在水稻中檢測受白葉枯病誘導表達基因的有效方法

在水稻中檢測受白葉枯病誘導表達基因的有效方法
【專利摘要】本發明公開了一種在水稻中檢測受白葉枯病誘導表達基因的有效方法，采用Real-time?PCR，在水稻葉片上采用剪葉法侵染白葉枯病菌，侵染46～50小時后，取距離剪口處1cm之內的葉片組織進行檢測。表達基因包括Os03g0853200、OsPR1b、OsNPR1等。采用本發明的方法能輕易的對白葉枯病菌侵染的水稻組織進行選取，并能有效地檢測其誘導基因的表達。
【專利說明】在水稻中檢測受白葉枯病誘導表達基因的有效方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種在水稻中檢測受白葉枯病菌誘導表達基因的有效方法，屬于分子遺傳學領域。
【背景技術】
[0002]水稻白葉枯病是由革蘭氏陰性黃單孢菌水稻變種(Xanthomonas oryzaepv.0ryzae, Xo0.)所引起的一種世界性細菌病害，它與稻瘟病、紋枯病一起被稱為水稻的“三大病害”。水稻遭遇白葉枯病后，一般減產20~30%，嚴重時可達50%，甚至絕收。利用水稻的抗病基因是防治白葉枯病最經濟、環保的方法，也是水稻育種中提高雜交稻抗病性的有效途徑。水稻抗白葉枯病基因往往受白葉枯病菌的誘導表達，所以在白葉枯病菌侵染的水稻中檢測被誘導表達的基因，是發現抗性基因的有效方法，為水稻抗性基因的功能研究和育種利用奠定堅實基礎。
[0003]目前，檢測基因表達的方法非常成熟，主要有半定量RT-PCR法、Real-time PCR法、Northern blotting法等。其中，Real-time PCR可以精確定量某個基因的表達水平,是比較公認的檢測基因表達的方法。在檢測白葉枯病菌誘導表達的基因時，一般是選取一段接種過白葉枯病菌的水稻葉片，提取總RNA后，用Real-time PCR分析基因表達水平。由于不同基因的表達方式可能有所不同，有些可能是在葉片接種病菌的局部受到誘導表達，有些則是在整張葉片上受到誘導表達，因此如何合理地選取葉片組織是檢測基因受白葉枯病菌誘導表達一個非常關鍵的因素。但是，選取哪一段接種過白葉枯病菌的水稻葉片，離接種處多少距離，才能有效地檢測出被誘導表達的抗性基因，目前還沒有一個明確的標準。

【發明內容】

[0004]本發明要解決的技術問題是提供一種在水稻中檢測受白葉枯病誘導表達基因的有效方法；采用本發明的方法能輕易的對白葉枯病菌侵染的水稻組織進行選取，并能有效地檢測其誘導基因的表達。
[0005]為了解決上述技術問題，本發明提供一種在水稻中檢測受白葉枯病誘導表達基因的有效方法，采用Real-time PCR，在水稻葉片上采用剪葉法侵染白葉枯病菌(白葉枯病菌PX086)，侵染(接種)46~50小時(較佳為48小時)后，取距離剪口處Icm(包括Icm)之內的葉片組織進行檢測。
[0006]作為本發明的在水稻中檢測受白葉枯病誘導表達基因的有效方法的改進:在水稻分蘗期，在水稻葉片上采用剪葉法侵染白葉枯病菌。
[0007]作為本發明的在水稻中檢測受白葉枯病誘導表達基因的有效方法的進一步改進:
[0008]表達基因為0s03g0853200、OsPRlb, OsNPRl 等；
[0009]當表達基因為0s03g0853200時，引物為:
[0010]5， -GAGCAACGACCAACAAAAG-3，和 5， -GCAGAAAATGGGAAAGAAG-3，；[0011]當表達基因為OsPRlb時，引物為:
[0012]5’ -GGCAACTTCGTCGGACAGA-3’ 和 5’ -CCGTGGACCTGTTTACATTTTCA-3’ ；
[0013]當表達基因為OsNPRl時，引物為:
[0014]5’ -CTGATCCGGTTTCCCTCGGA-3’ 和 5’ -GACCTGTCATTCTCCTCCTTG-3’。
[0015]本發明的方法提供了有效的取樣方法，采用本發明的方法能最有效地檢測到基因受白葉枯病菌的誘導表達。
[0016]本發明的過程如下:
[0017]通過Real-time PCR技術，發明人發現了水稻一個基因(GenBankaccession:0s03g0853200)受白葉枯病基因的誘導表達，在動物中該基因的同源基因參與機體的免疫應答。為了分析該基因(0s03g0853200)在接種白葉枯病菌的水稻葉片中的表達情況，發明人首先采用剪葉法(Kauffman et al.，1973)對水稻抗病品種IRBB7和感病品種IR24接種白葉枯病菌，用沾了菌液的剪刀在葉片頂端橫向剪去一段，在剪過的傷口處白葉枯病菌會沿著維管束向葉片基部方向侵染；然后，根據離剪口的距離，將接種的葉片分成I至V區域(圖1)，每個區域的葉片組織獨立提取總RNA和反轉錄成cDNA，用Real-timePCR分析該基因的表達水平。結果表明該基因在感病品種IR24中沒有被誘導表達，而在抗病品種IRBB7中被顯著性地誘導表達。不過，在葉片I至V區域中該基因表達被誘導的程度不同，在I區的表達量最高，隨著距離剪口處越遠，基因表達越低，在II區的表達量只有I區的一半，到IV區已趨 于本底表達，無誘導表達。以上結果表明，在I至III區域內都能非常明顯地檢測到該基因受白葉枯病菌的誘導表達，但是在I區檢測到的表達量最高，即在距離剪口處Icrn以內可最有效地檢測到基因受白葉枯病菌誘導的表達(圖2)。
