專利名稱：兩條水稻mar序列及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及植物基因工程領域，更具體地，本發明涉及兩條水稻來源的MAR序列及其應用。
背景技術：
植物轉基因技術的飛速發展使其成為解決全球性糧食危機、資源短缺、生態惡化和勞動力減少等問題的有效途徑，對農業、醫藥、環保和能源等領域產生了深遠的影響。在植物轉基因技術的發展過程中，轉基因沉默(transgene silencing)的現象是影響其發展的重要因素之一。如何克服轉基因沉默的現象已成為植物轉基因技術發展的熱點之一。目前，研究人員主要通過修飾改造外源基因或者加入調控序列的方法來克服轉基因沉默的現象。
MAR/SAR (Matrix/Scaffold attachment region or Matrix/Scaffold association region,核基質結合區/核骨架附著區)是真核基因組中能夠特異性緊密結合在核基質上的一段DNA序列，在真核基因組中大量存在。現有的研究表明，MAR序列之間不存在序列同源性，沒有保守序列，但卻含有多個共通的核心基元。這些核心基元包括富含AT、復制起始位點、彎曲DNA、扭結DNA、富含TG、拓撲異構酶II識別位點、植物保守基元、 ATC原則和MAR識別特征等。一般而言，MAR序列均富含AT，其他基元并非每個MAR序列都具備。MAR序列長度波動范圍較大,最短的才幾十個堿基對,最長的可達近8000堿基對,但多數MAR序列長度位于600至1200堿基對之間。MAR序列和核基質的特異性結合在進化上具有高度保守性，不同物種來源的MAR序列和核基質可以緊密結合。同時，研究也表明， MAR序列大量存在于染色體上，一般都位于基因間隔區，大多數MAR序列與微型反向重復轉座元件共存。
由于MAR序列本身的特征，不具有保守性和序列同源性，再加上MAR序列分布范圍極廣泛，數量眾多，且大多數MAR序列又不具有較強的外源基因調控功能，因此，要分離和克隆好用的MAR序列是相當困難的。隨著生物信息學的發展和基因組測序的完善，誕生了一些新的MAR預測技術，為MAR的分離和克隆提供了一種新的途徑。其中的 MarFinder (MAR-Wiz)是由英國科學家Dr. Singh開發的最早用于MAR序列預測的技術,具有更高的預測可靠性。
自MAR序列被分離純化以來，其特征和功能就備受研究人員的關注，研究人員將 MAR序列連在報告基因的兩側進行共轉化，發現MAR序列可以在并未改變報告基因拷貝數的情況下使其在受體內高效、穩定表達。目前，MAR序列的作用機制仍無定論，但其調控功能確已被廣泛認同。基本認同MAR序列在植物轉基因技術中對外源基因的轉化效率、表達水平和穩定性以及遺傳穩定性都具有明顯的調控作用，能有效降低或消除轉基因沉默現象的發生。
在植物轉基因技術中，所有來源于非宿主來源的外源DNA片段都被認為是不安全的，都可能存在生物安全性的問題。選擇宿主來源的DNA片段來盡可能替換外源DNA的使CN 102911936 A書明說2/8頁用，已經成為目前研究人員在植物轉基因技術中的一大趨勢。在轉基因水稻的研究中，選擇水稻來源的MAR序列來調控外源基因的表達被認為是一種更安全的方式。發明內容
鑒于以上情況，為了獲得水稻來源的MAR(matrix attachment region,MAR)序列， 降低或消除轉基因沉默現象給植物轉基因技術發展造成的阻礙和負面影響，本發明提供了兩條水稻來源的MAR序列，并將其應用于植物轉基因技術中，提高了外源基因的表達水平和穩定性，有效地降低或消除了轉基因沉默現象的發生。
本發明提供了兩條水稻來源的MAR的核苷酸序列，所述MAR的核苷酸序列如SEQ ID NO. I 和 SEQ ID NO. 2 所示。
所述MAR的核苷酸序列包括MAR序列的核心基元；所述MAR序列的核心基元包括富含AT、復制起始位點、彎曲DNA、扭結DNA、拓撲異構酶II識別位點、ATC原則和MAR識別特征。
