專利名稱：一種抑制水稻2-pgk基因表達的植物表達載體及培育低植酸水稻的方法
技術領域：
本發明屬于基因工程領域，尤其涉及一種抑制水稻2-PGK基因表達的植物表達載體及培育低植酸水稻的方法。
背景技術：
植酸(PA,phytic acid),又名肌醇六磷酸(myo-inositol-l, 2, 3,4, 5,6-hexakisphosphate,簡寫InsP6或IP6),是禾谷類、豆類、油料等作物種子中磷的主要儲存形式，通常占種子干重的I. 0%，占種子全磷量的75±10%。以禾谷類、豆類等作物的種子作為主食的人類和飼用動物，由于缺乏消化植酸的酶類，排泄物中磷的含量很高，極易造成土壤和環境水體富營養化；同時植酸與Zn2+、Ca2+、Fe3+等形成的植酸鹽不能被人類所吸收利用，長期食用禾谷類的亞洲人群易患微量元素缺乏癥。雖然，在養殖業中可通過向飼料中添加植酸酶或者磷來滿足動物對磷的需求，但是這無疑增加了成本，同時要造成了潛在的環境磷污染。如何解決植酸存在導致的環境問題和人類微量元素缺乏癥成為擺在科學工作者面前的一個難題。通過遺傳育種或者基因工程技術獲得植酸含量適當下降、其他農藝性狀沒有顯著變化的作物，不僅能夠在源頭上解決植酸造成的環境污染問題，同時對于降低畜牧業生產投入，增加農民收入有重要的社會現實意義。早在1996年，V. Raboy等采用就化學誘變劑處理玉米獲得了兩類低植酸突變體Ipal和lpa2，植酸含量分別下降66%和30%。隨后，國內外育種工作者應用Y射線和化學誘變劑處理，在大麥、水稻、小麥、大豆等作物中獲得了一系列低植酸突變體和品種。然而，進一步研究發現伴隨著種子植酸含量的下降，作物的其他農藝性狀也會發生改變，如作物產量下降、種子活力降低、植株形態發生變異，甚至還會影響到植物對生物或非生物脅迫的抗性,嚴重的還會致死。因此，同時獲得作物種子植酸含量下降、其他農藝性狀沒有發生顯著變異的低植酸品種成為育種者的首要任務。到目前為止，對植物植酸代謝合成途徑已經研究的比較清楚，參與植酸代謝的多個功能基因已經克隆MIS (myo-inositol-3-phosphate synthase,肌醇-3-憐酸合成酶)基因是植酸合成途徑的首個酶，它的作用是將光合作物產物葡萄糖-6-磷酸轉化成ID-肌醇-3-磷酸,為植酸合成提供肌醇環；MIK (myo-inositol kinase,肌醇激酶)基因和IMP (inositol monophosphatase,肌醇單磷酸酶)基因負責肌醇和3-磷酸肌醇之間轉化，對兩個基因的調控可能會對植酸的合成途徑起調節作用；植物的IPK (inositolphosphatekinase,肌醇磷酸激酶)主要負責肌醇的磷酸化，通過比較多種作物的IPK活性發現其具有磷酸化多種肌醇底物的能力，但是不具有磷酸化肌醇環2’位置的能力；IPKl (inositol-pentakisphosphate 2-kinase,肌醇多憐酸-2激酶)是目前發現唯一可以磷酸化肌醇五磷酸肌醇環2’位置的酶；MRP (multidrug resistance protein,多藥抗性蛋白)是一種轉運蛋白，其承擔著運輸植酸到貯藏小泡的功能，已經在水稻、玉米、大豆中克隆得到；除上述基因外，還有負責將植酸水解為肌醇和無機磷的植酸酶基因，目前已在多種作物中發現。到目前為止，研究最為詳細的植酸合成基因是MIPS，通過基因沉默技術在多種作物中獲得了相應的低植酸突變體。Ruth Keller等(1998)應用組成型啟動子和反義RNA技術，獲得了 MIPS基因表達水平下降的轉基因土豆，分析發現轉基因土豆葉片中肌醇的含量下降；AlineC. S. Nunes等(2005)通過RNAi技術沉默MIPS基因使大豆中的植酸含量下降了 94. 5% ；Mio Kuwano等(2008)通過反義RNA技術在種子特異性啟動子的驅動下，獲得了植酸含量下降、其他農業性狀沒有顯著變異的轉基因水稻。此外，Shi等(2007)應用RNAi技術，在玉米種子特異性啟動子01el6和Glb驅動下，通過沉默MRP4基因獲得種子植酸含量下降的玉米和大豆。目前還沒有通過amiRNA技術沉默植酸合成代謝相關基因，培育低植酸水稻或其他作物的報道。
發明內容