[0018]本發明對在水稻中檢測受白葉枯病誘導表達的基因時，如何科學地取樣做了明確的說明，為抗白葉枯病基因的表達分析提供了一種有效的方法，也為其它植物抗病基因的研究提供了借鑒。
[0019]綜上所述，采用本發明的方法能有效的在白葉枯病菌侵染的水稻中檢測出被誘導表達的基因，是發現抗性基因的有效方法，為水稻抗性基因的功能研究和育種利用奠定堅實基礎。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]下面結合附圖對本發明的【具體實施方式】作進一步詳細說明。
[0021]圖1接種白葉枯病菌的水稻葉片分區示意圖；
[0022]圖2葉片不同部位中0s03g0853200基因的Real time_PCR表達分析圖；
[0023]圖3水稻抗病相關基因OsPRlb的Real time-PCR表達分析圖。
[0024]圖4水稻抗病相關基因OsNPRl的Real time-PCR表達分析圖。
【具體實施方式】
[0025]實施例1、
[0026]1、接種體制備方法:
[0027]將白葉枯病菌PX086接種在PDA培養基(馬鈴薯300g/L，葡萄糖30g/L，瓊脂15g/L)上,于28恒.溫培養箱中培養3-4d,用蒸懼水從培養基上洗下菌落,并稀釋成濃度為9X 108cfu/mL的細菌懸浮液。在水稻分蘗期,采用剪葉法(Kauffman et al.，1973)對水稻抗病品種IRBB7和感病品種IR24的葉片侵染白葉枯病菌。在侵染48小時后，根據距離剪
口處的遠近選取I至V區域(圖1)的葉片組織，迅速置于液氮中冷凍，-80保存。
[0028]備注說明:
[0029]距離剪口處O至Icm為區域I,距離剪口處< I至2cm為區域II,距離剪口處< 2至3cm為區域III,距離剪口處< 3至5cm為區域IV,距離剪口處< 5至7cm為區域V。
[0030]備注說明:上述每個區域取樣時是選取該區域中距離剪口最遠之處，即，區域I選取距離剪口 Icm之處，區域II選取距離剪口 2cm之處，其余以此類推。
[0031]2、用RNeasy Plant mini Kit (QIAGEN公司)分別從每一葉片組織的區域I~區域V中每個區域提取總RNA(即為下文中所用的RNA)，參照該試劑盒說明書方法操作。
[0032]將提取的總RNA逆轉錄成cDNA:取5ug總RNA、4uL Oligo (dT) 18引物(濃度為5uM),加 Rnase free water 至 20uL, 72 °C 溫育 5min,再冰浴 IOmin ；加入 10uL5XM_MLVBuffer、3uL dNTP (IOmM each) >IuL RNase Inhibitor (40U/uL)>2uL ReverseTranscriptase M-MLV (200U/uL)和 20uL RNase free water, 42 °C溫育 60min, 72°C 溫育15min，獲得所需的cDNA。
[0033]3、米用 ABI 公司 StepOne Real-Time PCR System,用 Fast SYBR GreenMaster Mix(T0Y0B0 公司 )試劑盒，反應體系為:10uL2XFast SYBR GreenMaster Mix，0.4uL50 X Rox, 0.8uL 基因(0s03g0853200)特異性引物(序列為5’-GAGCAACGACCAACAAAAG-3’和 5’_GCAGAAAATGGGAAAGAAG_3’，濃度均為 5uM，各加 0.4uL)，IuL cDNA 模板(濃度為 10ng/uL)，加 ddH20 至 20uL。
[0034]PCR反應程序為:95預變性5min ；95 ；C6E5s IQ 40個循環；從而獲得相應的CT值。
[0035]備注說明:經常規方法驗證，所得確為基因0s03g0853200。
[0036]以水稻管家基因β -actin作為內參，即將上述反應體系中的“基因(0s03g0853200)特異性引物”改成水稻管家基因β -actin的引物(序列為:5’ -CTTCATAGGAATGGAAGCTGCGGGTA-3’ 和 5’ -CGACCACCTTGATCTTCATGCTGCTA-3’)；其余等同。每個樣品重復3次，使用法處理數據，分析基因的表達水平和差異，具體公式為:
j-QQgyj^-[(樣品目的基因°1值-樣品管家基因°1值)]—[(對照目的基因^1值-對照管家基因^1值)]
[0038]備注說明，上式中:
[0039]樣品目的基因CT值是指:水稻抗病品種IRBB7于目的基因(0s03g0853200)下所得的CT值；
[0040]樣品管家基因CT值是指:水稻抗病品種IRBB7于水稻管家基因β -actin下所得的CT值；
[0041]對照目的基因CT值是指:感病品種IR24于目的基因(0s03g0853200)下所得的CT值；
[0042]對照管家基因CT值是指:感病品種IR24于水稻管家基因β -actin下所得的CT值。
[0043]最終所得的結果如圖2所示。[0044]根據圖2可知:在接種了白葉枯病菌的IRBB7葉片中，在I至III區域內都能非常明顯地檢測到該基因受白葉枯病菌的誘導表達，但是在I區檢測到的表達量最高，即在距離剪口處Icm以內可最有效地檢測到基因受白葉枯病菌誘導的表達。
[0045]實施例2、將實施例1中的基因(0s03g0853200)改成OsPRlb (GenBankaccession:EF061247.1)，將相應的引物序列改為 5’ -GGCAACTTCGTCGGACAGA-3’ 和5，-CCGTGGACCTGTTTACATTTTCA-3，，其余同實施例1。
[0046]備注說明:經常規方法驗證，所得確為基因OsPRlb。
[0047]實驗結果如圖3所不，在感病品種IR24中，該基因沒有受:白葉枯病菌的誘導表達；而在接菌的抗病品種IRBB7葉片的I區域(即距離剪口處Icm以內)，最顯著地檢測到該基因受誘導表達。
[0048]備注說明:受病原菌誘導表達的水稻抗病相關基因OsPRlb是一個公認的抗病標記基因，用以表明植物抗病系統的激活。
[0049]實施例3、將實施例1中的基因(0s03g0853200)改成OsNPRl (GenBankaccession:DQ450948.1)，將相應的引物序列改為 5’ -CTGATCCGGTTTCCCTCGGA-3’ 和5，-GACCTGTCATTCTCCTCCTTG-3，，其余同實施例1。
[0050]備注說明:經常規方法驗證，所得確為基因OsNPRl。
[0051]實驗結果如圖4所不，在感病品種IR24中，該基因沒有受:白葉枯病菌的誘導表達；而在接菌的抗病品種IRBB7葉片的I區域(即距離剪口處Icm以內)，最顯著地檢測到該基因受誘導表達。
[0052]備注說明:受病 原菌誘導表達的水稻抗病相關基因OsNPRl也是一個公認的抗病標記基因，用以表明植物抗病系統的激活。
[0053]最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發明的若干個具體實施例。顯然，本發明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容直接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發明的保護范圍。
【權利要求】
1.在水稻中檢測受白葉枯病誘導表達基因的有效方法，采用Real-timePCR，其特征是: 在水稻葉片上采用剪葉法侵染白葉枯病菌，侵染46~50小時后，取距離剪口處Icm之內的葉片組織進行檢測。
2.根據權利要求1所述的在水稻中檢測受白葉枯病誘導表達基因的有效方法，其特征是:在水稻分蘗期，在水稻葉片上采用剪葉法侵染白葉枯病菌。
3.根據權利要求1或2所述的在水稻中檢測受白葉枯病誘導表達基因的有效方法，其特征是: 所述表達基因為 0s03g0853200、OsPRlb, OsNPRl 等。
4.根據權利要求3所述的在水稻中檢測受白葉枯病誘導表達基因的有效方法，其特征是: 表達基因為0s03g0853200，引物為:
5， -GAGCAACGACCAACAAAAG-3，和 5， -GCAGAAAATGGGAAAGAAG-3，。
5.根據權利要求3所述的在水稻中檢測受白葉枯病誘導表達基因的有效方法，其特征是: 表達基因為OsPRlb，引物為:
5’ -GGCAACTTCGTCGGACAGA-3’ 和 5’ -CCGTGGACCTGTTTACATTTTCA-3 ’。
6.根據權利要求3所述的在水稻中檢測受白葉枯病誘導表達基因的有效方法，其特征是: 表達基因為OsNPRl，引物為:
5’ -CTGATCCGGTTTCCCTCGGA-3’ 和 5’ -GACCTGTCATTCTCCTCCTTG-3 ’。
【文檔編號】C12Q1/68GK103966331SQ201410209468
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年5月17日 優先權日:2014年5月17日
【發明者】馬伯軍, 金彬, 孫青芝, 陳析豐 申請人:浙江師范大學