發明者曹衛, 張麗, 張露億, 趙光宇, 李玉娟 申請人:臻景生物技術(上海)有限公司, 臻景生物技術(無錫)有限公司