專利名稱：專性孤雌繁殖的輪蟲種群培育方法
技術領域：
本發明涉及一種輪蟲種群的培育方法，尤其是一種可顯著提高輪蟲培養密度、提高輪蟲生產效率、縮小養殖水體積、降低生產成本的專性孤雌繁殖的輪蟲種群培育方法。
背景技術：
不論是海水魚還是淡水魚，在育苗及幼體培育期間，其開口活餌料主要選用輪蟲。按照每尾育苗每天攝食20飛0只輪蟲來計算，I個生產5000萬尾魚苗的中小型育苗企業，每天對輪蟲的需求量就需要達到15 25億只，按照1:1的比例采收輪蟲來計算，育苗單位每天需要生產25 50億只輪蟲。輪蟲包括海水的褶皺臂尾輪蟲和淡水的萼花臂尾輪蟲，是一種周期性孤雌繁殖動物，生活史由孤雌繁殖和有性繁殖兩部分構成。通常情況下，輪蟲通過高效的孤雌繁殖過程增加種群數量，但是在特定環境(如水體中輪蟲密度超過1(T20只/毫升等不利環境)條件下，則啟動有性繁殖，產生休眠卵來抵御不良環境條件。有性繁殖的產生大大限制了種群繁殖的效率，甚至有崩潰的危險，從而限制了輪蟲的產量，所帶來的是活餌料供應不足的問題。而為了避免輪蟲有性繁殖，就必需將輪蟲培育水體的培養密度限制為20只/毫升以下，隨之就需要增加培養輪蟲的水體，占用了大量養殖空間，使得育苗成本加大。
發明內容
本發明是為了解決現有技術存在的上述技術問題，提供一種可顯著提高輪蟲培養密度、提高輪蟲生產效率、縮小養殖水體積、降低生產成本的專性孤雌繁殖的輪蟲種群培育方法。本發明的技術解決方案是一種專性孤雌繁殖的輪蟲種群培育方法，其特征在于按如下步驟進行
a.取輪蟲的休眠卵放置于500毫升的培養液中，置于溫度24度，光照30001x，光周期16 8的環境條件下孵化3-5天；
b.將孵化出來的輪蟲進行單個體擴大培養，投喂微綠球藻密度為100萬細胞 200萬細胞/毫升培養液，溫度24度，光照30001x，光周期16 8 ；
c.挑取100只新孵化出的個體分別進行擴大培養，形成100個克隆種群，每個克隆種群培養液體積為2000毫升，每天更新一次培養液和餌料；
d.當克隆種群的輪蟲密度達到I只/毫升時，向各克隆種群培養液中加入a-生育酚，加入量為20微克/毫升培養液，繼續進行擴大培養，同時每天更新一次培養液和餌料，并維持培養液中a -生育酚的濃度；當克隆種群的輪蟲密度達到3 10只/毫升，將每個克隆種群的輪蟲密度濃縮至100只/毫升，同時調整a -生育酚的濃度為100微克/毫升培養液，培養10 15天；
e.從100個克隆種群中，篩選出25 35個有性生殖比率小于1%的克隆種群，用脈沖頻率2450M的微波輻射10秒；12小時后再用強度為1480 //ffcm^s^1的紫外線，照射60秒；12小時后，將克隆種群的輪蟲群密度調整到I只/毫升，培養7天，此期間不添加a -生育酚；
f.重復d步驟的方法培育；
g.從25 35個輪蟲的克隆種群中，繼續篩選出1(T15個有性生殖比率小于0.1%的克隆種群，用脈沖頻率2450M的微波輻射10秒；12小時后再用強度為1480 //ffcm^s^1的紫外線，照射60秒；12小時后，將克隆種群的輪蟲群密度調整到I只/毫升，培養7天，此期間不添加a-生育酚；
h.重復d步驟的方法培育； i.從1(T15個輪蟲的克隆種群中，可篩選出種群密度達到80(T1000只/毫升仍進行孤雌繁殖的輪蟲克隆種群。本發明所培育的輪蟲種群在繁殖和傳代過程中，即使在密度為80(T1000只/毫升的培養液中，仍舊進行孤雌繁殖而不發生有性繁殖行為，可顯著提高輪蟲培養密度、提高輪蟲生產效率、縮小養殖水體積、降低生產成本，可應用于室內進行輪蟲高密度培養，同時也適合在室外進行輪蟲敞池培育增殖，可為水產經濟養殖動物的苗種和幼體培育，提供充足的活體餌料生物。
具體實施例方式實施例1 :
