細胞凍存液及細胞凍存方法
【專利摘要】本發明涉及一種細胞凍存液及細胞凍存方法。該細胞凍存液按體積百分數包括90~95%的全細胞培養液及5~10%二甲基亞砜，其中，所述全細胞培養液包括體積比為9:1的細胞培養基和胎牛血清。這種細胞凍存液中的全細胞培養液為細胞生命代謝提供必須的營養物質，二甲基亞砜作為防凍劑，通過合理配比全細胞培養液中細胞培養基與胎牛血清的量及全細胞培養液與防凍劑的量，使得胎牛血清含量較低的全細胞培養液能夠為細胞生命代謝提供必須的、足夠的營養物質，而合適的防凍劑的量能夠防止或減少冷凍冰晶對細胞的損傷作用，提高細胞的存活率，且該細胞凍存液不含易造成污染的血清，污染風險較低。
【專利說明】細胞凍存液及細胞凍存方法【技術領域】
[0001]本發明涉及細胞凍存技術，特別是涉及一種細胞凍存液及細胞凍存方法。
【背景技術】
[0002]細胞凍存及復蘇是細胞培養技術中的重要技術之一，細胞凍存是保存培養細胞的一種方法。細胞凍存及復蘇的基本原則是慢凍快融，這樣可以最大限度的保存細胞活力。
[0003]細胞凍存液是細胞凍存時必須使用的一種溶液，其作用是將需要凍存的細胞懸浮于凍存液，供給細胞生命代謝所必須的營養物質，同時可以防止或減少冷凍冰晶對細胞的損傷作用。為了為細胞提供足夠的營養，保持細胞的存活率，現有的細胞凍存液一般加入較多的血清作為細胞生長的營養物質，血清占細胞凍存液的體積一般從20%~90%不等，不僅價格昂貴，還易導致污染風險較高。
【發明內容】
[0004]基于此，有必要提供一種提高細胞存活率，且污染風險較低的細胞凍存液。
[0005]進一步，提供一種細胞凍存方法。
[0006]一種細胞凍存液，按體積百分數包括以下組分:
[0007]全細胞培養液 90~95% ；
[0008]二甲基亞砜5~10%;
[0009]其中，所述全細胞培養液包括體積比為9:1的細胞培養基和胎牛血清。
[0010]在其中一個實施例中，按體積百分數包括以下組分:
[0011]全細胞培養液 90%;
[0012]二甲基亞砜10%;
[0013]其中，所述全細胞培養液包括體積比為9:1的細胞培養基和胎牛血清。
[0014]在其中一個實施例中，所述細胞培養基包括下述組分:
[0015]無水氯化鈣265.00mg/L ；硝酸鐵0.10mg/L ;氯化鉀400.00mg/L ；無水硫酸鎂97.67mg/L ;氯化鈉 6400.00mg/L ;無水磷酸二氫鈉 109.00mg/L ;丁二酸 75.00mg/L ;丁二酸鈉 100.00mg/L ；L-鹽酸精氨酸 84.00mg/L ；L-鹽酸胱氨酸 63.00mg/L ;甘氨酸 30.00mg/L ；L-鹽酸組氨酸42.00mg/L ;L_異亮氨酸105.00mg/L ;L_亮氨酸105.00mg/L ;L_鹽酸賴氨酸146.00mg/L ；L-甲硫氨酸 30.00mg/L ；L-苯丙氨酸 66.00mg/L ；L-絲氨酸 42.00mg/L ；L-蘇氨酸 95.00mg/L ；L-色氨酸 16.0Omg/L ；L-酪氨酸 72.0Omg/L ；L-纟顏氨酸 94.0Omg/L ；D-泛酸鈣4.0Omg/L ;酒石酸膽堿7.20mg/L ;葉酸mg/L ;肌醇7.20mg/L ;煙酰胺4.0Omg/L ;核黃素0.40mg/L ;鹽酸硫胺4.00mg/L ;鹽酸吡卩多辛4.00mg/L ;葡萄糖1000.00mg/L ;丙酮酸鈉110.00mg/L 及酚紅 9.30mg/L。
[0016]在其中一個實施例中，所述細胞培養基包括下述組分:
[0017]氯化鈣116.6mg/L ;硫酸銅0.0013mg/L ;九水合硝酸鐵0.05mg/L ;七水合硫酸亞鐵0.417mg/L ;氯化鉀311.8mg/L ;氯化鎂28.64mg/L ;無水硫酸鎂48.84mg/L ;氯化鈉6999.6mg/L ;無水磷酸二氫鈉54.35mg/L ;無水磷酸氫二鈉71.02mg/L ;七水合硫酸鋅0.432mg/L ；L-鹽酸精氨酸147.5mg/L ；L-胱氨酸鹽酸鹽31.29mg/L ；L-谷氨酰胺365mg/L ；甘氨酸18.75mg/L ；L-鹽酸組氨酸31.48mg/L ；L-異亮氨酸54.47mg/L ；L-亮氨酸59.05mg/L ；L-鹽酸賴氨酸91.25mg/L ；L-甲硫氨酸17.24mg/L ；L-苯丙氨酸35.48mg/L ；L-絲氨酸26.25mg/L ；L-蘇氨酸 53.45mg/L ；L-丙氨酸 4.45mg/L ；L-門冬酰胺 7.5mg/L ；L-門冬氨酸6.65mg/L ;L-鹽酸半胱氨酸 17.56mg/L ;L_ 谷氨酸 7.35mg/L ;L_ 脯氨酸 17.25mg/L ;L_ 色氨酸9.02mg/L ；L-酪氨酸mg/L ；L-繳氨酸52.85mg/L ;無水葡萄糖3151mg/L ;次黃嘌呤2mg/L ;亞油酸 0.042mg/L ;硫辛酸 0.105mg/L ;酚紅 8.lmg/L ;1，4- 丁二胺二鹽酸鹽 0.08Img/L ;丙酮酸鈉55mg/L ;維生素H0.0035mg/L ；D-泛酸韓2.24mg/L ;氯化膽堿8.98mg/L ;葉酸