本發明提供了一種植物表達載體，利用該植物表達載體能特異性地抑制水稻種子中相應植酸合成代謝相關基因的表達，從而獲得性狀穩定的低植酸水稻植株。一種amiRNA抑制水稻2-PGK基因表達的植物表達載體，包括插入原始載體的amiRNA結構單元和特異性啟動子,所述特異性啟動子為啟動子01eosinl8,其核苷酸序列如SEQ ID No. I所示。所述水稻2-PGK基因的Gramene位置序列號為LOC 0s02g57400. I。本發明植物表達載體使用種子特異性啟動子OleosinlS，可以使基因沉默事件僅發生在種子胚和糊粉層，能夠有效地避免其他組織部位植酸合成受到影響。所述原始載體可以是pCAMBIA1301-35SN或其他可用于農桿菌轉化的雙元載體。所述amiRNA結構單元包括中間的環和形成發夾結構的莖，所述莖由amiRNA抑制片段和其不完全互補片段構成。所述amiRNA抑制片段為2-PGK基因cDNA序列的部分序列，其喊基序列可以如SEQ ID No. 2所不。本發明還提供了一種培育低植酸水稻的方法，包括(I)構建所述的植物表達載體；(2)將所述植物表達載體通過農桿菌介導轉化水稻愈傷組織；(3)將水稻愈傷組織轉移到選擇性培養基上繼續培養，待分化成苗后，移栽至大田，篩選獲得低植酸水稻植株。其中，所述植物表達載體的構建方法為(I)將amiRNA抑制片段和其不完全互補片段替換水稻內源性miRNA前體osaMIR528中的莖，得到amiRNA結構單元；(2)將amiRNA結構單元插入原始載體的啟動子的下游；(3)將啟動子01eosinl8替換原始載體的啟動子。所述農桿菌可以選擇為EHA105根瘤農桿菌。為了獲得性狀穩定的轉基因低植酸植株，可以對獲得的低植酸水稻植株多代種植，篩選性狀穩定的單株。其中，所述amiRNA結構單元構建的具體步驟為(I)利用WMD3平臺獲得構建沉默2-PGK基因的amiRNA引物(I，II，III，IV)；(2 )以pNW55 (含水稻osaMIR528 )為模板，分別利用引物11+通用引物G-4368、弓丨物I+引物IV、引物III+通用引物G-4369進行PCR擴增，獲得amiRNA結構單元的環結構、amiRNA抑制片段及其不完全互補片段；(3)以上述PCR產物為模板，利用通用引物G-4368+G-4369進行重疊PCR，獲得所述amiRNA結構單兀。其中，引物I、II、III、IV的堿基序列為I :5，-agTAAGTATTAATCAAGACCCTGcaggagattcagtttga-3，；II :5，-tgCAGGGTCTTGATTAATACTTActgctgctgctacagcc-3，；III :5，-ctCAGGGACTTCATTAATACTTAttcctgctgctaggctg-3，；IV :5，-aaTAAGTATTAATGAAGTCCCTGagagaggcaaaagtgaa-3，；通用弓丨物G-4368、G-4369的堿基序列為G-4368 :5’ -CTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAAC-3’ ； G-4369 5，-GCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAG-3，。所述啟動子01eosinl8的制備方法為(I)提取水稻成熟葉片基因組DNA ；(2)以所述總DNA為模板，利用引物01el8_F和01el8_R進行PCR擴增。所述引物01el8_F和01el8_R如下01el8-F:5’ -AAGCTTATGTCTGCCAGCATTGTGAAG-3’ ；01el8-R :5’ -GGTACCTGCTAAGCTAGCTAGCAAGATGA-3’。與現有技術相比，本發明的有益效果為(I)本發明提供的方法利用種子特異性啟動子01eosinl8和amiRNA技術控制水稻種子中植酸合成相關基因的表達，使基因沉默事件僅發生在種子胚和糊粉層，能夠有效避免影響水稻其他組織部位植酸合成。(2)利用本發明提供的方法能夠獲得穩定的轉基因低植酸水稻品系，并且與其他非轉化陰性系在株高、穗長、千粒重等其他農藝方面無顯著差異，保證了轉基因低植酸水稻的整體品質。
圖IA為01eosinl8_T載體的菌落PCR擴增驗證結果圖。圖IB為mi-2-PGK-T載體的菌落PCR驗證結果圖。圖2為pmi-2-PGK載體結構示意圖。圖3為轉化水稻愈傷組織的⑶S顯色圖。其中，“ + ”表示轉基因陽性，表示非轉基因陰性。圖4為轉基因水稻葉片⑶S顯色圖。其中，“ + ”表示轉基因陽性，表示非轉基因陰性。圖5為種子無機磷顯色反應示意圖。其中，“ + ”表示轉基因陽性，表示非轉基因陰性。
具體實施方式
