專利名稱：毛葡萄離體快速繁殖培養方法
技術領域：
本發明涉及農業科學領域，尤其是一種毛葡萄離體快速繁殖培養方法。
背景技術：
毛葡萄(Kids heyneana Roem. & Schult.)又名絨毛葡萄、五角葉葡萄,在我國華中、華東、西南、華南北部、西北的陜、甘及華北的山西均有分布，是分布最為廣泛的野生葡萄種類之一。毛葡萄抗性強、適應性好，既是葡萄嫁接栽培的優良抗性砧木，也是我國野生葡萄紅酒的優質原料。隨著野生毛葡萄酒消費量的增加和西南地區石漠化生態治理的需要，生產上對毛葡萄種苗的需求量巨大。毛葡萄實生繁殖后代優良性狀易發生分離，扦插繁殖生根困難，繁殖率低下。研究者雖然采用組織培養技術進行毛葡萄離體培養，但因培養基和培養方法不適宜，繁殖系數均在4. 5以下，不能滿足產業化需求。
發明內容
本發明的目的是提供一種毛葡萄離體快速繁殖培養方法，它解決毛葡萄種苗繁殖率低下的問題，為生產提供大量的優質毛葡萄種苗，以滿足農業生產需要。本發明是這樣實現的毛葡萄離體快速繁殖培養方法，包括以下步驟，
步驟一、無菌系的建立在生長季節選取生長健壯的毛葡萄新梢作為外植體，用自來水沖洗干凈，在超凈工作臺上，先用體積百分比為70%的酒精漂洗30s，再用無菌水沖洗3次后，用質量百分比為0. 1%的升汞溶液(即相當于Ig氯化汞溶解在I升水中)浸泡消毒8-lOmin后，用無菌水沖洗5-6次，然后剪除新梢兩端褐化部分后，剪成單芽莖段，接種到MS培養基中，在溫度為25±1°C,光照強度為40umol s_1 nT2,光照時間為12h/d的培養條件下，培養誘導至腋芽萌發，獲得腋芽萌發產生的帶芽莖段；
步驟二、腋芽增殖取步驟一中獲得的腋芽萌發產生的帶芽莖段剪成單芽莖段，芽眼向上接種到MS培養基上，在溫度為25±1°C，光照強度為40umol s—1 m_2，光照時間為12h/d的條件下培養30d，腋芽增殖產生大量叢生不定芽；
步驟三、生根培養取步驟二中產生的不定芽，將其接種到1/2MS生根培養基中，先光下培養7d,再暗培養7d后，然后轉入光下繼續培養至正常生根，獲得試管苗；培養溫度為25±1°C,光照強度為40umol s_1 nT2，光照時間為12h/d ；
步驟四、煉苗移栽選取步驟三中生有3-4條根，長為4-5cm的試管苗，在102. Sumol -S-1 .m-2的光照條件下煉苗7d，然后從培養瓶中取出試管苗，洗凈試管苗根部培養基，用質量百分比為0. 1% KMnO4溶液浸根10s，再移栽到滅菌的珍珠巖基質中，用1/8MS營養液澆透，之后每隔7d澆灌I次營養液，并從移栽后第2-3d始每隔7d澆灌I次1000倍質量百分比為40%的多菌靈溶液，加蓋與營養缽相同大小的塑料杯保持濕度，置于溫度為25土 1°C的培養室內培養至植株長出3-5條新根后移栽到盛有營養土的營養缽中，置于溫室內煉苗30d，最后定植到大田即可。步驟一中采用的MS培養基為國際通用的培養基，并在該MS培養基中每升添加2.Omg的6-芐基嘌呤，0. 2mg的吲哚乙酸，20g蔗糖和5g瓊脂粉，其pH值為5. 8-6. O。步驟二中采用的MS培養基為國際通用的培養基，并在該MS培養基中每升添加