2.65mg/L ;肌醇12.6mgL ;煙酰胺2.02mg/L ;鹽酸批卩多醒2mg/L ;鹽酸批卩多醇0.03mgL ;核黃素 0.219mg/L ;鹽酸硫胺 2.17mg/L ;胸苷 0.365mg/L 及維生素 B120.68mg/L。
[0018]在其中一個實施例中，所述細胞培養基包括下述組分:
[0019]四水硝酸|丐100mg/L ;氯化鉀400mg/L ;無水硫酸鎂48.84mg/L ;氯化鈉6000mg/L ；無水磷酸氫二鈉800mg/L ；L-鹽酸精氨酸200mg/L ；L-門冬酰胺50mg/L ；L-門冬氨酸20mg/L ；L-胱氨酸鹽酸鹽65.15mg/L ；L-谷氨酸20mg/L ；L-谷氨酰胺300mg/L ;甘氨酸10mg/L ；L-鹽酸組氨酸15mg/L ；L-輕脯氨酸20mg/L ；L-異亮氨酸50mg/L ；L-鹽酸賴氨酸40mg/L ；L-甲硫氨酸15mg/L ；L-苯丙氨酸15mg/L ；L-脯氨酸20mg/L ；L-絲氨酸30mg/L ；L-蘇氨酸20mg/L ；L-色氨酸5mg/L ；L-酪氨酸20mg/L ；L-繳氨酸20mg/L ;無水葡萄糖2000mg/mL ;還原型谷胱甘肽lmg/L ;苯酹紅5mg/L ；D-生物素0.2mg/L ;泛酸韓0.25mg/L ;氯化膽堿3mg/L ;葉酸lmg/L ;肌醇35mg/L ;煙酰胺lmg/L ;對氨基苯甲酸lmg/L ;維生素B6lmg/L ;維生素B20.2mg/L ;維生素 B1 lmg/L 及維生素 B120.005mg/L。
[0020]一種細胞凍存方 法，包括如下步驟:
[0021]將對數期的細胞用PBS緩沖液進行洗滌，并將所述洗滌后的對數期的細胞用上述細胞凍存液進行懸浮，然后進行細胞計數，并用所述細胞凍存液進行稀釋，得到濃度為0.5飛X IO6個/毫升的對數期的細胞與所述細胞凍存液的混合液；
[0022]將所述濃度為0.5飛X IO6個/毫升的對數期的細胞與所述細胞凍存液的混合液分裝于ImL的無菌凍存管中；
[0023]將所述裝有濃度為0.5飛X IO6個/毫升的對數期的細胞與所述細胞凍存液的混合液的無菌凍存管放置于程序降溫盒中降溫至_80°C，并于_80°C下放置24小時~96小時，然后將所述無菌凍存管轉移至液氮中保存。
[0024]在其中一個實施例中，所述細胞為貼壁細胞，所述將對數期的細胞用PBS緩沖液進行洗滌的步驟為:將所述貼壁細胞培養至對數期后，除去培養皿中的細胞培養液，加入PBS緩沖液進行洗滌，然后除去所述PBS緩沖液。
[0025]在其中一個實施例中，將對數期的細胞用PBS緩沖液進行洗滌的步驟之后還包括細胞消化的步驟，所述細胞消化的步驟為:向所述貼壁細胞的表面加入0.5^2mL濃度為0.25%的胰蛋白酶溶液，于37°C培養箱內消化2飛分鐘，再加入3~5mL所述細胞凍存液的全細胞培養液，以終止所述胰蛋白酶的消化作用，然后將所述貼壁細胞吹散，并將所述貼壁細胞與所述全細胞培養液的混合液于500轉/分鐘~1000轉/分鐘下離心3分鐘~10分鐘，棄去上清得到細胞沉淀。[0026]在其中一個實施例中，所述胰蛋白酶溶液中含有濃度為0.38%的乙二胺四乙酸。
[0027]在其中一個實施例中，所述細胞為懸浮細胞，所述將對數期的細胞用PBS緩沖液進行洗滌的步驟具體為:將所述懸浮細胞培養至對數期后，將含有對數期的細胞的細胞培養液于500轉/分鐘~1000轉/分鐘下離心3分鐘~10分鐘，棄去上清得到細胞沉淀，加入PBS緩沖液，再于500轉/分鐘~1000轉/分鐘下離心3分鐘~10分鐘，棄去上清得到洗滌后的細胞沉淀。
[0028]上述細胞凍存液中的全細胞培養液為細胞生命代謝提供必須的營養物質，二甲基亞砜作為防凍劑，通過合理配比全細胞培養液中細胞培養基與胎牛血清的量及全細胞培養液與防凍劑的量，使得胎牛血清含量較低的全細胞培養液能夠為細胞生命代謝提供必須的、足夠的營養物質，而合適的防凍劑的量能夠防止或減少冷凍冰晶對細胞的損傷作用，提高細胞的存活率，且該細胞凍存液不含易造成污染的血清，污染風險較低。
【專利附圖】
【附圖說明】[0029]圖1為一實施方式的細胞凍存方法流程圖。
【具體實施方式】
[0030]為使本發明的上述目的、特征和優點能夠更加明顯易懂，下面結合附圖對本發明的【具體實施方式】做詳細的說明。在下面的描述中闡述了很多具體細節以便于充分理解本發明。但是本發明能夠以很多不同于在此描述的其它方式來實施，本領域技術人員可以在不違背本發明內涵的情況下做類似改進，因此本發明不受下面公開的具體實施的限制。
[0031]一實施方式的細胞凍存液，按體積百分數包括以下組分:全細胞培養液90、5%及二甲基亞砜5~10%。
