專利名稱：葡萄離體莖段的脫毒方法
技術領域：
本發明涉及果樹生物技術領域，具體的說，涉及一種葡萄離體莖段的脫毒技術。
背景技術：
目前國內已報道葡萄病毒病主要有9種扇葉病、卷葉病、莖痘病、栓皮病、斑點病、脈壞死病、耳突病、星狀花葉病和縮葉病。其中，扇葉病與卷葉病是我國葡萄生產中分布最廣、危害最嚴重的病毒病種類。據調查，目前我國葡萄栽培區域內，85%以上的葡萄園普遍發病，給葡萄生產帶來了極大的損失。郭德銀等采用間接ELISA法，隨機檢測了 35個葡萄品種，帶扇葉病毒率高達74.3%。何水濤等對國家葡萄種質資源圃(鄭州)內39個品種共78株葡萄進行了 PAS-ELISA檢測，帶毒率為76. 9%。鑒于繁殖材料帶病毒是葡萄病毒病的主要傳播途徑，因此，對葡萄繁殖材料進行病毒脫除，建立無病毒的葡萄原原種圃、母本園和苗圃等無病毒苗木的生產體系，以保證栽植材料健康無毒，是防治葡萄病毒病的關鍵。據報道，目前用于脫毒最有效的方法是“熱處理并結合莖尖培養”。尚志華將轉接后20天的組培苗置于光照1000-2500LX的培養箱內，起始溫度設為34°C，以后每天升高 I0C，直到37°C (白天37°C，夜間25°C )，熱處理40_60d后，剝取0. 5mm的莖尖，經檢測的脫除率可達62. 5% ；張金文等用此方法對7個葡萄品種進行病毒脫除，將試管苗置于35-37°C 溫度下熱處理45-60d，結果發現葡萄扇葉病毒和卷葉病毒脫毒率高達92%。根據目前的報道，對葡萄栽植材料的脫毒雖然取得了很好的進展，但仍存在許多問題，主要為(1)用于脫毒的試管苗材料不耐熱，脫毒過程中植株死亡，獲得的微莖尖數量少；(2)需要將溫度逐漸升高或晝夜變化，并同時控制濕度和光照，對研究環境及條件設施要求嚴格，通用性差；C3)程序繁雜，脫毒需要的時間長，因此培育葡萄無病毒苗木的周期也相對較長；(4)從試管材料的準備、生根到莖尖培養需要不同的培養基；(4)前人發表的一些文章雖然獲得了較高的脫毒率，但并未與脫毒前材料的帶毒情況作比較，因此其較高的脫毒率也有待進一步實驗。針對這些問題，我們借助前人的經驗開展了進一步的研究，旨在創建一種脫毒率高、操作方便簡單、通用性強的高效脫毒技術。
發明內容
本發明的目的是提供一種葡萄離體莖段的脫毒方法。此方法既不要求光照，也不要求頻繁變溫處理，操作簡單、省時、省電、省工，效率高、成本低，對研究環境及條件設施要求不十分嚴格，只要具備組培條件的研究及教學單位均可應用。本發明所述的葡萄離體莖段的脫毒方法，包括如下步驟1)選擇繼代培養至莖半木質化的葡萄品種或相關砧木的試管苗，無菌條件下剪取單芽莖段接種在培養基中，置于22-28°C、2000-30001x培養室培養至剛露出小白根，得到葡萄離體莖段；
2)將葡萄離體莖段置于35-40°C的培養箱中，暗處理并同時進行熱處理；3)熱處理IOd后開始觀察側芽生長情況，當黃化嫩梢長至6-lOcm，在無菌條件下剝取0. 2-0. 8mm左右的微莖尖，置于培養基中培養，直至得到繁殖材料。其中，本發明的方法中，步驟1)和幻都采用同一種培養基，所述培養基是添加了 0. 1-0. 5mg/L IAA, 15_30mg/L 蔗糖，以及 4. 5-7. Omg/L 瓊脂或明膠，pH 為 5. 8 的改良 B5 培養基。優選的，所述培養基是添加了 O.ang/L IAA，20mg/L蔗糖，5.0!^/1瓊脂或明膠，？!1 為5.8的改良B5培養基。其中，IAA是吲哚乙酸(Indole-3-acetic acid)的簡稱，生物學名稱為生長素，是一種植物激素。其中，所述蔗糖可選用白砂糖、綿白糖等本領域常用蔗糖中的一種或多種。改良B5培養基的配方包括下表的各組分
權利要求
1.一種葡萄離體莖段的脫毒方法，包括如下步驟1)選擇繼代培養至莖半木質化的葡萄品種或相關砧木的試管苗，無菌條件下剪取單芽莖段接種在培養基中，置于22-28°c、2000-30001x培養室培養至剛露出小白根，得到葡萄離體莖段；2)將葡萄離體莖段置于35-40°C的培養箱中，暗處理并同時進行熱處理；3)熱處理IOd后開始觀察側芽生長情況，當黃化嫩梢長至6-lOcm，在無菌條件下剝取 0. 2-0. 8mm左右的微莖尖，置于培養基中培養，直至得到繁殖材料。