通過構建2-PGK基因的amiRNA獲得低植酸水稻l、mi-2-PGK結構單元的獲得(I) mi-2-PGK 引物的設計在Gramene網站上搜尋水稻品種日本晴2-PGK基因序列號(L0C_0s02g57400. I),將 0s02g57400. I 輸入到 Web MicroRNA Designer platform(WMD3)平臺獲得構建沉默2-PGK基因的amiRNA引物，引物的堿基序列分別為I :5，-agTAAGTATTAATCAAGACCCTGcaggagattcagtttga-3，；II :5’ -tgCAGGGTCTTGATTAATACTTActgctgctgctacagcc-3’ ；III :5，-ctCAGGGACTTCATTAATACTTAttcctgctgctaggctg-3，；IV :5，-aaTAAGTATTAATGAAGTCCCTGagagaggcaaaagtgaa-3，；通用引物G-4368 :5’ -CTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAAC-3’ ；G-4369 :5’ -GCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAG-3’ ；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司負責合成。(2) mi-2-PGK結構單元的擴增以pNW55為模板，根據下表通過PCR擴增獲得構建mi-2_PGK結構單元的環結構、ami-2-PGK抑制片段及其不完全互補片段；然后再以環結構、mi-2-PGK抑制片段及其不完全互補片段為模板I: I: I摩爾比混合，通過重疊PCR獲得ami-2-PGK結構單元，構建程序見表I。ami-2-PGK片段的堿基序列如SEQ ID No. 2所示。表I mi-2-PGK結構單元的構建程序
①以pNW55為模板引物產物大小(bp)PCR程序G-4368^ II 1+iV Iii +G-4369^56 87 25995'C, 2 mi η 98°C, 15s, 55°C, 34個循環； 680C, 7 min ο30s，681,30s,②以上述PCR產物為模板(摩爾比1:1:1)引物產物大小(bp)PCR程序G-4368+ G-4369^5495V, 2 min； 98'C, 15s，550C, 34個循環； 68 °C，7 min ο30s，68。。，30s,PCR反應體系為
權利要求
1.一種amiRNA抑制水稻2-PGK基因表達的植物表達載體，包括插入原始載體的amiRNA結構單元和特異性啟動子，其特征在于，所述特異性啟動子為啟動子Oleosin 18，其核苷酸序列如SEQ ID No. I所示。
2.如權利要求I所述的植物表達載體，其特征在于，所述原始載體為PCAMBIA1301-35SN。
3.如權利要求I所述的植物表達載體，其特征在于，所述amiRNA結構單元包括中間的環和形成發夾結構的莖，所述莖由amiRNA抑制片段和其不完全互補片段構成，所述amiRNA抑制片段的堿基序列如SEQ IDNo. 2所示。
4.一種培育低植酸水稻的方法，其特征在于，包括 (1)構建如權利要求I 3任一所述的植物表達載體； (2)將所述植物表達載體通過農桿菌介導轉化水稻愈傷組織； (3)將水稻愈傷組織轉移到選擇性培養基上繼續培養，待分化成苗后，移栽至大田，篩選獲得低植酸水稻植株。
5.如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述植物表達載體的構建方法為 (1)將amiRNA抑制片段和其不完全互補片段替換水稻內源性miRNA前體osaMIR528中的莖，得到amiRNA結構單元； (2)將amiRNA結構單元插入原始載體的啟動子的下游； (3)將啟動子Oleosin18替換原始載體的啟動子。
6.如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述農桿菌為根瘤農桿菌EHA105。
7.如權利要求4所述的方法，其特征在于，將低植酸水稻植株多代種植，獲得性狀穩定植株。
全文摘要
本發明公開了一種植物表達載體及培育低植酸水稻的方法，該植物表達載體包括插入原始載體的amiRNA結構單元和特異性啟動子，所述特異性啟動子為啟動子Oleosin 18，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。該方法包括(1)構建所述植物表達載體；(2)將所述植物表達載體通過農桿菌介導轉化水稻愈傷組織；(3)將水稻愈傷組織轉移到選擇性培養基上繼續培養，待分化成苗，移栽大田，篩選獲得低植酸水稻植株。本發明利用種子特異性啟動子Oleosin 18控制基因表達，使基因沉默僅發生在種子胚和糊粉層，能夠有效避免水稻其他組織部位植酸合成受到影響。
文檔編號A01H5/00GK102925480SQ20121043089
公開日2013年2月13日 申請日期2012年11月2日 優先權日2012年11月2日
發明者李文旭, 舒慶堯, 趙海軍, 譚媛媛, 盧海平 申請人:浙江大學