[0032]全細胞培養液包括細胞培養基和胎牛血清，細胞培養基和胎牛血清的體積比為9:1。
[0033]全細胞培養液為細胞生命代謝提供必須的營養物質。二甲基亞砜作為防凍劑，能提高細胞膜對水的通透性，利于細胞內的水分滲出細胞外，減少細胞內冰晶的形成，從而減少由于冰晶造成的細胞損傷。
[0034]上述細胞凍存液通過合理配比營養物質全細胞培養液中的細胞培養液與胎牛血清的量及全細胞培養液及防凍劑二甲基亞砜的量，能夠為細胞提供必須的營養物質并能夠減少由于冰晶造成的細胞損傷，從而能夠提高細胞的存活率。并且，由于該營養物質不含有昂貴的血清，污染風險較低，同時成本較低，有利于降低凍存成本。
[0035]優選地，全細胞培養液的體積百分數為90%，二甲基亞砜的體積百分數為10%。
[0036]優選地，細胞培養基包括以下組分:
[0037]氯化鈣116.6mg/L ;硫酸銅0.0013mg/L ;九水合硝酸鐵0.05mg/L ;七水合硫酸亞鐵0.417mg/L ;氯化鉀311.8mg/L ;氯化鎂28.64mg/L ;無水硫酸鎂48.84mg/L ;氯化鈉6999.6mg/L ;無水磷酸二氫鈉54.35mg/L ;無水磷酸氫二鈉71.02mg/L ;七水合硫酸鋅
0.432mg/L ；L-鹽酸精氨酸147.5mg/L ；L-胱氨酸鹽酸鹽31.29mg/L ；L-谷氨酰胺365mg/L ；甘氨酸18.75mg/L ；L-鹽酸組氨酸31.48mg/L ；L-異亮氨酸54.47mg/L ；L-亮氨酸59.05mg/L ；L-鹽酸賴氨酸91.25mg/L ；L-甲硫氨酸17.24mg/L ；L-苯丙氨酸35.48mg/L ；L-絲氨酸26.25mg/L ；L-蘇氨酸 53.45mg/L ；L-丙氨酸 4.45mg/L ；L-門冬酰胺 7.5mg/L ；L-門冬氨酸
6.65mg/L ;L-鹽酸半胱氨酸 17.56mg/L ;L_ 谷氨酸 7.35mg/L ;L_ 脯氨酸 17.25mg/L ;L_ 色氨酸9.02mg/L ；L-酪氨酸mg/L ；L-繳氨酸52.85mg/L ;無水葡萄糖3151mg/L ;次黃嘌呤2mg/L ;亞油酸 0.042mg/L ;硫辛酸 0.105mg/L ;酚紅 8.lmg/L ;1，4- 丁二胺二鹽酸鹽 0.08Img/L ;丙酮酸鈉55mg/L ;維生素H0.0035mg/L ；D-泛酸韓2.24mg/L ;氯化膽堿8.98mg/L ;葉酸
2.65mg/L ;肌醇12.6mg/L ;煙酰胺2.02mg/L ;鹽酸批卩多醒2mg/L ;鹽酸批卩多醇0.03mgL ;核黃素 0.219mg/L ;鹽酸硫胺 2.17mg/L ;胸苷 0.365mg/L 及維生素 B120.68mg/L。
[0038]在其他實施方式中，細胞培養基包括以下組分:氯化鈣116.6mg/L;硫酸銅0.0013mg/L ;九水合硝酸鐵0.05mg/L ;七水合硫酸亞鐵0.417mg/L ;氯化鉀311.8mg/L ;氯化鎂28.64mg/L ;無水硫酸鎂48.84mg/L ;氯化鈉6999.6mg/L ;無水磷酸二氫鈉54.35mg/L ;無水磷酸氫二鈉71.02mg/L ;七水合硫酸鋅0.432mg/L ；L-鹽酸精氨酸147.5mg/L ；L-胱氨酸鹽酸鹽31.29mg/L ；L-谷氨酰胺365mg/L ;甘氨酸18.75mg/L ；L-鹽酸組氨酸31.48mg/L ；L-異亮氨酸54.47mg/L ；L-亮氨酸59.05mg/L ；L-鹽酸賴氨酸91.25mg/L ；L-甲硫氨酸17.24mg/L ；L-苯丙氨酸 35.48mg/L ；L-絲氨酸 26.25mg/L ；L-蘇氨酸 53.45mg/L ；L-丙氨酸4.45mg/L ；L-門冬酰胺7.5mg/L ；L-門冬氨酸6.65mg/L ；L-鹽酸半胱氨酸17.56mg/L ；L-谷氨酸 7.35mg/L ；L-脯氨酸 17.25mg/L ；L-色氨酸 9.02mg/L ；L-酪氨酸 mg/L ；L-繳氨酸52.85mg/L ;無水葡萄糖3151mg/L ;次黃嘌呤2mg/L ;亞油酸0.042mg/L ;硫辛酸0.105mg/L ;酚紅 8.lmg/L ；1, 4-丁二胺二鹽酸鹽 0.08lmg/L ;丙酮酸鈉 55mg/L ;維生素 H0.0035mg/L ；D-泛酸鈣 2.24mg/L ;氯化膽堿 8.98mg/L ;葉酸 2.65mg/L ;肌醇 12.6mg/L ;煙酰胺 2.02mg/L ;鹽酸吡B多醒2mg/L ;鹽酸吡B多醇0.03mg/L ;核黃素0.219mg/L ;鹽酸硫胺2.17mg/L ;胸苷0.365mg/L 及維生素 B120.68mg/L。
[0039]在另外的實施方 式中，細胞培養基包括以下組分:
[0040]四水硝酸鈣100mg/L ;氯化鉀400mg/L ;無水硫酸鎂48.84mg/L ;氯化鈉6000mg/L ；無水磷酸氫二鈉800mg/L ；L-鹽酸精氨酸200mg/L ；L-門冬酰胺50mg/L ；L-門冬氨酸20mg/L ；L-胱氨酸鹽酸鹽65.15mg/L ；L-谷氨酸20mg/L ；L-谷氨酰胺300mg/L ;甘氨酸10mg/L ；L-鹽酸組氨酸15mg/L ；L-輕脯氨酸20mg/L ；L-異亮氨酸50mg/L ；L-鹽酸賴氨酸40mg/L ；L-甲硫氨酸15mg/L ；L-苯丙氨酸15mg/L ；L-脯氨酸20mg/L ；L-絲氨酸30mg/L ；L-蘇氨酸20mg/L ；L-色氨酸5mg/L ；L-酪氨酸20mg/L ；L-繳氨酸20mg/L ;無水葡萄糖2000mg/mL ;還原型谷胱甘肽lmg/L ;苯酹紅5mg/L ；D-生物素0.2mg/L ;泛酸韓0.25mg/L ;氯化膽堿3mg/L ;葉酸lmg/L ;肌醇35mg/L ;煙酰胺lmg/L ;對氨基苯甲酸lmg/L ;維生素B6lmg/L ;維生素B20.2mg/L ;維生素 B1 lmg/L 及維生素 B120.005mg/L。
[0041]上述細胞凍存液的全細胞培養液中的細胞培養基分別采用上述三種不同的配方時，上述細胞凍存液能夠適用于293細胞、Hela細胞、MCF-7細胞、CHO細胞、Raji細胞、Daudi細胞、HL60細胞、K562細胞等多種細胞，適用性廣泛。
[0042]請參閱圖1，一種細胞凍存方法，包括如下步驟:
[0043]步驟SllO:將對數期的細胞用PBS緩沖液進行洗滌，并將洗滌后的對數期的細胞用上述細胞凍存液進行懸浮，然后進行細胞計數，并用上述細胞凍存液進行稀釋，得到濃度為0.5飛X IO6個/毫升的對數期的細胞與細胞凍存液的混合液。
[0044]欲凍存的細胞應為生長良好的狀態，因此取對數期的細胞凍存。在細胞凍存前，先用PBS緩沖液(磷酸鹽緩沖液)對細胞進行清洗，以除去細胞培養基。
[0045]當欲凍存的細胞為懸浮細胞時，將懸浮細胞培養至對數期后，將含有對數期的細胞的細胞培養液于500轉/分鐘~1000轉/分鐘下離心3分鐘~10分鐘，棄去上清得到細胞沉淀，然后加入PBS緩沖液重懸細胞，再于500轉/分鐘~1000轉/分鐘下離心3分鐘~10分鐘，棄去上清得到洗滌后的細胞沉淀。將洗滌后的細胞沉淀用上述細胞凍存液進行懸浮，然后進行細胞計數，并用上述細胞凍存液進行稀釋，得到濃度為0.5飛X IO6個/毫升的對數期的細胞與細胞凍存液的混合液。
[0046]當欲凍存的細胞為貼壁細胞時，將該貼壁細胞培養至對數期后，用移液槍或移液管吸掉培養皿中的細胞培養液，向培養皿中加入PBS緩沖液，輕輕晃動進行洗滌，然后用移液槍或移液管除去PBS緩沖液。
[0047]洗滌后，貼壁細胞仍然貼附于培養皿上，需要進行細胞消化，以使培養皿上的貼壁細胞分散。細胞消化的步驟具體為:向貼壁細胞的表面加入0.5^2mL濃度為0.25%的胰蛋白酶溶液，于37°C培養箱內消化2飛分鐘，再加入3~5mL上述細胞凍存液的全細胞培養液，以終止胰蛋白酶的消化作用，然后將貼壁細胞吹散，并將貼壁細胞與全細胞培養液的混合液于500轉/分鐘~1000轉/分鐘下離心3分鐘~10分鐘，棄去上清得到細胞沉淀。將該細胞沉淀用上述細胞凍存液進行懸浮，然后進行細胞計數，并用上述細胞凍存液進行稀釋，得到濃度為0.5飛X IO6個/毫升的對數期的細胞與細胞凍存液的混合液。
[0048]濃度為0.25%的胰蛋白酶溶液為將一定量的胰蛋白酶溶解于PBS緩沖液中，其中，胰蛋白酶的質量與PBS緩沖液的體積的比值為0.25g: 100mL。
[0049]消化過度則對細胞的活性損傷較大，并有部分細胞漂浮，隨棄去的胰蛋白酶流失；消化不足則細胞難于從培養皿上吹下，反復吹打同樣也會損傷細胞活性。因此消化的時間優選為2~5分鐘。消化時間為至顯微鏡下觀察細胞變圓即可。
[0050]優選地，當貼壁細胞在培養皿上貼壁太緊時，為了便于將貼壁細胞分散，胰蛋白酶溶液中含有濃度為0.38%的乙二胺四乙酸(EDTA)。乙二胺四乙酸的質量與胰蛋白酶溶液中的PBS緩沖液的體積之比為0.038g: 100mL。
[0051]細胞濃度過密或過稀都會降低細胞的存活率，用上述細胞凍存液進行稀釋，使細胞的濃度0.5-5X 1O6個/毫升，以保證細胞的存活率。
[0052]步驟S120:將濃度為0.5-5X 1O6個/毫升的對數期的細胞與細胞凍存液的混合液分裝于ImL的無菌凍存管中。
[0053]將濃度為0.5-5X 1O6個/毫升的對數期的細胞與細胞凍存液的混合液分裝入多個ImL的無菌凍存管中分別進行凍存，當需要進行復蘇使用時，根據需要取出一個或多個凍存了細胞的無菌凍存管，不會造成對其他凍存了細胞的無菌凍存管的污染。
[0054]步驟S130:將裝有濃度為0.5-5X 1O6個/毫升的對數期的細胞與上述細胞凍存液的混合液的多個無菌凍存管放置于程序降溫盒中降溫至_80°C，并于_80°C下放置24小時~96小時，然后將多個無菌凍存管轉移至液氮中保存。
