專利名稱：一種鐵皮石斛的組織培養方法
技術領域：
本發明涉及一種鐵皮石斛栽培方法技術，具體涉及一種鐵皮石斛的組織培養方法。
背景技術：
鐵皮石斛是著名的石斛品種，具有獨特的藥用價值。秦漢時期的《神農本草經》記載鐵皮石斛“主傷中、除痹、下氣、補五臟虛勞羸瘦、強陰、久服厚腸胃”;現代化學和藥理研究表明，鐵皮石斛的主要有效成分是多糖，多糖含量高達20% 30%。因其所含的石斛多糖、生物堿、氨基酸、微量元素等成分具有增強機體的免疫能力，抗氧化，抗衰老，降低血糖，養陰生津，強腎益精，抑制腫瘤細胞，緩解體力疲勞等獨特功效。但是由于野生鐵皮石斛主要 生長在崇山峻嶺的懸崖峭壁之上，因其種子極小，每個蒴果含有大約2000粒種子，細如粉塵且無胚乳，在自然條件下萌發率極低，自然資源十分稀少。加上常年無節制采掘，野生資源日漸枯竭，自然產量不能滿足目前市場需求。本申請人通過現代生物工程植物組織培養技術，實現了鐵皮石斛種質資源的保護和種苗優質快繁，實現了鐵皮石斛的合理生產開發應用。目前均采用植物組織培養技術快速繁育大量優質鐵皮石斛組培苗，在不同的生產階段調整培養基的營養成分。本發明所要解決的技術問題之一是在于提供一種鐵皮石斛試管苗的快速繁育方法。
發明內容
本發明的目的在于提供一種鐵皮石斛的組織培養方法。本發明采用如下技術方案
鐵皮石斛的組織培養方法，包括以下步驟
(1)、播種選取4-6個月齡的飽滿蒴果，用75%酒精進行表面消毒后，將其種子均勻灑在播種培養基上，所述的播種培養基配方為1/2MS+白糖2%+馬鈴薯汁15%，黑暗培養一周后轉入光下培養，無菌萌發25 35天后，即可轉接入原球莖增殖培養基,種子萌發率可達96. 30% ；
(2)、原球莖增殖和分化
將步驟(I)萌發的種子接入原球莖增殖培養基中增殖培養25 35天，所述的原球莖增殖培養基配方為1/2MS +萘乙酸(0. 2-0. 5mg/L) +白糖2%+馬鈴薯汁10%，然后再將種子接入原球莖分化培養基中分化培養40 50天，所述的原球莖分化培養基的配方為1/2MS+ 6-BA (0. 2-0. 5mg/L) + 萘乙酸(0. 2-0. 5mg/L) + 白糖 2%+ 馬鈴薯汁 10% ；
(3)、繼代培養
將步驟(2)分化培養后的原球莖轉入繼代培養基中繼代培養55 65天，所述的繼代培養基的配方為=B5培養基+萘乙酸(0. 5-1. Omg/L) +白糖2% ；
(4)、壯苗生根培養將步驟(3)繼代培養后小苗接入壯苗培養基中壯苗培養55 65天，所述的壯苗培養基的配方為B5培養基+萘乙酸(05-1. 5mg/L)+白糖2% ;然后再接入生根培養基中生根培養40 50天得到壯苗，所述的生根培養基的配方為1/2MS +萘乙酸(05-1. 5mg/L)+白糖2%。所述的所有培養基均附加活性炭0. 5%。，pH值調為6. 1-6. 5，培養條件控制為光照(2000-30001ux, 10-12h/d)、溫度 25±2°C、濕度 60-80%。所述的MS 培養基的配方(mg/L)為KN03 1 900 ；NH4NO3 1650 ；KH2PO4 170 ；MgSO4 7H20 370 ；CaCl2 2 H2O 440 ；KI 0. 83 ；H3BO3 6. 20 ；MnSO4 4H20 22. 3 ；ZnSO4 7H20 8. 60 ；Na2MoO4 2 H2O 0. 25 ；CuSO4 5 H2O 0. 025 ；CoCl2 6 H2O 0. 025 ；Na2 EDTA 2 H2O 37. 30 ；FeS04 7 H2O 27. 80 ;肌醇 100 ;甘氨酸 2. 00 ;鹽酸硫胺素0. 10 ;鹽酸吡哆醇0. 50和煙酸0. 50。所述的B5 培養基的配方(mg/L)為KN03 2 5 00 ； (NH4)2SO4 134 ；NaH2P04 H2O150 ；MgS04 7 H2O 250 ；CaCl2 2 H2O 150 ；KI 0. 75 ；H3B03 3. 0 ；MnS04 4 H2O 10 ；ZnSO4 7H20 2. 0 ；Na2MoO4 2 H2O 0. 25 ；CuSO4 5 H2O 0. 025 ；CoCl2 6 H2O 0. 025 ；Na2 EDTA 2 H2O 37. 3 ；FeS04 7 H2O 27. 8 ;肌醇 100 ;甘氨酸 2 ;鹽酸硫胺素 0. I ;鹽酸吡哆醇0.5和煙酸0.5。本發明的有益效果