本發明的另外一個目的在于將所述的水稻來源的MAR的核苷酸序列應用于植物轉基因技術中，并獲得穩定高效表達外源基因的轉基因植株。該應用是將所述水稻來源的 MAR的核苷酸序列連入外源基因的兩側，構建表達載體，并將表達載體轉化植株并獲得轉基因植物； 所述外源基因為GUS基因；所述植物為單子葉植物；所述植物是雙子葉植物；所述單子葉植物為水稻、玉米、小麥、高粱、燕麥、黑麥、大麥、小米、糖甘蔗和禾草中的任一種；所述雙子葉植物為大豆、莢果、油菜籽、棉花、向日葵、番茄、土豆、甜菜、紫花苜蓿、丁香和花生中的任一種。
本發明的顯著優點本發明獲得了兩條新的水稻來源的MAR序列，并將其應用于植物轉基因技術中，能夠大大地提高外源基因的表達水平和穩定性，有效地降低或消除轉基因沉默現象的發生，有助于促進植物轉基因技術的發展和應用，具有顯著的經濟效益和社會效益。
圖I為人工設計合成的多克隆位點短片段的序列及其所包含的限制酶酶切位點。
圖2為植物表達載體pCAMBIA1300-Ml-濟As的質粒圖譜。
圖3為植物表達載體pCAMBIA1300-M2-濟As的質粒圖譜。
圖4為陽性對照表達載體pCAMBIA1300-^as的質粒圖譜。
圖5為潮霉素基因Hyg的PCR檢測的電泳結果。第I至第3泳道為轉 pCAMBIAl300-^5陽性對照轉基因水稻的植株；第4至第6泳道為轉pCAMBIA1300_Ml-#s 的水稻的陽性植株；第7和第8泳道為非轉基因水稻的陰性對照；第9至第11泳道為轉 pCAMBIA1300-M2-^5的水稻的陽性植株；第12泳道為ddH20的陰性對照 ’第13泳道為DNA Marker。4
圖6為轉基因水稻葉片的⑶S酶活分析。轉Ml水稻是指轉pCAMBIA1300-Ml-典s 質粒的轉基因水稻；轉M2水稻是指轉pCAMBIA1300-M2-^as質粒的轉基因水稻；陽性對照是指轉pCAMBIAUOO^as質粒的轉基因水稻；陰性對照是指非轉基因水稻。
具體實施方式
本發明的兩條水稻來源的MAR序列是通過如下步驟獲得的1)利用水稻基因組數據庫的信息結合MAR序列預測技術MAR-Wiz的預測分析確定候選的MAR序列；2)根據確定候選的MAR序列設計合成引物，通過PCR擴增的方法從水稻基因組DNA中克隆出候選MAR序列，并經過測序驗證；分離和克隆候選MAR序列；3)將分離和克隆到水稻的候選MAR序列經序列分析，驗證候選MAR序列是否符合MAR 的序列特征；4)將驗證后的候選MAR序列構建于植物轉基因(報告基因GUS)的兩側，并將構建物轉化水稻，獲得轉基因水稻植株；5)通過檢測轉基因水稻葉片中報告基因GUS的表達水平與不含MAR序列的對照轉基因水稻的比較，來分析和判斷候選MAR序列是否提高了外源基因的表達水平和穩定性，從而確定候選MAR序列是否為所需要的水稻MAR序列。
以下結合具體實施例進一步闡述本發明，但是本發明不限于此。本發明所用的實驗材料如無特別說明均為市售購買產品。(以下實施例的實驗材料為日本晴水稻(Piyza sativa L. japonica cv.))實施例I :候選MAR序列的篩選根據AT-Richness、高表達基因的含量，選取富含AT-Richness和高表達基因的染色體用于篩選候選MAR序列。在BGI (Beijing Genomics Institute, BGI)水稻基因組數據庫中查看染色體的基因圖譜，選定基因密集區的功能基因(簇)間隔間的DNA序列作為待分析序列，長度一般為3 5kb。選擇AT含量位于“65% ( AT% ( 80%”的序列，再通過MAR-Wiz在線分析(網址http://genomecluster. secs. Oakland, edu/)進行復篩。
