專利名稱：：水稻類伸展蛋白OsPEX1及其應用的制作方法
技術領域：
：本發明屬于植物基因工程領域，具體涉及一種水稻類伸展蛋白OsPEXl及其應用。本發明利用Ds轉座子標簽技術，通過正向遺傳學方法，從水稻Ds插入突變體庫中得到了一個控制水稻株高的基因OsPEXl，并通過轉基因互補試驗證明了OsPEXl基因的功能；本發明還涉及利用該基因或其功能類似基因來培育株高降低的水稻的方法。本發明的水稻類伸展蛋白基因OsPEXl與水稻植株矮化相關，對豐富水稻矮源具有重要意義。
背景技術：
：類伸展蛋白(Extensin-likeprotein)基因家族是近幾年鑒定的一類新的基因家族，它們編碼的蛋白存在于多種植物的細胞壁中并可能在細胞壁形成過程中起調節作用，因其編碼的蛋白含有1個富含亮氨酸的重復序列(LRR)和1個伸展蛋白結構域，這個家方矣又禾爾為LRX家方矣(Leucine-RichRepeats/Extensins)(RubinsteinAL，BroadwaterAH，LowreyKB，etal.Pexl，apollen-specificgenewithanextensin-likedomain.ProcNatlAcadSciUSA，1995，92(8):3086-3090；BaumbergerN，RingliC，KellerB.Thechimericleucine-richrepeat/extensincellwallproteinLRXlisrequiredforroothairmorphogenesisinArabidopsisthaliana.GenesDev,2001,15(9)1128-1139.)0在結構上，LRR結構域高度保守，而伸展蛋白結構域在長度和氨基酸序列組成方面都是高度可變的。植物類伸展蛋白具有LRR結構域和伸展蛋白結構域，可能參與蛋白之間的相互作用或細胞相互作用的信號分子。在植物中，LRRs蛋白經常參與蛋白之間的相互作用。例如，信號轉導，病原體識別和防御，酶抑制劑等。對擬南芥的研究也支持LRX蛋白家族的LRR結構域參與蛋白質相互作用的觀點。伸展蛋白結構域是大部分細胞壁結構蛋白所具有的結構域，其中羥脯氨酸和色氨酸殘基常被半乳糖或阿拉伯糖糖基化，屬于富含羥脯氨酸糖蛋白家方矣(HRGPs)(CassabGI.Plantcellwallproteins.AnnuRevPlantPhysioPlantMolBiol,1998,49(1):281)。在動物中，只有膠原質和彈性蛋白屬于這個家族，它們在結構和發育中起著重要的作用。在植物中，它們可能作為結構蛋白或細胞相互作用的信號分子。對番茄的研究表明，類伸展蛋白LePEXl可能是信號分子的受體(RingliC.TheroleofextracellularLRR-extensin(LRX)proteinsincellwallformation.PlantBiosyst,2005,139(1):32-35)。鑒于LRX蛋白家族的保守作用，其他蛋白應該也有相似的功能，但有待于證明。根據系統發生關系和表達狀況可以將LRX基因分為2類在營養組織中特異表達的基因，通常用LRX表示；在繁殖器官中特異表達的基因，通常用PEX(Pollenextension-like)表示(魯朝霞，蘇磊，單雷，等.擬南芥LRR-Extensin蛋白家族的研究.安徽農業科學，2006，3403):6148-6150).LRX蛋白的功能眾多，除了促進細胞生長外，還影響營養生長、形態發生、授粉受精等，隨細胞基質不同具有不同的功能，并表現出高度的組織、器官和細胞特異性。