專利名稱：一種評價轉基因棉花對糞甲蟲影響的檢測方法
技術領域：
本發明屬于轉基因作物生態風險評價技術領域，具體涉及一種評價轉Bt基因棉花對糞甲蟲影響的檢測方法。
背景技術：
目前，轉基因技術已廣泛應用于農業領域，顯著地提高了農作物產量，但由于其不同于傳統意義上的作物育種，人們很難預測基因進入一個新的遺傳背景會產生什么樣的后果。所以，各國科學家在注重轉基因作物帶來效益的同時，也一直關注其潛在的生態風險。
1987年，Vaeck首次報道將Bt殺蟲蛋白基因轉入棉花，開啟了轉基因棉花的大規模種植年代。截至目前，轉基因抗蟲棉種植面積占全球棉花種植面積的20%以上。其中，作為世界上抗蟲棉種植面積最大的國家，我國轉基因抗蟲棉種植面積超過棉花種植總面積的70%。抗蟲棉能有效提高棉花產量、減少殺蟲劑用量、節約勞力等，具有巨大的社會效益和經濟效益。然而，由于不同類型Bt殺蟲蛋白有不同的殺蟲譜，因而轉基因棉花中不同Bt基因表達必然會對鱗翅目、鞘翅目、雙翅目、膜翅目等許多非靶標昆蟲產生影響。因此，隨著轉基因棉花在全球范圍內的大規模種植，對其生態安全性尤其是轉Bt基因對非靶標昆蟲影響的評價工作也大量開展。而對于轉基因棉花可能對土壤動物產生的影響，主要集中于鱗翅目昆蟲及其幼蟲，關于抗蟲棉對土壤動物中的鞘翅目昆蟲影響的評價則很少開展，尤其是鞘翅目中非常重要的一類-糞甲蟲的相關研究尚未見報道。糞甲蟲是一類全變態昆蟲，其生活周期有卵、幼蟲、蛹和成蟲四個階段。糞甲蟲成蟲對新鮮動物糞便(尤其是牛糞)極為喜好，除在牛糞中取食外，還在其中交配、產卵并完成卵化等過程，因此其生活史主要是在動物糞便或其他碎屑系統中完成，是一類典型的大型土壤動物。糞甲蟲在生態系統功能過程如促進養分循環，增加生物擾動，提高植物生產力，二次種子傳播者，控制寄生蟲，與有益寄生蟲的協同進化，控制蒼蠅及傳粉等中具有非常重要的作用。糞甲蟲成蟲為咀嚼式口器，主要取食牛糞中微生物含量高的流質食物和易消化的植物殘渣，固體食物顆粒直徑一般小于O. 03mm，其幼蟲對食物的選擇性不強。環境條件適宜的情況下，糞甲蟲在3-6天就開始產卵，卵化時間在產卵后5天左右開始，其幼蟲階段較長，也可能以幼蟲的形式越冬。因此，通過將棉花粉碎(顆粒直徑小于O. 03mm)與牛糞充分混合后飼養糞甲蟲，能快速有效地檢測抗蟲棉對糞甲蟲群落特征和結構的影響。
發明內容
本發明的目的在于填補目前評價轉Bt基因棉花對糞甲蟲影響的檢測方法空白。本發明的方法，是根據糞甲蟲的取食特點和生活史特征，利用新鮮牛糞與粉碎棉花葉的混合物飼養糞甲蟲，能快速有效地檢測轉Bt基因棉花對非靶標生物的影響。本發明的技術方案是利用新鮮牛糞與粉碎棉花葉的混合物檢測轉Bt基因棉花對糞甲蟲的影響。上述牛糞為新鮮牛糞。
上述粉碎棉花葉為新鮮棉花葉，粉碎后的顆粒直徑小于O. 03mm。本發明具有如下的有益效果
本發明屬于檢測新方法，由于考慮到糞甲蟲的取食特點，將新鮮棉花葉粉碎至顆粒直徑小于O. 03_后，不會影響糞甲蟲及其幼蟲對棉花葉的取食。考慮到糞甲蟲的生活史特征，利用糞甲蟲對新鮮牛糞的依賴性，有效吸引甲蟲，同時牛糞的成本低廉，極大地節約了成本。另外，本發明充分利用糞甲蟲的產卵期和卵化期較短的特征，能夠在短期內檢測到轉基因棉花對甲蟲種群特征的影響，極大地縮短了檢測周期。本發明操作方法簡單，成本低，檢測時間短，對于評價轉Bt基因棉花對糞甲蟲的影響具有廣闊的應用前景。實驗證明，使用本發明所提供的利用新鮮牛糞與粉碎棉花評價轉Bt基因作物對糞甲蟲群落影響的方法，達到了預期目的。