I、上述鐵皮石斛組織培養快繁方法，可不受季節約束，全年可進行工廠化生產，且環境容易控制。2、解決了鐵皮石斛品種易退化和變異、種苗參差不齊等問題，生產的鐵皮石斛試管苗品質較高，性狀優良，一致性好，具有廣闊的市場前景。3、使鐵皮石斛種子無菌萌發率高達96. 8%以上。4、提高繼代增殖倍數，快速繁育大量優質種苗，并附加前體物質，有效積累鐵皮石斛試管苗的石斛多糖含量，顯著提高了鐵皮石斛試管苗的質量，同時將試管苗的生長周期從原來的18個月縮短至15個月。
具體實施例方式實施例I :鐵皮石斛的組織培養方法，包括以下步驟
(1)、播種選取4-6個月齡的飽滿蒴果，用75%酒精進行表面消毒后，將其種子均勻灑在播種培養基上，所述的播種培養基配方為1/2MS+白糖2%+馬鈴薯汁15%，黑暗培養一周后轉入光下培養，無菌萌發25 35天后，即可轉接入原球莖增殖培養基,種子萌發率可達96. 30% ；
(2)、原球莖增殖和分化
將步驟(I)萌發的種子接入原球莖增殖培養基中增殖培養25 35天，所述的原球莖增殖培養基配方為1/2MS +萘乙酸(0. 2-0. 5mg/L) +白糖2%+馬鈴薯汁10%，然后再將種子接入原球莖分化培養基中分化培養40 50天，所述的原球莖分化培養基的配方為1/2MS+ 6-BA (0. 2-0. 5mg/L) + 萘乙酸(0. 2-0. 5mg/L) + 白糖 2%+ 馬鈴薯汁 10% ；
(3)、繼代培養將步驟(2)分化培養后的原球莖轉入繼代培養基中繼代培養55 65天，所述的繼代培養基的配方為 B5+萘乙酸(0. 5-1. Omg/L) +白糖2% ；
(4)、壯苗生根培養
將步驟(3)繼代培養后小苗接入壯苗培養基中壯苗培養55 65天，所述的壯苗培養基的配方為B5+萘乙酸(05-1. 5mg/L)+白糖2% ;然后再接入生根培養基中生根培養40 50天得到壯苗，所述的生根培養基的配方為1/2MS +萘乙酸(05-1. 5mg/L) +白糖2%。所述的所有培養基均附加活性炭0. 5%。，pH值調為6. 1-6. 5，培養條件控制為光照(2000-30001ux, 10-12h/d)、溫度 25±2°C、濕度 60-80%。所述的MS 培養基的配方(mg/L)為KN03 1 900 ；NH4NO3 1650 ；KH2PO4 170 ；MgSO4 7H20 370 ；CaCl2 2 H2O 440 ；KI 0. 83 ；H3BO3 6. 20 ；MnSO4 4H20 22. 3 ；ZnSO4 7H20 8. 60 ；Na2MoO4 2 H2O 0. 25 ；CuSO4 5 H2O 0. 025 ；CoCl2 6 H2O 0. 025 ；Na2 EDTA 2 H2O 37. 30 ；FeS04 7 H2O 27. 80 ;肌醇 100 ;甘氨酸 2. 00 ;鹽酸硫胺素
0.10 ;鹽酸吡哆醇0. 50和煙酸0. 50。所述的B5 培養基的配方(mg/L)為KN03 2 5 00 ； (NH4)2SO4 134 ；NaH2P04 H2O150 ；MgS04 7 H2O 250 ；CaCl2 2 H2O 150 ；KI 0. 75 ；H3B03 3. 0 ；MnS04 4 H2O 10 ；ZnSO4 7H20 2. 0 ；Na2MoO4 2 H2O 0. 25 ；CuSO4 5 H2O 0. 025 ；CoCl2 6 H2O 0. 025 ；Na2 EDTA 2 H2O 37. 3 ；FeS04 7 H2O 27. 8 ;肌醇 100 ;甘氨酸 2 ;鹽酸硫胺素 0. I ;鹽酸吡哆醇0.5和煙酸0.5。鐵皮石斛種子無菌萌發率高達96. 8%以上。提高繼代增殖倍數，快速繁育大量優質種苗，并附加前體物質，有效積累鐵皮石斛試管苗的石斛多糖含量，顯著提高了鐵皮石斛試管苗的質量，同時將試管苗的生長周期從原來的18個月縮短至15個月。
權利要求