LRX蛋白同源比對表明，水稻類伸展蛋白有8個，第1染色體有2個，第2、5、6、7、11、12染色體各有1個(BaumbergerN,DoessegerB,GuyotR,etal.Whole-genomecomparisonofleucine—richrepeatextensinsinArabidopsisandrice.Aconservedfamilyofcellwallproteinsformavegetativeandareproductiveclade.PlantPhysiol,2003,131(3):1313-1326)0但是，水稻不同LRX基因的時空表達特性及確切的生物學功能尚不清楚。水稻是世界上最重要的糧食作物之一，是單子葉植物基因組研究的模式植物。鑒定和克隆重要農藝性狀的基因對改良水稻的生產性能和品質具有重要意義。株高是水稻株型建成重要的農藝性狀之一，直接影響水稻品種的豐產潛力和抗倒性能。目前，獲得的矮稈和半矮稈基因已有70余個，其中有55個以d命名的矮稈基因及少數半矮稈基因；半矮稈基因以sd命名，目前已報導的有15個；其中30多個基因所在的染色體已被確定，用分子標記定位的水稻矮生基因有14個，其中部分基因已被克隆(于永紅，斯華敏.水稻矮化相關基因的研究進展.植物遺傳資源學報，2005，6(03):344-347)。目前克隆的矮稈基因多屬赤霉素(GA)信號傳導途徑或油菜素類固醇(BR)途徑，而植物激素與水稻株高的生理生化研究表明，除赤霉素(GA)和油菜素內酯(BR)外，其它激素例如，生長素(IAA)脫落酸(ABA)和乙烯均影響水稻莖的伸長(高奮明，姜勇，孔德偉，等.水稻株高的遺傳控制及其在育種上的應用.分子植物育種，2005，3(1):87-93)。要全面了解矮化作用機理，需要鑒定和克隆更多的矮稈基因。
發明內容為克服現有技術的不足，本發明的首要目的在于提供一種水稻類伸展蛋白OsPEXl。本發明的又一目的是提供上述水稻類伸展蛋白OsPEXl的應用。本發明的目的通過以下技術方案實現水稻突變體是研究水稻基因功能的理想材料。本發明利用已有的水稻Ds插入突變體庫篩選到一個矮桿突變體，所述突變體庫的創建詳見文獻劉芳，張向前，張澤民，等.水稻Ac/Ds系統的Ds轉座行為.科學通報，2007，52(14):1649_1655。Ds轉座檢測表明Ds轉座與突變表型共分離。通過TAIL-PCR(ThermalAsymmetricInterlacedPCR)(參見LiuYG,WhittierRF.ThermalasymmetricinterlacedPCRautomatableamplificationandsequencingofinsertendfragmentsfromPlandYACclonesforchromosomewalking.Genomics,1995,25(3):674-681)獲得Ds旁鄰的水稻DNA序列，生物信息學分析旁鄰序列，確定該突變體候選基因位于水稻第11染色體，屬于類伸展蛋白基因家族的PEX亞家族，命名為OsPEXl(Pollenextension-like),目前尚沒有關于該基因功能方面的研究。基于上述說明，本發明提供一種水稻類伸展蛋白OsPEXl，其氨基酸序列如SEQIDN0:2所示，或者是如SEQIDNO:2所示的氨基酸序列通過一個或多個氨基酸替換、插入、缺失而獲得的仍具有控制株高功能的類似物。上述水稻類伸展蛋白OsPEXl由水稻類伸展蛋白基因OsPEXl編碼，該基因為下列A、B、C三種核苷酸序列之一A序列表SEQID1所示的DNA序列；B編碼與A編碼蛋白質相同的蛋白質的DNA序列；C以上A和B通過堿基插入、缺失或替換而獲得的仍具有控制株高功能的類似物。含有上述水稻株高相關蛋白編碼基因的重組載體、轉基因細胞系和重組菌也屬于本發明的保護范圍。上述水稻類伸展蛋白OsPEXl的應用，是將編碼該蛋白質的OsPEXl基因用于培育株高降低的水稻，方法是將含有OsPEXl基因的重組表達載體導入植物細胞，獲得株高降低的轉基因水稻；也可利用上述株高降低的轉基因水稻作為供體親本，通過回交選育法改良水稻株高，即通過將所獲得的株高降低的水稻與擬改良的高桿水稻品種(輪回親本)雜交，然后雜交后代經多次與輪回親本雜交以選育株高降低的水稻。