a.取f2公斤淡水養魚池塘底泥，加入1000毫升高滲溶液(飽和食鹽水和飽和蔗糖水混合液)，攪拌均勻后靜置1(T15分鐘，用塑料板輕輕蘸取表面上浮的萼花臂尾輪蟲休眠卵若干，放置于500毫升經0. 45微米濾膜過濾的0.1pp湖水(培養液)中，置于溫度24度，光照30001x，光周期16 8的環境條件下孵化3飛天；
b.將孵化出來的輪蟲進行單個體擴大培養，投喂微綠球藻密度為100萬細胞/毫升培養液，溫度24度，光照30001x，光周期16 8 ；
c.挑取100只新孵化出的個體分別進行擴大培養，形成100個克隆種群，每個克隆種群培養液體積為2000毫升，每天更新一次培養液和餌料；
d.當克隆種群的輪蟲密度達到I只/毫升時，向各克隆種群培養液中加入a-生育酚，加入量為20微克/毫升培養液，繼續進行擴大培養，同時每天更新一次培養液和餌料，并維持培養液中a-生育酚的濃度；當克隆種群的輪蟲密度達到3飛只/毫升，用孔徑為120微米的篩絹網，將每個克隆種群的輪蟲密度濃縮至100只/毫升，同時調整a -生育酚的濃度為100微克/毫升培養液，培養1(T15天，即誘導輪蟲進行大規模有性繁殖；
e.從100個克隆種群中，篩選出25 35個有性生殖比率小于1%的克隆種群，用脈沖頻率2450M的微波輻射10秒；12小時后再用強度為1480 //ffcm^s^1的紫外線，照射60秒；12小時后，加培養液將克隆種群的輪蟲群密度調整到I只/毫升，培養7天，此期間不添加a-生育酚；
f.重復d步驟的方法培育；
g.從25 35個輪蟲的克隆種群中，繼續篩選出1(T15個有性生殖比率小于0.1%的克隆種群，用脈沖頻率2450M的微波輻射10秒；12小時后再用強度為1480 //ffcm^s^1的紫外線，照射60秒；12小時后，加培養液將克隆種群的輪蟲群密度調整到I只/毫升，培養7天，此期間不添加a-生育酚；h.重復d步驟的方法培育；1.從1(T15個輪蟲的克隆種群中，篩選出了 3個種群密度達到80(T1000只/毫升仍舊進行孤雌繁殖的輪蟲克隆種群。所述(Th步驟中的培養液均為經0.45微米濾膜過濾的0.1pp湖水；所述培養條件均為溫度24度，光照30001x，光周期16 8 ;所述餌料為微綠球藻，投喂密度為100萬細胞/暈升。本發明實施例1所篩選出的專性孤雌萼花臂尾輪蟲克隆種群，在步驟b的條件下穩定培養、接種傳代即可，可連續專性孤雌培養傳代1. (Tl. 5年。
實施例2
a.取f2公斤海水河蟹育苗池塘底泥，加入1000毫升高滲溶液(飽和食鹽水和飽和蔗糖水混合液)，攪拌均勻后靜置1(T15分鐘，用塑料板輕輕蘸取表面上浮的褶皺臂尾輪蟲休眠卵若干，放置于500毫升經0. 45微米濾膜過濾的15ppt的海水(培養液)中，置于溫度24度，光照30001x，光周期16 8的環境條件下孵化3飛天；
b.將孵化出來的輪蟲進行單個體擴大培養，投喂微綠球藻密度為200萬細胞/毫升培養液，溫度24度，光照30001x，光周期16 8 ；
c.挑取100只新孵化出的個體分別進行擴大培養，形成100個克隆種群，每個克隆種群培養液體積為2000毫升，每天更新一次培養液和餌料；
d.當克隆種群的輪蟲密度達到I只/毫升時，向各克隆種群培養液中加入a-生育酚，加入量為20微克/毫升培養液，繼續進行擴大培養，同時每天更新一次培養液和餌料，并維持培養液中a -生育酚的濃度；當克隆種群的輪蟲密度達到5 10只/毫升，用孔徑為120微米的篩絹網，將每個 克隆種群的輪蟲密度濃縮至100只/毫升，同時調整a -生育酚的濃度為100微克/毫升培養液，培養1(T15天，即誘導輪蟲進行大規模有性繁殖；