1.一種鐵皮石斛的組織培養方法，其特征在于包括以下步驟 (1)、播種選取4-6個月齡的飽滿蒴果，用75%酒精進行表面消毒后，將其種子均勻灑在播種培養基上，所述的播種培養基配方為1/2MS+白糖2%+馬鈴薯汁15%，黑暗培養一周后轉入光下培養，無菌萌發25 35天后，即可轉接入原球莖增殖培養基,種子萌發率可達96. 30% ； (2)、原球莖增殖和分化 將步驟(I)萌發的種子接入原球莖增殖培養基中增殖培養25 35天，所述的原球莖增殖培養基配方為1/2MS +萘乙酸(O. 2-0. 5mg/L) +白糖2%+馬鈴薯汁10%，然后再將種子接入原球莖分化培養基中分化培養40 50天，所述的原球莖分化培養基的配方為1/2MS+ 6-BA (O. 2-0. 5mg/L) + 萘乙酸(O. 2-0. 5mg/L) + 白糖 2%+ 馬鈴薯汁 10% ； (3)、繼代培養 將步驟(2)分化培養后的原球莖轉入繼代培養基中繼代培養55 65天，所述的繼代培養基的配方為=B5培養基+萘乙酸(O. 5-1. Omg/L) +白糖2% ； (4)、壯苗生根培養 將步驟(3)繼代培養后小苗接入壯苗培養基中壯苗培養55 65天，所述的壯苗培養基的配方為B5培養基+萘乙酸(05-1. 5mg/L)+白糖2% ;然后再接入生根培養基中生根培養40 50天得到壯苗，所述的生根培養基的配方為1/2MS +萘乙酸(05-1. 5mg/L)+白糖2% ； 所述的所有培養基均附加活性炭O. 5%。，pH值調為6. 1-6. 5，培養條件控制為光照(2000-30001ux, 10-12h/d)、溫度 25±2°C、濕度 60-80%。
2.根據權利要求I所述的鐵皮石斛的組織培養方法，其特征在于所述的MS培養基的配方(mg/L)為KNO3 1900 ；NH4NO3 1650 ；ΚΗ2Ρ04 170 ;MgS04 · 7H20 370 ;CaCl2 · 2H2O 440 ；KI 0. 83 ；H3BO3 6. 20 ；MnSO4 · 4H20 22. 3 ；ZnSO4 · 7H20 8. 60 ；Na2Mo04 · 2 H2O0. 25 ；CuSO4 · 5 H2O 0. 025 ；CoCl2 · 6 H2O 0. 025 ；Na2 · EDTA · 2 H2O 37. 30 ；FeS04 · 7H2O 27. 80 ;肌醇100 ;甘氨酸2. 00 ;鹽酸硫胺素O. 10 ;鹽酸吡哆醇O. 50和煙酸O. 50。
3.根據權利要求I所述的鐵皮石斛的組織培養方法，其特征在于所述的B5培養基的配方(mg/L)為KN03 2 5 00 ； (NH4)2SO4 134 ；NaH2PO4 · H2O 150 ；MgS04 · 7 H2O 250 ；CaCl2 · 2 H2O 150 ；KI O. 75 ；H3B03 3. 0 ；MnSO4 · 4 H2O 10 ；ZnSO4 · 7H20 2. 0 ；Na2MoO4 · 2 H2O 0. 25 ；CuSO4 · 5 H2O 0. 025 ；CoCl2 · 6 H2O 0. 025 ；Na2 · EDTA · 2 H2O.37. 3 ；FeS04 · 7 H2O 27. 8 ;肌醇100 ;甘氨酸2 ;鹽酸硫胺素O. I ;鹽酸吡哆醇O. 5和煙酸 O. 5。
全文摘要
本發明公開了一種鐵皮石斛的組織培養方法，包括以下步驟首先在播種培養基中黑暗培養一周后轉入光下培養，無菌萌發25～35天后，轉接入原球莖增殖培養基中增殖培養25～35天，然后依次經過原球莖分化培養基中分化培養40～50天，繼代培養基中繼代培養55～65天，壯苗培養基中壯苗培養55～65天和生根培養基中生根培養40～50天，本發明鐵皮石斛組織培養快繁方法，可不受季節約束，全年可進行工廠化生產，且環境容易控制，鐵皮石斛種子無菌萌發率高達96.8%以上；本發明提高繼代增殖倍數，快速繁育大量優質種苗，并附加前體物質，有效積累鐵皮石斛試管苗的石斛多糖含量。
文檔編號A01H4/00GK102948368SQ201210452289
公開日2013年3月6日 申請日期2012年11月13日 優先權日2012年11月13日
發明者張建民, 朱新明 申請人:安徽新津鐵皮石斛開發有限公司