MAR-ffiz不僅含有常見的MAR序列特征基兀，如ORI Pattern、TG-Richness Pattern、Curved DNA Pattern、Kinked DNA Pattern、Topo II Pattern、AT-Richness Pattern和ATC Rule等，還包括了適應本研究從水稻基因組篩選MAR序列的需要的“Plant MAR Consensus，，。
使用MAR-Wiz分析待測序列時,首先在MAR Finder Home Page遞交待測序列,根據需要選擇MAR Rules(本研究選中了 Core MAR Rules和New MAR Rules中所有基元和規則)， 使用默認參數或者重新設定相關參數(如Sliding Window Parameters和Peak Detection Parameter，本研究一般選用默認參數)。遞交序列后，MAR-Wiz將待測序列的詳細分析結果輸出，根據MAR-Wiz分析結果，選擇“Minimum Potential ^ I. 0000,具備核心區間(Core Region)和全部MAR Motifs”的序列作為候選MAR序列。正如文獻綜述中所說,TG-Richness 僅為一些MAR序列所有。同時，復篩序列中僅有少數序列含有TG-Richness。因此，也可將 “不含TG-Richness,但含有核心區間或具備較高MAR Potential ”的復篩序列納入候選MAR 序列。候選MAR序列的特征分析如表I所示。
表I候選MAR序列中所含MAR序列的核心基元種類及其數目實施例2 :候選MAR序列的克隆2.I水稻葉片基因組DNA的提取提取植物基因組DNA，采用CTAB法，過程如下取約O. Ig的水稻葉片在液氮中磨成粉末，將適量的粉末材料轉移至I. 5mlEP管中。加 Λ 600μ1預熱(95°C)的I. 5X CTAB緩沖液，然后65°C溫浴45min。取出EP管，冷卻至室溫后加入600μ1氯仿異戊醇(24:1)混合均勻，然后IOOOOrpm離心lOmin，取出后吸取上清液到另一新的EP管中。加入2/3體積的異丙醇混合均勻，冰浴至DNA絲狀物出現。稍微離心沉淀DNA，倒掉上清液。加入600μ175%乙醇洗滌，放置30min。倒掉上清液，室溫下吹干 DNA。加入ΙΟΟμΙ ddH20溶解DNA。電泳檢測植物總DNA含量。
2. 2 PCR擴增候選MAR序列根據候選的兩條MAR序列，分別設計合成兩對引物(SEQ ID NO. 3) M1F 5’-GCGCAGCTGATTCCTCCCTCTACCTATGTTTG-3’(SEQ ID NO. 4) M1R 5’-GCGCAGCTGCATCCCTGTAAAAGGAAGAGTAG-3’ 和 (SEQ ID NO. 5)M2F 5’-GCGCAGCTGTCAATACACAAGTCCGAGTCGC-3’(SEQ ID NO. 6)M2R 5’-GCGCAGCTGACCTCCTCCAAAACCTAATCAC-3’ 用來擴增候選 MAR 序列Ml和M2。
PCR反應體系如下成分濃度體積基因組模板DNA50 ng/μ II uldNTP2. 5 mM4 ulTaq酶緩沖液10倍5 ul引物10 μ M5 ulTaq酶2. 5 U加ddH20至總體積50ul οPCR反應程序分別為Ml :94°C，5分鐘;94°C，1分鐘，58°C，1分鐘，72°C，1分鐘，29個循環；72°C延伸10分鐘。
M2 :94°C，5 分鐘；94°C，I 分鐘，57°C，I 分鐘，72°C，2 分鐘，29 個循環；72°C延伸 10分鐘。
Ml和M2的PCR擴增產物分別回收連入T載體pMD19_T (TaKaRa公司，大連)中， 經測序驗證和序列比對，克隆MAR序列符合實驗預期。
實施例3 :植物表達載體的構建3.I候選MAR中間載體pMD19T-Ml和pMD19T_M2的獲得將Ml和M2的PCR擴增產物經過瓊脂糖凝膠回收之后，TA克隆的方法連入T載體 PMD19-T中，分別獲得中間載體PMD19T-M1和pMD19T_M2。