2.如權利要求1所述的脫毒方法，其特征在于，所述培養基是添加了0. 1-0. 5mg/L IAA, 15-30mg/L蔗糖，以及4. 5-7. Omg/L瓊脂或明膠，pH為5. 8的改良B5培養基；其中，所述改良B5培養基包括以下組分KNO31250mg/L ；MgSO4 · 7H20125mg/L ；NaH2PO4 · H2O85. 4mg/L ；CaCl2113. 2mg/L (NH4)2S0467mg/L ；KI0.375mg/LH3BO41. 5mg/L ；MnSO4 · 4H205mg/L ；ZnSO4 · 7H201. Omg/L ；Na2MoO4 · 2H200.125mg/L ；CoCl2 · 6H200.0125mg/LCuSO4 · 5H200.0125mg/LNa2-EDTA37. 3mg/L ；FeSO4 · 7H2027. 8mg/L ；肌醇25mg/L ；；煙酸1. Omg/L ；鹽酸吡哆醇1. Omg/L ；鹽酸硫銨1Omg/Lο
3.如權利要求2所述的脫毒方法，其特征在于，所述培養基是添加了O.aiig/L IAA, 20mg/L蔗糖，5. Omg/L瓊脂或明膠，pH為5. 8的改良B5培養基。
4.如權利要求1所述的脫毒方法，其特征在于，所述步驟1)是置于23-27°C、 2000-25001x的培養室中培養；優選置于27°C、20001x的培養室中培養。
5.如權利要求1或4所述的脫毒方法，其特征在于，所述步驟1)中在培養室中的培養時間為5-10d，優選7d。
6.如權利要求1所述的脫毒方法，其特征在于，所述步驟2)是置于37-39°C的培養箱進行熱處理；優選置于38°C的培養箱進行熱處理。
7.如權利要求1或6所述的脫毒方法，其特征在于，所述步驟2)的暗處理如下進行 將葡萄離體莖段置于有蓋箱中，然后置于培養箱中，進行處理。
8.如權利要求1所述的脫毒方法，其特征在于，步驟幻中，當黃化嫩梢長至8-9cm，在無菌條件下剝取0. 5mm的微莖尖。
9.如權利要求1-8所述的脫毒方法的應用，其特征在于，用于葡萄品種及相關砧木的脫毒。
10.一種用于葡萄離體莖段脫毒的培養基，其特征在于，所述培養基是添加了 0. 1-0. 5mg/L IAA, 15_30mg/L 蔗糖，以及 4. 5-7. Omg/L 瓊脂或明膠，pH 為 5. 8 的改良 B5 培養基；優選為添加了 0. 2mg/LIAA、20mg/L蔗糖，以及5. Omg/L瓊脂，pH為5. 8的改良B5培養基；其中，所述改良B5培養基包括以下組分KNO31250mg/L ；MgSO4 · 7H20125mg/L ；NaH2PO4 · H2O85. 4mg/L ；CaCl2113. 2mg/L ；(NH4) 2S0467mg/L ；KI0. 375mg/LH3BO41. 5mg/L ；MnSO4 · 4H205mg/L ；ZnSO4 · 7H201. Omg/L ；Na2MoO4 · 2H200. 125mg/L ；CoCl2 · 6H200.0125mg/LCuSO4 · 5H200.0125mg/LNa2-EDTA37. 3mg/L ；FeSO4 · 7H2027. 8mg/L ；肌醇25mg/L ；煙酸1. Omg/L ；鹽酸吡哆醇1. Omg/L ；鹽酸硫銨1Omg/Lο
全文摘要
本發明涉及一種葡萄離體莖段的脫毒方法，包括如下步驟1)選擇繼代培養至莖半木質化的葡萄品種或相關砧木的試管苗，無菌條件下剪取單芽莖段接種在培養基中，置于22-28℃、2000-3000lx培養室培養至剛剛露出小白根，得到葡萄離體莖段；2)將葡萄離體莖段置于35-40℃的培養箱中，暗處理并同時進行熱處理；3)熱處理10d后開始觀察側芽生長情況，當黃化嫩梢長至6-10cm，在無菌條件下肉眼剝取0.2-0.8mm左右的微莖尖，置于培養基中培養，直至得到繁殖材料。本發明既不要求光照，也不要求頻繁變溫處理，操作簡單、省時、省電、省工，效率高、成本低，對研究環境及條件設施要求不十分嚴格，只要具備組培條件的研究及教學單位均可應用。
文檔編號A01H4/00GK102232358SQ201010168170
公開日2011年11月9日 申請日期2010年5月4日 優先權日2010年5月4日
發明者吳永杰, 吳雅琴, 李玉生, 程和禾, 趙艷華 申請人:河北省農林科學院昌黎果樹研究所