所述含有OsPEXl基因的重組表達載體可用現有的植物表達載體構建；所述植物表達載體包括雙元農桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等，如PCAMBIA1300、pCAMBIA2300、pCUbil390等；含有OsPEXl基因的重組表達載體可通過基因槍、顯微注射、原生質體介導、花粉管通道、農桿菌介導等各種物理、化學及生物學方法導入到宿主植物細胞或組織中；所述宿主植物包括但不限于水稻、小麥、玉米、高粱、谷子、甘蔗、棉花、番茄、苜蓿和象草；被導入的宿主植物優選為水稻。在構建含有OsPEXl基因的重組表達載體時，在OsPEXl基因的轉錄起始核苷酸前可加上任何一種增強型、組成型、組織特異性或誘導型啟動子，如35S啟動子、Ubi啟動子寸。為了便于對轉基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所用植物表達載體進行改造后再使用，包括加入GUS、GFP等報告基因、抗生素抗性基因或其它抗化學試劑標記基因等。本發明通過Ds轉座子標簽技術首次從水稻突變體庫分離克隆了OsPEXl基因，該基因編碼一個水稻類伸展蛋白。突變體表型分析及互補分析表明OsPEXl基因在控制水稻株高方面起重要作用。另一方面，對該基因的研究有助于人們了解水稻生長發育的分子機制，利用現代基因工程方法，設計育種，對提高谷物產量具有重要作用。同時，利用該基因的功能特性，在水稻中進行分子設計育種，選育適宜的水稻株高的品種具有很強的可操作性。本發明的突變體株高明顯變矮，突變基因OsPEXl的克隆和功能分析有助于進一步理解水稻株高調控的分子遺傳學機制。圖1為水稻OsPEXl突變體的表型。左圖為野生型中花11，中圖為突變雜合體；右圖為突變體純合體。圖2為Ds轉座與突變體的表型共分離的分子檢測。MIOObpDNAladder；1，6為轉座純合體；2，3，5為轉座雜合體；4，7，8為Ds供體(Ds-T-DNA)。圖3為水稻OsPEXl基因結構及Ds插入位點。▽表示Ds轉座子，5'和3'分別表示Ds轉座子的5'末端和3'末端。圖4為水稻OsPEXl突變體Ds插入位點的基因型檢測。圖5為OsPEXl基因的表達分析圖。圖6為水稻OsPEXl基因過量表達載體示意圖。圖7為水稻OsPEXl基因過量表達轉基因植株表型。具體實施例方式下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限于此。實施例lOsPEXl基因的分離克隆1.OsPEXl突變體的獲得通過水稻Ds-T-DNA轉化純合體和Ac_T_DNA轉化純合體的雜交，構建了水稻的轉座子插入突變體庫，詳見文獻劉芳，張向前，張澤民，等.水稻Ac/Ds系統的Ds轉座行為.科學通報，2007，52(14):1649-1655.利用上述材料，篩選Ds轉座突變體，發現編號為D260的株系，其株高明顯發生分離，見水稻OsPEXl突變體抽穗期及同期播種的野生型中花11的表型，如圖1所示。其中野生型植株23株，株高87.1士2.3cm；半矮稈類型37株，株高61.4士3.8cm,較野生型矮約25cm；矮稈類型20株，株高46.4士3.Icm,平均株高降低40.7cm,表型變異率46.7%。t測驗結果表明，野生型、半矮稈與矮稈植株株高差異達極顯著水準。卡方測驗表明，株高分離比符合121(233720；χ2=0.68<X2atl5,2=5.99)，即該突變為不完全顯性突變。為驗證突變體的遺傳特性，分別種植野生型、矮稈、半矮稈各2個株系。T1代的2個野生型單株種植后，在T2代全部表現為野生型。來自2個矮稈突變體單株的后代均為矮稈，而2個半矮稈株系發生了野生型、半矮稈與矮稈的分離，兩株系共418株，其分離比符合121(114199105；x2=1.34<X20.05j2=5.99)。