3. 2 GUS 表達盒 CaMV35S GUS Tnos 的獲得限制酶歷ζ /ΠΙ和&ORI雙酶切質粒PCAMBIA1300-AGS獲得⑶S片段，經過Klenow 大片段酶處理補平末端之后，插入到被單切并經過T4聚合酶補平處理的質粒pSPROK中，得到質粒pSPGUSA。
3. 3多克隆位點短片段的人工合成與中間載體pMD19-Ts_MCS的獲得為了方便載體的構建，人工設計合成了一段短片段的多克隆位點(設計方案如圖I 所示)，并將合成好的多克隆位點插入到T載體pMD19T-Simple (TaKaRa公司，大連)中得到質粒 pMD19-Ts-MCS。
3. 4 植物表達載體 pCAMBIA1300-Ml-講S 和 pCAMBIA1300_M2_講的獲得限制酶A^zII單酶切質粒pMD19T-Ml獲得MAR序列Ml片段，分別先后以反向重復的方式插入到質粒pMD19-Ts-MCS的Stul位點和&oRV位點獲得質粒pMD19Ts_MCS_Ml。再用限制酶JktII酶切質粒pMD19Ts-MCS_Ml獲得兩個反向重復的Ml片段并用Klenow補平末端， 插入到Λ / /ΙΙΙ單切并Klenow補平末端的質粒pC AMBIA1300中獲得質粒pCAMBIA1300_Ml。 用Hindlll和&oRI雙酶切質粒pSP⑶SA并Klenow補平末端獲得⑶S表達盒片段，插入到質粒PCAMBIA1300-M1的功位點，構建得到植物表達載體ρ0ΑΜΒΙΑ1300-Μ1-#Λ5，質粒圖譜如圖2所示。
通過同樣的構建流程獲得植物表達載體ρ0ΑΜΒΙΑ1300-Μ2^Λ5，質粒圖譜如圖3所/Jn ο
3.5陽性對照表達載體PCAMBIA1300-典s的獲得限制酶和&oRI雙酶切質粒pSP⑶SA獲得⑶S表達盒片段，插入到同樣雙酶切的質粒PCAMBIA1300中，構建得到植物表達載體pCAMBIA1300 質粒圖譜如圖4所/Jn ο
實施例4 :轉基因水稻的獲得4.I NB培養基配方(基本培養基)N6 大量硝酸鉀 KNO3 2830 mg. Γ1，硫酸氨(NH4) 2S04 4 6 3 mg. L_\ 磷酸二氫鉀 KH2PO4 400 mg. Γ1，硫酸鎂 MgSO4 · 7Η20 185 mg. Λ 氯化鈣 CaC12 · 2H20 166 mg. L-1 ；B5 微量硼酸 H3BO4 3 mg. Λ 硫酸錳 MnSO4 .H2O 7. 58 mg. Λ 硫酸鋅 ZnSO4 · 7Η20 2 mg. ΙΛ 碘化鉀 KI O. 75 mg. Λ 鑰酸鈉 Na2Mo04 · 2H20 0. 25 mg. Λ 硫酸銅 CuSO4 · 5H20 0. 025 mg. ΙΛ 氯化鈷 CoCl2 · 6H20 0. 025 mg. L-1 ；鐵鹽硫酸亞鐵 FeSO4 · 7H20 27. 8 mg. Γ1，乙二胺四乙酸二鈉 Na2EDTA 37. 3 mg. Γ1 ； 肌醇肌醇 Myo-inositol 100 mg. L-1 ；有機成分鹽酸硫胺素ThiamineHCl 10 mg. I71,鹽酸批卩多醇PyridoxineHCl I mg. I71,尼克酸 Niacin I mg. I71,水解酪蛋白 Casamino acids 300 mg.L—1，谷氨酰胺 Glutamine 250 mg. L-1,腦氨酸 Proline 500 mg. L-1,甘氨酸 Glycine 2 mg. L-1,鹿糖 Sucrose 30000 mg. L-1,瓊脂 Phytagel 2400 mg. L-1 pH 值 5· 8-5. 9。