圖I為轉Bt基因抗蟲棉及其親本處理中的甲蟲產卵率比較 圖2為轉Bt基因抗蟲棉及其親本處理中的甲蟲卵化率比較 圖3為轉Bt基因抗蟲棉及其親本處理中的甲蟲成蟲死亡率比較圖。
具體實施例方式本發明的方法主要包括如下四個部分
I、收集新鮮棉花葉并粉碎收集轉Bt基因抗蟲棉及其親本的新鮮棉花葉，于冰箱內在-10°C冷凍24小時后粉碎，顆粒直徑小于O. 03mm。2、收集新鮮牛糞新鮮牛糞中不包含任何大型分解者，避免其他分解者與目標糞甲蟲的相互關系而影響檢測結果。3、新鮮牛糞與粉碎棉花葉均勻混合將不含其它分解者的新鮮牛糞與粉碎的棉花葉按照一定比例充分混合。4、檢測時間檢測開始后的第7、第14和第21天。5、檢測項目成蟲死亡率,產卵率和卵化率。
實施例2012年8月底，收獲轉Bt基因棉花品種(中30)及其親本(中16)的棉花葉各200g帶回實驗室，置于冰箱內于-10°C冷凍24小時后充分粉碎，顆粒直徑小于O. 03mm。將粉碎的棉花葉40g與360g新鮮牛糞均勻混合；將混合樣400g裝入網孔之間為O. 2mm的紗袋內，再將捕獲的糞甲蟲(游蕩蜉金龜)8只接種入紗袋中，將紗袋密封后置于戶外地表；分別于第7，第14和第21天記錄紗袋中的甲蟲卵，幼蟲和成蟲數量，計算其產卵率，卵化率和死亡率。結果顯示，中30處理中的甲蟲產卵率顯著低于中16 (圖I);兩個棉花品種中的卵化率無明顯差異(圖2);在第7天，中30處理中的成蟲死亡率顯著高于于中16處理，至第14天，中30處理中的成蟲死亡率達到100% (圖3)。以上實驗結果表明，轉Bt基因棉花對糞甲蟲具有明顯的影響。因此，利用新鮮牛糞與粉碎棉花葉的混合物檢測轉Bt基因棉花對非靶標糞甲蟲影響的方法是可行的，準確的，快速的。
權利要求
1.一種評價轉基因棉花對糞甲蟲影響的檢測方法，其特征是利用粉碎棉花葉和新鮮牛糞的混合物飼養甲蟲用于評價轉Bt基因棉花對糞甲蟲的影響，具體由以下步驟構成 (O收集新鮮棉花葉并粉碎收集轉Bt基因抗蟲棉及其親本的新鮮棉花葉，于冰箱內在-10°C冷凍24小時后粉碎，顆粒直徑小于O. 03mm ； (2)收集新鮮牛糞新鮮牛糞中不包含任何大型分解者，避免其他分解者與目標糞甲蟲的相互關系而影響檢測結果； (3)新鮮牛糞與粉碎棉花葉均勻混合將不含其它分解者的新鮮牛糞與粉碎的棉花葉按照9:1質量比充分混合； (4)檢測時間檢測開始后的第7、第14和第21天； (5)檢測項目成蟲死亡率，產卵率和卵化率。
2.權利要求I所述的一種評價轉Bt基因棉花對糞甲蟲影響的檢測方法在轉基因作物對糞甲蟲群落影響的評價中的應用。
全文摘要
本發明屬于轉基因作物生態風險評價技術領域，具體涉及一種評價轉基因棉花對糞甲蟲影響的檢測方法。以轉Bt基因抗蟲棉及其親本和糞甲蟲為檢測對象，收集新鮮棉花葉，于冰箱內在-10℃冷凍24小時后粉碎，顆粒直徑小于0.03mm；稱取粉碎棉花葉與新鮮牛糞按一定比例均勻混合；將混合樣裝入網孔直徑為0.2mm的紗袋內，接種糞甲蟲后密封紗袋，置于戶外地表；分別于第7，第14和第21天記錄紗袋中的甲蟲卵，幼蟲和成蟲數量，計算其產卵率，卵化率和成蟲死亡率。轉Bt基因抗蟲棉處理中的甲蟲成蟲死亡率高，產卵率和卵化率低，說明轉Bt基因抗蟲棉對糞甲蟲具有傷害作用。該檢測方法準確，快速，成本低，便于應用。
文檔編號A01K67/033GK102960312SQ20121050648
公開日2013年3月13日 申請日期2012年12月3日 優先權日2012年12月3日
發明者孫書存, 吳新衛, 曹瑞 申請人:南京大學