e.從100個克隆種群中，篩選出25 35個有性生殖比率小于1%的克隆種群，用脈沖頻率2450M的微波輻射10秒；12小時后再用強度為1480 //Wcn^s—1的紫外線，照射60秒；12小時后，加培養液將克隆種群的輪蟲群密度調整到I只/毫升，培養7天，此期間不添加a-生育酚；
f.重復d步驟的方法培育；
g.從25 35個輪蟲的克隆種群中，繼續篩選出1(T15個有性生殖比率小于0.1%的克隆種群，用脈沖頻率2450M的微波輻射10秒；12小時后再用強度為1480 //ffcm^s^1的紫外線，照射60秒；12小時后，加培養液將克隆種群的輪蟲群密度調整到I只/毫升，培養7天，此期間不添加a-生育酚；
h.重復d步驟的方法培育；1.從1(T15個輪蟲的克隆種群中，篩選出了 5個種群密度達到80(T1000只/毫升仍舊進行孤雌繁殖的輪蟲克隆種群。所述(Th步驟中的培養液均為經0. 45微米濾膜過濾的15ppt的海水；所述培養條件均為溫度24度，光照30001x，光周期16 8 ;所述餌料為微綠球藻，投喂密度為200萬細胞
/暈升°本發明實施例1所篩選出的專性孤雌褶皺臂尾輪蟲克隆種群，在步驟b的條件下穩定培養、接種傳代即可，可連續專性孤雌培養傳代4年。
權利要求
1. 一種專性孤雌繁殖的輪蟲種群培育方法，其特征在于按如下步驟進行 a.取輪蟲的休眠卵放置于500毫升的培養液中，置于溫度24度，光照30001x，光周期.16 8的環境條件下孵化3~5天； b.將孵化出來的輪蟲進行單個體擴大培養，投喂微綠球藻，投喂密度為100萬細胞 200萬細胞/毫升培養液，溫度24度，光照30001x，光周期16 8 ； c.挑取100只新孵化出的個體分別進行擴大培養，形成100個克隆種群，每個克隆種群培養液體積為2000毫升，每天更新一次培養液及餌料； d.當克隆種群的輪蟲密度達到1只/毫升時，向各克隆種群培養液中加入a-生育酚，加入量為20微克/毫升培養液，繼續進行擴大培養，同時每天更新一次培養液及餌料，并維持培養液中a -生育酚的濃度；當克隆種群的輪蟲密度達到3 10只/毫升，將每個克隆種群的輪蟲密度濃縮至100只/毫升，同時調整a -生育酚的濃度為100微克/毫升培養液，培養10 15天； e.從100個克隆種群中，篩選出25 35個有性生殖比率小于1%的克隆種群，用脈沖頻率2450M的微波輻射10秒；12小時后再用強度為1480 μWcm-2s—1的紫外線照射60秒；12小時后，將克隆種群的輪蟲群密度調整到1只/毫升，培養7天，此期間不添加a -生育酚； f.重復d步驟的方法培育； g.從25 35個輪蟲的克隆種群中，繼續篩選出10~15個有性生殖比率小于0.1%的克隆種群，用脈沖頻率2450M的微波輻射10秒；12小時后再用強度為1480 μWcm-2s-1的紫外線照射60秒；12小時后，將克隆種群的輪蟲群密度調整到1只/毫升，培養7天，此期間不添加a-生育酚； h.重復d步驟的方法培育；1.從10~15個輪蟲的克隆種群中，篩選出種群密度達到800~1000只/毫升仍進行孤雌繁殖的輪蟲克隆種群。
全文摘要
本發明公開一種采用化學藥物誘導、微波輻射誘變、紫外照射突變及人工選育專性孤雌繁殖的輪蟲種群培育方法，所培育的輪蟲種群在繁殖和傳代過程中，即使在密度為800~1000只/毫升的培養液中，仍舊進行孤雌繁殖而不發生有性繁殖行為，可顯著提高輪蟲培養密度、提高輪蟲生產效率、縮小養殖水體積、降低生產成本，可應用于室內進行輪蟲高密度培養，同時也適合在室外進行輪蟲敞池培育增殖，可為水產經濟養殖動物的苗種和幼體培育，提供充足的活體餌料生物。
文檔編號A01K67/033GK103053476SQ20121051519
公開日2013年4月24日 申請日期2012年12月5日 優先權日2012年12月5日
發明者殷旭旺, 趙乃錫, 譚冰冰, 朱美樺, 周艷春 申請人:大連海洋大學