注意有機成分不能高壓滅菌，須用濾器抽濾，分裝后-20°C保存 4.2愈傷組織的培養取水稻幼穗開花12-15 d后的幼嫩種子，剝去穎殼，于75%的乙醇滅菌O. 5-1 min, 再用10-30%次氯酸納溶液滅菌15-30 min,超凈臺中無菌水沖洗3_4遍，置于無菌濾紙上晾干。用鑷子及解剖針取出幼胚，置于誘導培養基(基本培養基+ 2，4 - D 2 mg L-1 ；pH 5.S-5.9)上，27° C暗培養。10-15 d后切除幼胚的芽鞘等，只留下末端的細胞膨大體，轉7接于新的誘導培養基(基本培養基+ 2，4 - D 2 mg Γ1 ；pH 5. 8-5.9)中，其后每20 d在誘導培養基上繼代培養I次，3次后獲得生長迅速的胚性愈傷組織作農桿菌轉化。
4. 3農桿菌介導轉化參照BIO-RAD公司電激儀的說明書，將植物表達載體P1300-LF-AGCSGS通過電激法轉化到根癌農桿菌LBA4404中。
取生長旺盛的胚性愈傷組織于滅菌培養皿中，加入相應濃度(0D_值1-2)的農桿菌液(上述載體轉化后的根癌農桿菌LBA4404)浸泡3-5 min后將愈傷組織取出晾干，然后轉接于鋪有一張無菌濾紙的共培養基(基本培養基+ 2，4 - D 2 mg L—1+ AS ΙΟΟμΜ ； pH 5. 2)上，28°C避光共培養2-3 d。共培養后，將愈傷組織轉移到無菌培養皿中，超凈臺中無菌水漂洗3次，再用含羧芐青霉素250 mg L—1的無菌水洗I次以殺除農桿菌，取出愈傷組織后用無菌濾紙吸干，轉接于含羧芐青霉素250 mg L—1和hygromycin 50 mg L—1或PPT 15 mg L—1的篩選培養基(基本培養基+ 2， 4 - D 2 mg Γ1 +羧芐青霉素250 mg Γ1 + hygromycin 50 mg Γ1 (或 PPT 15 mg L'pH 5· 8-5.9)上 28 °C避光培養篩選抗性愈傷組織。侵染過的愈傷組織在篩選培養基上培養20-30 d后，將邊緣長出的抗性愈傷組織轉接于新的篩選培養基上繼續篩選1-2次。
在篩選培養基篩選獲得的抗性愈傷組織轉接于分化培養基(基本培養基+ KT 10 mg I/1+ NAA 0.4 mg Γ1 ；ρΗ 5. 8-5. 9)上，28°C暗培養 7-10 d，然后移至光照下(14 h/d) 培養，隨后逐漸長出綠點，最后分化成小苗。小苗完全分化后，轉接于生根培養基中(1/2 MS無機鹽(指無機鹽含量減半)+ MS有機成分(是指NB培養基配方(基本培養基)中的有機成分，包含鹽酸硫胺素ThiamineHCl 10 mg.廠1,鹽酸批卩多醇PyridoxineHCl I mg. I71, 尼克酸 Niacin I mg. I71,水解酪蛋白 Casamino acids 300 mg. I71,谷氨酸胺 Glutamine 250 mg. L \ 腦氛酸 Proline 500 mg. L S 甘氛酸 Glycine 2 mg. L \ 鹿糖 Sucrose 30000 mg. I71,瓊脂 Phytagel 2400 mg. L-1) + hygromycin 30 mg L-1 (或 PPT 10 mg L-1) ；pH 5. 8-5.9)28 °C，光照14 h/d培養14-21 d進行生根并篩選。生根后獲得的抗性小苗洗去根部培養基后，移于1/10 MS營養液水培3-5 d可長出新根，然后移栽于溫室或網室水田。
4.4轉基因水稻的PCR檢測采用CTAB法提取植物基因組DNA，過程如實施例2的2. I節所述。
PCR檢測再生植株中潮霉素(hyg)抗性基因，根據潮霉素(hyg)抗性基因的序列特異性合成一對引物，如下(SEQ ID NO. 7)上游引物為5’ -TACACAGCCATCGGTCCAGA-3’(SEQ ID NO. 8)下游引物為5’-TAGGAGGGCGTGGATATGTC-3’PCR反應體系如實施例2的2. 2節所述。
PCR反應程序-MV，5分鐘-MV，I分鐘，56。。，I分鐘，72°C，I分鐘，35個循環； 72°C延伸10分鐘。
轉基因PCR檢測的結果參見圖5所示，能擴增出840bp條帶的樣品為轉基因水稻陽性植株，結果表明樣品1-6和9-11均為轉基因陽性植株。