[0055]裝有濃度為0.5-5X 1O6個/毫升的對數期的細胞與上述細胞凍存液的混合液的無菌凍存管放置于程序降溫盒中勻速降溫，有利于提高細胞的存活率。
[0056]裝有濃度為0.5-5X 1O6個/毫升的對數期的細胞與上述細胞凍存液的混合液的無菌凍存管于程序降溫盒中降溫至-80°C后，于-80°C下放置24小時~96小時，然后轉移至液氣中保存。
[0057]在進行細胞復蘇時，首先從液氮中取出所需的數量的無菌凍存管，將無菌凍存管立即放入37°C水浴中，搖動使凍存細胞在f 2分鐘內融化；然后于500-1000轉/分鐘下離心3~10分鐘，棄上清；加入1ml上述全細胞培養液重懸細胞，將該細胞與全細胞培養液的懸浮液加入8~12ml上述全細胞培養液中，于37°C下靜置培養16~24小時。
[0058]培養16~24小時后，于顯微鏡下觀察細胞復蘇后的狀態，更換全細胞培養液，繼續培養，2~3天后傳代培養。
[0059]當細胞為貼壁細胞時，于顯微鏡下觀察，80%以上的細胞貼壁生長后再更換全細胞
培養液。
[0060]上述細胞凍存方法使用包括體積分數為90-95%全細胞培養液和體積分數為5~10%的二甲基亞楓的細胞凍存液進行凍存細胞，有利于提高細胞的存活率，并降低污染風險。
[0061]并且全細胞培養液包括體積比為9:1的細胞培養基和胎牛血清，胎牛血清在細胞凍存液中的體積分數僅為擴9.5%，含量較低，使用血清含量較低的細胞凍存液，凍存成本低。
[0062]以下為具體實施例。
[0063]實施例1
[0064]1、將293細胞培養至對數期后，在無菌環境下，用電動移液管吸掉培養皿中的細胞培養液中，向培養皿中加入IOmL PBS緩沖液，輕輕晃動進行洗滌，然后用電動移液管除去PBS緩沖液；
[0065]2、在無菌環境下，向培養皿中的293細胞的表面均勻加入0.5mL濃度為0.25%的胰蛋白酶溶液，于37°C培養箱內消化2分鐘，向培養皿內加入3mL全細胞培養液，終止胰蛋白酶的消化作用，然后用電動移液管將293細胞從培養皿上吹散下來使293細胞懸浮于上述全細胞培養液中；其中，上述全細胞培養液包括體積比為9:1的細胞培養基和胎牛血清，細胞培養基包括下述組分:
[0066]無水氯化鈣265.00mg/L ；硝酸鐵0.10mg/L ;氯化鉀400.0Omg/L ；無水硫酸鎂97.67mg/L ;氯化鈉 6400.0Omg/L ;無水磷酸二氫鈉 109.0Omg/L ;丁二酸 75.0Omg/L ;丁二酸鈉 100.00mg/L ；L-鹽酸精氨酸 84.00mg/L ；L-鹽酸胱氨酸 63.00mg/L ;甘氨酸 30.00mg/L ；L-鹽酸組氨酸42.00mg/L ；L-異亮氨酸105.00mg/L ；L-亮氨酸105.00mg/L ；L-鹽酸賴氨酸146.00mg/L ；L-甲硫氨酸 30.00mg/L ；L-苯丙氨酸 66.00mg/L ；L-絲氨酸 42.0Omg/L ；L-蘇氨酸 95.0Omg/L ；L-色氨酸 16.0Omg/L ；L-酪氨酸 72.0Omg/L ；L-纟顏氨酸 94.0Omg/L ；D-泛酸鈣4.0Omg/L ;酒石酸膽堿7.20mg/L ;葉酸mg/L ;肌醇7.20mg/L ;煙酰胺4.0Omg/L ;核黃素0.40mg/L ;鹽酸硫胺4.0Omg/L ;鹽酸吡卩多辛4.0Omg/L ;葡萄糖1000.0Omg/L ;丙酮酸鈉110.0Omg/L 及酚紅 9.30mg/L ；
[0067]3、將293細胞與全細胞培養液的懸浮液轉移至15ml無菌離心管中，于500轉/分鐘下離心10分鐘，棄去上清液得到293細胞沉淀，將該293細胞沉淀用細胞凍存液進行懸浮，然后進行細胞計數，并用上述細胞凍存液進行稀釋，得到濃度為0.5 X IO6個/毫升的對數期的293細胞與細胞凍存液的混合液；其中，上述細胞凍存液按體積百分數包括90%的上述全細胞培養液及10%的二甲基亞砜；[0068]4、將濃度為0.5 X IO6個/毫升的對數期的293細胞與細胞凍存液的混合液分裝于ImL的無菌凍存管中；
[0069]5、將裝有濃度為0.5X IO6個/毫升的對數期的293細胞與上述細胞凍存液的混合液的多個無菌凍存管放置于程序降溫盒(Nalgene，貨號:5100_0001C)中，于_80°C下放置24小時，然后將多個無菌凍存管轉移至液氮中保存。
[0070]凍存一個月后，進行細胞復蘇，首先從液氮中取出I支無菌凍存管，將該無菌凍存管立即放入37°C水浴中，搖動使凍存細胞在I分鐘內融化；然后于500轉/分鐘下離心10分鐘，棄上清；加入1ml上述全細胞培養液重懸細胞，將該細胞與全細胞培養液的懸浮液加入8ml上述全細胞培養液中，于37°C下靜置培養24小時，測定細胞的存活率，存活率為90%。
[0071]實施例2