2.0-3. Omg的6-芐基嘌呤，0. 01-0. 07mg的吲哚丁酸，20g蔗糖和5g瓊脂粉，pH5. 8-6. O。步驟三中采用的1/2MS培養基是指MS培養基中的大量元素減半，其它元素不變，并在該MS培養基中每升添加0. 05-0. 5g吲哚丁酸，0-0. 20g吲哚乙酸，20g蔗糖和5g瓊脂粉，pH5. 8-6. O。步驟四中采用的1/8MS營養液是指MS培養基中的大量元素為1/8，其它元素不變，并在該MS培養基中每升添加0. 05mg吲哚乙酸。由于采用上述的技術方案，與現有技術相比，本發明采用植物組織培養技術，對腋芽萌發產生的帶芽莖段進行組培，并配置適合的培養基，使毛葡萄無菌單芽莖段腋芽增殖率達97%以上，繁殖系數達17. 0-20. 2，生根率達93%以上，煉苗成活率可達100%，解決毛 葡萄種苗繁殖率低下的問題，為生產提供大量的優質毛葡萄種苗；本發明方法簡單，成本低廉，使用效果好，產業化應用前景廣闊。本發明的實施例I :毛葡萄離體快速繁殖培養方法，包括以下步驟，
步驟一、無菌系的建立在生長季節選取生長健壯的毛葡萄“花溪-9”新梢為外植體，在自來水下沖洗干凈后，先在體積百分比70%的酒精中浸泡30s，無菌水沖洗3次，再用質量百分比為0. 1%升汞溶液浸泡消毒8min，無菌水沖洗5次，剪成單芽莖段，接種到MS培養基上(每升MS培養基附加2. Omg的6-芐基嘌呤，0. 2mg的吲哚乙酸，20g蔗糖和5g瓊脂粉，PH5. 8-6. 0)，MS培養基的溫度為25土1°C，光照強度為40umol s-1 m_2，光照時間為12h/d ;培養誘導至腋芽萌發，獲得腋芽萌發產生的帶芽莖段；
步驟二、腋芽增殖取步驟一中獲得的腋芽萌發產生的帶芽莖段剪成單芽莖段，芽眼向上接種到MS培養基上(每升培養基添加2.0-3. 0 mg的6-芐基嘌呤，0. 01-0. 07 mg的吲哚丁酸，20 g蔗糖和5g瓊脂粉，pH5. 8-6. 0)，在溫度為25±1°C，光照強度為40umol .s—1 .nT2，光照時間為12h/d的條件下培養30d，腋芽增殖產生大量叢生不定芽，無菌單芽莖段腋芽增殖率達100%，繁殖系數達17. 0 ；
步驟三、生根培養取步驟二中產生的不定芽，將其接種到1/2MS生根培養基中(1/2MS培養基是指MS培養基中的大量元素減半，其它元素不變，并在該MS培養基中每升添加
0.08-0. 5g吲哚丁酸，0-0. 20g吲哚乙酸，20g蔗糖和5g瓊脂粉，pH5. 8-6. 0)，先光下培養7d,再暗培養7d后，然后轉入光下繼續培養至正常生根，獲得試管苗；培養溫度為25 ± I °C，光照強度為40umol S-1 nT2，光照時間為12h/d ;30d后生根率可達93. 7% ；
步驟四、煉苗移栽選取步驟三中生有3-4條根，長為4-5cm的試管苗，在102. Sumol -S-1 .m-2的光照條件下煉苗7d，然后從培養瓶中取出試管苗，洗凈試管苗根部培養基，用質量百分比為0. 1% KMnO4溶液浸根10s，再移栽到滅菌的珍珠巖基質中，用1/8MS營養液(1/8MS營養液是指MS培養基中的大量元素為1/8，其它元素不變，并在該MS培養基中每升添加0. 05mg吲哚乙酸)澆透，之后每隔7d澆灌I次營養液，并從移栽后第2-3d始每隔7d澆灌I次1000倍質量百分比為40%的多菌靈溶液，加蓋與營養缽相同大小的塑料杯保持濕度，置于溫度為25土TC的培養室內培養至植株長出3-5條新根后移栽到盛有營養土的營養缽中，置于溫室內煉苗30d，最后定植到大田，成活率100%。