實施例5 :轉基因水稻葉片的⑶S酶活分析5.I水稻葉片GUS蛋白的提取葉片選取幼嫩葉片靠近葉尖部位，約5-10mg，放入2ml離心管中，每管加600 μ I⑶SCN 102911936 A書明說7/8頁extraction buffer (50mM NaHPO4 (憐酸緩沖液)，pH7. O, 10 mM 2-mercaptoethanol, IOmM Na2EDTA, O. I % sodium lauryl sarcosine, 0. 1% Triton X-100)。然后每管加入一粒直徑約6mm不銹鋼珠，在QIAGEN公司的磨樣器TissueLyser上以每分鐘20次的頻率震動磨樣5分鐘。接著于冷凍離心機上4°C 13000轉/分鐘離心10分鐘，將上清轉入96孔微孔板中，注意記錄樣品所對應的孔號。硅膠板密封，保存于4°C備用，盡快于2天之內檢測完成。
5.2總蛋白的測定總蛋白的定量測定采用經典的Bradford法(1976)，具體操作參照天根生物(北京)公司的Bradford蛋白質定量試劑盒(目錄號PA102)的說明書進行。考馬斯亮藍G-250染液為自己配制，BSA標準品采用上述試劑盒提供的，試驗采用96孔微孔板進行測定。反應體系采用285 μ I考馬斯亮藍G-250染液+15 μ I蛋白溶液，標準曲線制作中增加標準品BSA的濃度范圍，標準品濃度分別選取 0、1/15、2/15、3/15、4/15、5/15、6/15、7/15、8/15、9/15 mg/ ml進行測定。以不同的BSA標準品濃度與對應的OD595值在Excel表里制作散點圖，并求出兩者的相關性方程以及變異程度R2值。待測樣品的濃度若超出該標準曲線的范圍，則需要適當稀釋之后重新測定，最終的濃度值需要根據具體的稀釋度換算回去。
5. 3⑶S酶活熒光測定標準曲線的制作GUS 酶活測定主要參照 Pharmacia Biotech 公司的 DyNA Quant 200 Fluorometer 的使用手冊進行。稱取4-MU鈉鹽(分子量198. 20)19. 8mg溶于IOOml去離子水中，得到4-MU stock solution A。取 10μ1 4-MU stock solution A加入到 10ml 去離子水中，得到 4-MU stock solution B。按照每管加 0、25、50、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900、 1000 μ I 的 4-MU stock solution B,然后分別用 0. 2M 的 Carbonate stop buffer 補足到 1000 μ 1，每管取200 μ I去熒光檢測儀上讀數測定。以不同的4-MU濃度對應不同的熒光讀數在Excel表里制作散點圖，并求出兩者的相關性方程以及變異程度R2值。
5. 4⑶S蛋白酶的酶促催化反應取一塊96孔微孔板置于冰上預冷，然后每孔迅速加入50 μ I預冷的⑶S assay buffer,再快速加入每孔50 μ I的待測樣品蛋白溶液，封板紙進行密封。快速放入37°C培養箱中保溫45分鐘，然后每孔迅速加入900 μ I 0. 2Μ的Carbonate stop buffer (0. 2M Na2CO3)終止反應。
5. 5⑶S酶活的熒光測定基本參照Thermo Scientific公司的熒光測量儀FLU0R0SCAN ASCENT FL說明書進行操作。濾光片組選擇激發波長為355nm的濾光片和發射波長為460nm的濾光片,放大系數為5/1，掃描方式為終點測定，以不加任何樣品的空白孔作為空白陰性對照。采用96孔酶標板的微孔板進行測定，每孔加樣200 μ I。若樣品的熒光值大于或接近標準曲線中的最大值，則該樣品需要適當稀釋之后重測。
5.6⑶S酶活數據的分析GUS酶活力的單位定義為單位時間內單位質量的GUS酶蛋白催化產生的具有熒光活性的4-MU的摩爾數，具體為每分鐘每毫克酶蛋白催化所產生的4-MU的皮摩爾數(即pmol/mg/ min)。GUS酶活數據均換算成標準的酶活力單位，根據不同的酶活力單位來判斷濟As基因的表達水平。9