[0072]1、將MCF-7細胞培養至對數期后，在無菌環境下，用電動移液管吸掉培養皿中的細胞培養液中，向培養皿中加入15mL PBS緩沖液，輕輕晃動進行洗滌，然后用電動移液管除去PBS緩沖液；
[0073]2、在無菌環境下，向培養皿中的MCF-7細胞的表面均勻加入2mL濃度為0.25%的胰蛋白酶溶液，于37°C培養箱內消化5分鐘，向培養皿內加入5mL全細胞培養液，終止胰蛋白酶的消化作用，然后用電動移液管將MCF-7細胞從培養皿上吹散下來使MCF-7細胞懸浮于上述全細胞培養液中；其中，上述全細胞培養液包括體積比為9:1的細胞培養基和胎牛血清，細胞培養基包括下述組分:
[0074]氯化鈣116.6mg/L ;硫酸 銅0.0013mg/L ;九水合硝酸鐵0.05mg/L ;七水合硫酸亞鐵0.417mg/L ;氯化鉀311.8mg/L ;氯化鎂28.64mg/L ;無水硫酸鎂48.84mg/L ;氯化鈉6999.6mg/L ;無水磷酸二氫鈉54.35mg/L ;無水磷酸氫二鈉71.02mg/L ;七水合硫酸鋅0.432mg/L ；L-鹽酸精氨酸147.5mg/L ；L-胱氨酸鹽酸鹽31.29mg/L ；L-谷氨酰胺365mg/L ；甘氨酸18.75mg/L ；L-鹽酸組氨酸31.48mg/L ；L-異亮氨酸54.47mg/L ；L-亮氨酸59.05mg/L ；L-鹽酸賴氨酸91.25mg/L ；L-甲硫氨酸17.24mg/L ；L-苯丙氨酸35.48mg/L ；L-絲氨酸26.25mg/L ；L-蘇氨酸 53.45mg/L ；L-丙氨酸 4.45mg/L ；L-門冬酰胺 7.5mg/L ；L-門冬氨酸6.65mg/L ；L-鹽酸半胱氨酸 17.56mg/L ；L-谷氨酸 7.35mg/L ；L-脯氨酸 17.25mg/L ；L-色氨酸9.02mg/L ；L-酪氨酸mg/L ；L-繳氨酸52.85mg/L ;無水葡萄糖3151mg/L ;次黃嘌呤2mg/L ;亞油酸 0.042mg/L ;硫辛酸 0.105mg/L ;酚紅 8.lmg/L ;1，4- 丁二胺二鹽酸鹽 0.08Img/L ;丙酮酸鈉55mg/L ;維生素H0.0035mg/L ；D-泛酸韓2.24mg/L ;氯化膽堿8.98mg/L ;葉酸2.65mg/L ;肌醇12.6mg/L ;煙酰胺2.02mg/L ;鹽酸批卩多醒2mg/L ;鹽酸批卩多醇0.03mgL ;核黃素 0.219mg/L ;鹽酸硫胺 2.17mg/L ;胸苷 0.365mg/L 及維生素 B120.68mg/L ；
[0075]3、將MCF-7細胞與全細胞培養液的懸浮液轉移至15ml無菌離心管中，于1000轉/分鐘下離心3分鐘，棄去上清液得到MCF-7細胞沉淀，將該MCF-7細胞沉淀用細胞凍存液進行懸浮，然后進行細胞計數，并用上述細胞凍存液進行稀釋，得到濃度為5 X IO6個/毫升的對數期的MCF-7細胞與細胞凍存液的混合液；其中，上述細胞凍存液按體積百分數包括95%的上述全細胞培養液及5%的二甲基亞砜；
[0076]4、將濃度為5 X IO6個/毫升的對數期的MCF-7細胞與細胞凍存液的混合液分裝于ImL的無菌凍存管中；[0077]5、將裝有濃度為5X IO6個/毫升的對數期的MCF-7細胞與上述細胞凍存液的混合液的多個無菌凍存管放置于程序降溫盒(Nalgene，貨號:5100_0001C)中，于_80°C下放置96小時，然后將多個無菌凍存管轉移至液氮中保存。
[0078]凍存3個月后，進行細胞復蘇，首先從液氮中取出I支無菌凍存管，將該無菌凍存管立即放入37°C水浴中，搖動使凍存細胞在1.5分鐘內融化；然后于1000轉/分鐘下離心3分鐘，棄上清；加入1ml上述全細胞培養液重懸細胞，將該細胞與全細胞培養液的懸浮液加入12ml上述全細胞培養液中，于37°C下靜置培養16小時，測定細胞的存活率，存活率為85%。
[0079]實施例3
[0080]1、將HL60細胞培養至對數期后，將含有對數期的細胞的細胞培養液于800轉/分鐘下離心6min，棄去上清得到HL60細胞沉淀，然后加入12mL PBS緩沖液重懸細胞，再于800轉/分鐘下離心6min,棄去上清得到洗漆后的HL60細胞沉淀；
[0081]2、將洗滌后的HL60細胞沉淀用細胞凍存液進行懸浮，然后進行細胞計數，并用上述細胞凍存液進行稀釋，得到濃度為2X1O6個/毫升的對數期的HL60細胞與細胞凍存液的混合液；其中，上述細胞凍存液按體積百分數包括90%的全細胞培養液及10%的二甲基亞砜，該全細胞培養液包括體積比為9:1的細胞培養基和胎牛血清，細胞培養基包括下述組分:
[0082]四水硝酸鈣100mg/L ;氯化鉀400mg/L ;無水硫酸鎂48.84mg/L ;氯化鈉6000mg/L ；無水磷酸氫二鈉800mg/L ；L-鹽酸精氨酸200mg/L ；L-門冬酰胺50mg/L ；L-門冬氨酸20mg/L ；L-胱氨酸鹽酸鹽65.15mg/L ；L-谷氨酸20mg/L ；L-谷氨酰胺300mg/L ;甘氨酸10mg/L ；L-鹽酸組氨酸15mg/L ；L-輕脯氨酸20mg/L ；L-異亮氨酸50mg/L ；L-鹽酸賴氨酸40mg/L ；L-甲硫氨酸15mg/L ；L-苯丙氨酸15mg/L ；L-脯氨酸20mg/L ；L-絲氨酸30mg/L ；L-蘇氨酸20mg/L ；L-色氨酸5mg/L ；L-酪氨酸20mg/L ；L-繳氨酸20mg/L ;無水葡萄糖2000mg/mL ;還原型谷胱甘肽lmg/L ;苯酹紅5mg/L ；D-生物素0.2mg/L ;泛酸韓0.25mg/L ;氯化膽堿3mg/L ;葉酸lmg/L ;肌醇35mg/L ;煙酰胺lmg/L ;對氨基苯甲酸lmg/L ;維生素B6lmg/L ;維生素B20.2mg/L ;維生素 B1 lmg/L 及維生素 B120.005mgL ；
[0083]3、將濃度為2 X IO6個/毫升的對數期的HL60細胞與細胞凍存液的混合液分裝于ImL的無菌凍存管中；
[0084]4、將裝有濃度為2 X IO6個/毫升的對數期的HL60細胞與上述細胞凍存液的混合液的多個無菌凍存管放置于程序降溫盒(Nalgene，貨號:5100_0001C)中，于_80°C下放置48小時，然后將多個無菌凍存管轉移至液氮中保存。
[0085]凍存6個月后，進行細胞復蘇，首先從液氮中取出I支無菌凍存管，將該無菌凍存管立即放入37°C水浴中，搖動使凍存細胞在2分鐘內融化；然后于800轉/分鐘下離心5分鐘，棄上清；加入1ml上述全細胞培養液重懸細胞，將該細胞與全細胞培養液的懸浮液加入IOml上述全細胞培養液中，于37°C下靜置培養20小時，測定細胞的存活率，存活率為88%。
[0086]以上所述實施例僅表達了本發明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能因此而理解為對本發明專利范圍的限制。應當指出的是，對于本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發明的保護范圍。因此，本發明專利的保護范圍應以所附權利要求為準。
【權利要求】
1.一種細胞凍存液，其特征在于，按體積百分數包括以下組分: 全細胞培養液 90~95% ； 二甲基亞砜5~10%; 其中，所述全細胞培養液包括體積比為9:1的細胞培養基和胎牛血清。
2.根據權利要求1所述的細胞凍存液，其特征在于，按體積百分數包括以下組分: 全細胞培養液 90% ； 甲基亞諷10% ； 其中，所述全細胞培養液包括體積比為9:1的細胞培養基和胎牛血清。
3.根據權利要求1所述的細胞凍存液，其特征在于，所述細胞培養基包括下述組分: 無水氯化鈣265.00mg/L ;硝酸鐵0.10mg/L ;氯化鉀400.00mg/L ;無水硫酸鎂97.67mg/L ;氯化鈉 6400.00mg/L ;無水磷酸二氫鈉 109.00mg/L ; 丁二酸 75.00mg/L ; 丁二酸鈉100.00mg/L ;L-鹽酸精氨酸 84.00mg/L ;L_ 鹽酸胱氨酸 63.00mg/L ;甘氨酸 30.00mg/L ；L-鹽酸組氨酸42.00mg/L ;L_異亮氨酸105.00mg/L ;L_亮氨酸105.00mg/L ;L_鹽酸賴氨酸146.00mg/L ；L-甲硫氨酸 30.00mg/L ；L-苯丙氨酸 66.00mg/L ；L-絲氨酸 42.00mg/L ；L-蘇氨酸 95.00mg/L ；L-色氨酸 16.0Omg/L ；L-酪氨酸 72.0Omg/L ；L-纟顏氨酸 94.0Omg/L ；D-泛酸鈣4.0Omg/L ;酒石酸膽堿7.20mg/L ;葉酸mg/L ;肌醇7.20mg/L ;煙酰胺4.0Omg/L ;核黃素0.40mg/L ;鹽酸硫胺4.00mg/L ;鹽酸吡卩多辛4.00mg/L ;葡萄糖1000.00mg/L ;丙酮酸鈉110.00mg/L 及酚紅 9.30mg/L。
4.根據權利要求1所述的細胞凍存液，其特征在于，所述細胞培養基包括下述組分: 氯化鈣116.6mg/L ；硫酸銅0.0013mg/L ;九水合硝酸鐵0.05mg/L ;七水合硫酸亞鐵0.417mg/L ;氯化鉀311.8mg/L ;氯化鎂28.64mg/L ；無水硫酸鎂48.84mg/L ;氯化鈉6999.6mg/L ;無水磷酸二氫鈉54.35mg/L ;無水磷酸氫二鈉71.02mg/L ;七水合硫酸鋅0.432mg/L ；L-鹽酸精氨酸147.5mg/L ；L-胱氨酸鹽酸鹽31.29mg/L ；L-谷氨酰胺365mg/L ；甘氨酸18.75mg/L ；L-鹽酸組氨酸31.48mg/L ；L-異亮氨酸54.47mg/L ；L-亮氨酸59.05mg/L ；L-鹽酸賴氨酸91.25mg/L ；L-甲硫氨酸17.24mg/L ；L-苯丙氨酸35.48mg/L ；L-絲氨酸26.25mg/L ；L-蘇氨酸 53.45mg/L ；L-丙氨酸 4.45mg/L ；L-門冬酰胺 7.5mg/L ；L-門冬氨酸6.65mg/L ;L-鹽酸半胱氨酸 17.56mg/L ;L_ 谷氨酸 7.35mg/L ;L_ 脯氨酸 17.25mg/L ;L_ 色氨酸9.02mg/L ；L-酪氨酸mg/L ；L-繳氨酸52.85mg/L ;無水葡萄糖3151mg/L ;次黃嘌呤2mg/L ;亞油酸 0.042mg/L ;硫辛酸 0.105mg/L ;酚紅 8.lmg/L ;1，4- 丁二胺二鹽酸鹽 0.08Img/L ;丙酮酸鈉55mg/L ;維生素H0.0035mg/L ；D-泛酸韓2.24mg/L ;氯化膽堿8.98mg/L ;葉酸2.65mg/L ;肌醇12.6mg/L ;煙酰胺2.02mg/L ;鹽酸批卩多醒2mg/L ;鹽酸批卩多醇0.03mgL ;核黃素 0.219mg/L ;鹽酸硫胺 2.17mg/L ;胸苷 0.365mg/L 及維生素 B120.68mg/L。
5.根據權利要求1所述的細胞凍存液，其特征在于，所述細胞培養基包括下述組分: 四水硝酸1丐100mg/L ;氯化鉀400mg/L ;無水硫酸鎂48.84mg/L ;氯化鈉6000mg/L ;無水磷酸氫二鈉800mg/L ；L-鹽酸精氨酸200mg/L ；L-門冬酰胺50mg/L ；L-門冬氨酸20mg/L ；L-胱氨酸鹽酸鹽65.15mg/L ;L_谷氨酸20mg/L ;L_谷氨酰胺300mg/L ;甘氨酸10mg/L ;L-鹽酸組氨酸15mg/L ；L-羥脯氨酸20mg/L ；L-異亮氨酸50mg/L ；L-鹽酸賴氨酸40mg/L ；L-甲硫氨酸15mg/L ；L-苯丙氨酸15mg/L ；L-脯氨酸20mg/L ；L-絲氨酸30mg/L ；L-蘇氨酸20mg/L ;L-色氨酸5mg/L ;L-酪氨酸20mg/L ;L-繳氨酸20mg/L ;無水葡萄糖2000mg/mL ;還原型谷胱甘肽lmg/L ;苯酹紅5mg/L ；D-生物素0.2mg/L ;泛酸鈣0.25mg/L ;氯化膽堿3mg/L ;葉酸lmg/L ;肌醇35mg/L ;煙酰胺lmg/L ;對氨基苯甲酸lmg/L ;維生素B6lmg/L ;維生素B20.2mg/L ;維生素BJmg/L及維生素B120.005mg/L。
6.一種細胞凍存方法，其特征在于，包括如下步驟: 將對數期的細胞用PBS緩沖液進行洗滌，并將所述洗滌后的對數期的細胞用如權利要求f 5任一項所述的細胞凍存液進行懸浮，然后進行細胞計數，并用所述細胞凍存液進行稀釋，得到濃度為0.5-5×1O6個/毫升的對數期的細胞與所述細胞凍存液的混合液； 將所述濃度為0.5-5× 1O6個/毫升的對數期的細胞與所述細胞凍存液的混合液分裝于ImL的無菌凍存管中； 將所述裝有濃度為0.5-5× 1O6個/毫升的對數期的細胞與所述細胞凍存液的混合液的無菌凍存管放置于程序降溫盒中降溫至_80°C，并于_80°C下放置24小時~96小時，然后將所述無菌凍存管轉移至液氮中保存。
7.根據權利要求6所述的細胞凍存方法，其特征在于，所述細胞為貼壁細胞，所述將對數期的細胞用PBS緩沖液進行洗滌的步驟為:將所述貼壁細胞培養至對數期后，除去培養皿中的細胞培養液，加入PBS緩沖液進行洗滌，然后除去所述PBS緩沖液。
8.根據權利要求7所述的細胞凍存方法，其特征在于，將對數期的細胞用PBS緩沖液進行洗滌的步驟之后還包括細胞消化的步驟，所述細胞消化的步驟為:向所述貼壁細胞的表面加入0.5^2mL濃度為0.25%的胰蛋白酶溶液，于37°C培養箱內消化2-5分鐘，再加入3-5mL所述細胞凍存液的全細胞培養液，以終止所述胰蛋白酶的消化作用，然后將所述貼壁細胞吹散，并將所述貼壁細胞與所述全細胞培養液的混合液于500轉/分鐘~1000轉/分鐘下離心3分鐘~10分鐘,棄去上清得到細胞沉淀。
9.根據權利要求8所述的細胞凍存方法，其特征在于，所述胰蛋白酶溶液中含有濃度為0.38%的乙二胺四乙酸。
10.根據權利要求6所述的細胞凍存方法，其特征在于，所述細胞為懸浮細胞，所述將對數期的細胞用PBS緩沖液進行洗滌的步驟具體為:將所述懸浮細胞培養至對數期后，將含有對數期的細胞的細胞培養液于500轉/分鐘~1000轉/分鐘下離心3分鐘~10分鐘，棄去上清得到細胞沉淀，加入PBS緩沖液，再于500轉/分鐘~1000轉/分鐘下離心3分鐘~10分鐘，棄去上清得到洗滌后的細胞沉淀。
【文檔編號】A01N1/02GK103891709SQ201210568487
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2012年12月24日 優先權日:2012年12月24日
【發明者】萬曉春, 陳鳳蓮, 趙琦, 李紅昌 申請人:深圳先進技術研究院