以上結果表明突變體OsPEXl為不完全顯性突變。2.分離OsPEXl突變體Ds插入位點旁鄰序列采用TAIL-PCR方法擴增Ds轉座子側翼序列。左右邊界的特異引物依據Ds轉座子DNA序列，參照Kolesnik等(KolesnikT,SzeverenyiLiBachmannD，etal.EstablishinganefficientAc/DstaggingsysteminriceLarge-scaleanalysisofDsflankingsequence.PlantJ，2004，37:301-314)的方法，釆用PrimerPremier5程序設計。隨機簡并引物及反應條件參照Liu等的方法進行，詳見文獻LiuYG，WhittierRF.ThermalasymmetricinterlacedPCR:automatableamplificationandsequencingofinsertendfragmentsfromPlandYACclonesforchromosomewalking.Genomics,1995,25(3):674-681,特異擴增得到的第三輪PCR產物用于測序。反應所用引物見表1，特異擴增得到的第3輪PCR產物用來測序。本實施例的DNA合成、測序服務由北京奧科鼎盛生物科技有限公司提供。表1TAIL-PCR所用引物權利要求1.一種水稻類伸展蛋白OsPEXl，其特征在于該蛋白質具有序列表SEQIDNO:2所示的氨基酸序列，或者是如SEQIDNO:2所示的氨基酸序列通過一個或多個氨基酸替換、插入、缺失而獲得的仍具有控制株高功能的類似物。2.根據權利要求1所述的水稻類伸展蛋白OsPEXl，由一種水稻類伸展蛋白基因OsPEXl編碼，其特征在于所述OsPEXl基因是下列A、B、C三種核苷酸序列之一A序列表SEQID1所示的DNA序列；B編碼與A編碼蛋白質相同的蛋白質的DNA序列；C以上A和B通過堿基插入、缺失或替換而獲得的仍具有控制株高功能的類似物。3.根據權利要求2所述的水稻類伸展蛋白OsPEXl的應用，是將所述編碼該蛋白質的OsPEXl基因應用于培育株高降低的水稻，其特征在于將含有所述OsPEXl基因的重組表達載體導入植物細胞，獲得株高降低的轉基因水稻，或者利用上述株高降低的轉基因水稻作為供體親本，通過回交選育法改良水稻株高，即將所獲得的株高降低的水稻與擬改良的高桿水稻品種雜交，然后雜交后代經多次與輪回親本雜交，選育得到株高降低的水稻；所述含有OsPEXl基因的重組表達載體是用現有的植物表達載體構建。4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于所述含有OsPEXl基因的重組表達載體在構建時，在OsPEXl基因轉錄起始核苷酸前可加上任何一種增強型、組成型、組織特異性或誘導型啟動子。5.根據權利要求3所述的應用，其特征在于所述植物表達載體在使用前先進行改造，包括加入⑶S或GFP報告基因、抗生素抗性基因或其它抗化學試劑標記基因。全文摘要本發明屬于植物基因工程領域，公開水稻類伸展蛋白OsPEX1及其應用。本發明利用水稻Ac/Ds突變體庫分離克隆水稻類伸展蛋白基因OsPEX1，通過互補試驗和株高測定試驗證明基因OsPEX1具有調控水稻株高的功能。本發明克隆的基因OsPEX1屬于類伸展蛋白基因家族，該基因家族在植物生長發育中具有重要作用，其功能眾多，除了促進細胞生長外，還影響營養生長、形態發生、授粉受精等，而本發明克隆的OsPEX1基因具有調節水稻株高的能力，在利用基因工程技術有目的的調控水稻株高等方面具有重要的應用價值。文檔編號C07K14/415GK102432679SQ20111041093公開日2012年5月2日申請日期2011年12月12日優先權日2011年12月12日發明者張向前,朱海濤,解新明申請人:華南農業大學