轉表達載體pCAMBIA1300-Ml-濟As、pCAMBIA1300_M2-濟As 和陽性對照轉 pCAMBIAl300-^5的轉基因水稻以及陰性對照非轉基因水稻的單株葉片的GUS酶活的測定結果如圖6所示。陰性對照的⑶ S酶活接近于零的水平，可以忽略不計。陽性對照的⑶S 酶活大多處于300-1400 (單位pmol/mg/min)之間,平均約660 (單位pmol/mg/min)。轉 pCAMBIA1300-Ml-^5的轉基因水稻的⑶S酶活大多處于2000-5000 (單位pmol/mg/min) 之間,平均約3300 (單位pmol/mg/min)。轉pCAMBIA1300_M2_典s的轉基因水稻的⑶S酶活大多處于 9000-13000 (單位pmol/mg/min)之間，平均約 12400 (單位pmol/mg/min)。 結果說明，無論從轉基因水稻的單株GUS酶活水平還是群體的GUS酶活均值，MAR序列的存在都有效提高了外源基因的表達水平。另外，從單株之間的差異來看，帶有MAR序列的轉基因水稻明顯比陽性對照的群體內的差異要小，表明MAR序列的存在提高了外源基因的表達穩定性。
以上對本發明的詳細描述并不限制本發明，本領域技術人員可以根據本發明做出各種改變和變形，這些改變和變形均應屬于本發明所附權利要求的范圍。
權利要求
1.一條水稻來源的MAR的核苷酸序列，其特征在于所述MAR的核苷酸序列如SEQ IDNO. I所示。
2.一條水稻來源的MAR的核苷酸序列，其特征在于所述MAR的核苷酸序列如SEQ IDNO. 2所示。
3.根據權利要求I或2所述的MAR的核苷酸序列，其特征在于所述MAR的核苷酸序列包括MAR序列的核心基元；所述MAR序列的核心基元包括富含AT、復制起始位點、彎曲DNA、扭結DNA、拓撲異構酶II識別位點、ATC原則和MAR識別特征。
4.如權利要求I或2所述的水稻來源的MAR的核苷酸序列的應用，其特征在于該應用是將所述水稻來源的MAR的核苷酸序列連入外源基因的兩側，構建表達載體，并將表達載體轉化植株并獲得轉基因植物。
5.根據權利要求4所述的水稻來源的MAR的核苷酸序列的應用，其特征在于所述外源基因為GUS基因。
6.根據權利要求4所述的水稻來源的MAR的核苷酸序列的應用，其特征在于所述植物為單子葉植物。
7.根據權利要求4所述的水稻來源的MAR的核苷酸序列的應用，其特征在于 所述植物是雙子葉植物。
8.根據權利要求6所述的水稻來源的MAR的核苷酸序列的應用，其特征在于所述單子葉植物為水稻、玉米、小麥、高粱、燕麥、黑麥、大麥、小米、糖甘蔗和禾草中的任一種。
9.根據權利要求7所述的水稻來源的MAR的核苷酸序列的應用，其特征在于所述雙子葉植物為大豆、莢果、油菜籽、棉花、向日葵、番茄、土豆、甜菜、紫花苜蓿、丁香和花生中的任一種。
全文摘要
本發明提供了兩條水稻來源的MAR的核苷酸序列，所述MAR的核苷酸序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示。所述MAR的核苷酸序列包括MAR序列的核心基元；所述MAR序列的核心基元包括富含AT、復制起始位點、彎曲DNA、扭結DNA、拓撲異構酶II識別位點、ATC原則和MAR識別特征。本發明將所述水稻來源的MAR的核苷酸序列連入外源基因的兩側，構建表達載體，并將表達載體轉化植株，能夠大大地提高外源基因的表達水平和穩定性，有效地降低或消除轉基因沉默現象的發生，有助于促進植物轉基因技術的發展和應用，具有顯著的經濟效益和社會效益。
文檔編號A01H5/00GK102911936SQ20121047628
公開日2013年2月6日 申請日期2012年11月22日 優先權日2012年11月22日
發明者王 鋒, 胡太蛟, 武建偉 申請人:福建省農業科學院生物技術研究所