本發明的實施例2 :毛葡萄離體快速繁殖培養方法，包括以下步驟，步驟一、無菌系的建立在生長季節選取生長健壯的毛葡萄“農院-11”新梢為外植體，在自來水下沖洗干凈后，先在體積百分比70%的酒精中浸泡30s，無菌水沖洗3次，再用質量百分比為0. 1%升汞溶液浸泡消毒8min，無菌水沖洗5次，剪成單芽莖段，接種到MS培養基上(每升MS培養基附加2. Omg的6-芐基嘌呤，0. 2mg的吲哚乙酸，20g蔗糖和5g瓊脂粉，PH5. 8-6. 0)，MS培養基的溫度為25土1°C，光照強度為40umol s-1 m_2，光照時間為12h/d ;培養誘導至腋芽萌發，獲得腋芽萌發產生的帶芽莖段；
步驟二、腋芽增殖取步驟一中獲得的腋芽萌發產生的帶芽莖段剪成單芽莖段，芽眼向上接種到MS培養基上(每升培養基添加2. 0-3. Omg的6-芐基嘌呤，0. 01-0. 07mg的吲哚丁酸，20g蔗糖和5g瓊脂粉，pH5. 8-6. 0)，在溫度為25± 1°C，光照強度為40umol s-1 m_2，光照時間為12h/d的條件下培養30d，腋芽增殖產生大量叢生不定芽，無菌單芽莖段腋芽增殖率達97%，繁殖系數達20. 2 ；
步驟三、生根培養取步驟二中產生的不定芽，將其接種到1/2MS生根培養基中(1/2MS培養基是指MS培養基中的大量元素減半，其它元素不變，并在該MS培養基中每升添加
0.08-0. 5g吲哚丁酸，0-0. 20 g吲哚乙酸，20g蔗糖和5g瓊脂粉，pH5. 8-6. 0)，先光下培養7d,再暗培養7d后，然后轉入光下繼續培養至正常生根，獲得試管苗；培養溫度為25 ± I °C，光照強度為40umol S-1 nT2，光照時間為12h/d ;30d后生根率可達100% ；
步驟四、煉苗移栽選取步驟三中生有3-4條根，長為4-5cm的試管苗，在102. Sumol -S-1 .m-2的光照條件下煉苗7d，然后從培養瓶中取出試管苗，洗凈試管苗根部培養基，用質量百分比為0. 1% KMnO4溶液浸根10s，再移栽到滅菌的珍珠巖基質中，用1/8MS營養液(1/8MS營養液是指MS培養基中的大量元素為1/8，其它元素不變，并在該MS培養基中每升添加0. 05mg吲哚乙酸)澆透，之后每隔7d澆灌I次營養液，并從移栽后第2-3d始每隔7d澆灌I次1000倍質量百分比為40%的多菌靈溶液，加蓋與營養缽相同大小的塑料杯保持濕度，置于溫度為25土TC的培養室內培養至植株長出3-5條新根后移栽到盛有營養土的營養缽中，置于溫室內煉苗30d，最后定植到大田，成活率100%。花溪-9及農院-11均是從野外收集的貴州野生毛葡萄優良單株，與栽培葡萄品種相比，果粒小，含糖量較低、含酸量較高，風味獨特，抗病性及抗旱性強，既可作為釀酒葡萄栽培，也可作為抗性砧木利用。
權利要求
1.一種毛葡萄離體快速繁殖培養方法，其特征在于包括以下步驟， 步驟一、無菌系的建立在生長季節選取生長健壯的毛葡萄新梢作為外植體，用自來水沖洗干凈，在超凈工作臺上，先用體積百分比為70%的酒精漂洗30s，再用無菌水沖洗3次后，用質量百分比為O. 1%的升汞溶液浸泡消毒8-lOmin后，用無菌水沖洗5-6次，然后剪除新梢兩端褐化部分后，剪成單芽莖段，接種到MS培養基中，在溫度為25土 1°C，光照強度為40umol · s—1 · m_2,光照時間為12h/d的培養條件下,培養誘導至腋芽萌發,獲得腋芽萌發產生的帶芽莖段； 步驟二、腋芽增殖取步驟一中獲得的腋芽萌發產生的帶芽莖段剪成單芽莖段，芽眼向上接種到MS培養基上，在溫度為25± 1°C，光照強度為40umol · s—1 · m_2，光照時間為12h/d的條件下培養30d，腋芽增殖產生大量叢生不定芽； 步驟三、生根培養取步驟二中產生的不定芽，將其接種到1/2MS生根培養基中，先光 下培養7d,再暗培養7d后，然后轉入光下繼續培養至正常生根，獲得試管苗；培養溫度為25±1°C,光照強度為40umol · s_1 · πΓ2，光照時間為12h/d ； 步驟四、煉苗移栽選取步驟三中生有3-4條根，長為4-5cm的試管苗，在102. Sumol -S-1 ·πΓ2的光照條件下煉苗7d，然后從培養瓶中取出試管苗，洗凈試管苗根部培養基，用質量百分比為O. 1% KMnO4溶液浸根10s，再移栽到滅菌的珍珠巖基質中，用1/8MS營養液澆透，之后每隔7d澆灌I次營養液，并從移栽后第2-3d始每隔7d澆灌I次1000倍質量百分比為40%的多菌靈溶液，加蓋與營養缽相同大小的塑料杯保持濕度，置于溫度為25土 1°C的培養室內培養至植株長出3-5條新根后移栽到盛有營養土的營養缽中，置于溫室內煉苗30d，最后定植到大田即可。
2.根據權利要求I所述的毛葡萄離體快速繁殖培養方法，其特征在于步驟一中采用的MS培養基為國際通用的培養基，并在該MS培養基中每升添加2. Omg的6-芐基嘌呤，O.2mg的吲哚乙酸，20g蔗糖和5g瓊脂粉，其pH值為5. 8-6. O。
3.根據權利要求I所述的毛葡萄離體快速繁殖培養方法，其特征在于步驟二中采用的MS培養基為國際通用的培養基，并在該MS培養基中每升添加2. 0-3. Omg的6-芐基嘌呤，O. 01-0. 07mg的吲哚丁酸，20g蔗糖和5g瓊脂粉，pH5. 8-6. O。
4.根據權利要求I所述的毛葡萄離體快速繁殖培養方法，其特征在于步驟三中采用的1/2MS培養基是指MS培養基中的大量元素減半，其它元素不變，并在該MS培養基中每升添加O. 05-0. 5g吲哚丁酸，0-0. 20g吲哚乙酸，20g蔗糖和5g瓊脂粉，ρΗ5· 8-6. O。
5.根據權利要求I所述的毛葡萄離體快速繁殖培養方法，其特征在于步驟四中采用的1/8MS營養液是指MS培養基中的大量元素為1/8，其它元素不變，并在該MS培養基中每升添加O. 05mg Π引哚乙酸。
全文摘要
本發明公開了一種毛葡萄離體快速繁殖培養方法，包括以下步驟，無菌系的建立、不定芽誘導、生根培養及煉苗移栽。本發明采用植物組織培養技術成功實現毛葡萄離體快速繁殖，使毛葡萄無菌單芽莖段腋芽增殖率達97%以上，繁殖系數達17.0-20.2，生根率達93%以上，煉苗成活率可達100%，解決毛葡萄種苗繁殖率低下的問題，為生產提供大量的優質毛葡萄種苗；本發明方法簡單，成本低廉，使用效果好，產業化應用前景廣闊。
文檔編號A01H4/00GK102823502SQ20121035555
公開日2012年12月19日 申請日期2012年9月24日 優先權日2012年9月24日
發明者潘學軍, 劉偉, 張文娥, 甘專 申請人:貴州大學