專利名稱：利用改進的目的基因表達盒進行植物轉化的方法
技術領域：
本發明涉及一種轉化植物的方法，特別涉及一種將目的基因以DNA片段的形式(含有目的基因表達盒)導入目的植物中的方法。
背景技術：
基因槍轉化法具有轉化效率高、無宿主限制、簡單易操作等優點，在小麥轉化中得到廣泛應用，目前小麥遺傳轉68. 8%是采用基因槍轉化。而傳統的小麥基因槍轉化法多以環形載體轉化為主，導致載體骨架序列伴隨目的基因同時整合進植物基因組，外源片段拷貝數高，目的基因的低表達甚至外源基因沉默，同時，載體框架序列中含有的抗生素抗性基因增加了轉基因植物的安全隱患。最近的研究還發現，載體骨架序列會引起外源基因發生不同程度的重排、斷裂，導致遺傳不穩定。早在1991年，Artelt等就指出，載體框架結構在轉基因中都會產生負面影響，因此需要對經典的基因槍法進行改進和創新。Uze 等(Uz6, M, Potrykus, I and Sautter, C. Single-stranded DNA in thegenetictransformation of wheat(Triticum aestivum L.): transformation fequencyand intergrationpattern. Theor Appl Genet, 1999，99:487-495)在小麥中比較了 Bar 和GUS基因的環形質粒和最小表 達框(包括啟動子、目的基因編碼序列和終止子)的轉化效率，結果表明線性最小表達框的轉化效率高于環形載體。然而，目前國際上用最小表達框轉化法獲得轉基因小麥的成功報道還很有限，如何進一步提高最小表達框轉化技術的轉化效率，提高轉化基因的表達效率及穩定性仍然需要研究。核基質結合區SAR (Scaffold Attachment Region)可作為DNA的邊界兀件與核基質結合，使兩個SAR之間的基因片段被界定成一個獨立的染色質環狀結構，從而阻擋鄰近染色質區的作用與影響，可以提高外源基因的穩定性。
發明內容
本發明的目的是提供一種轉化植物的方法。本發明所提供的轉化植物的方法，包括將目的基因導入目的植物中的步驟；所述目的基因是通過如下DNA片段(含有目的基因表達盒)導入目的植物中的(即導入目的植物中的是線性的DNA片段)5’-核基質結合區序列-啟動子-目的基因-終止子-核基質結合區序列_3’，即所述DNA片段從上游至下游依次由核基質結合區序列、啟動子、目的基因、終止子和核基質結合區序列組成。在上述方法中，所述核基質結合區序列來源于煙草(如煙草品種W38)基因組，所述核基質結合區序列具體如序列表中序列I所示。所述啟動子可為Ubiquitin啟動子。在本發明的一個實施例中，所述Ubiquitin啟動子來源于載體pAHC25,所述Ubiquitin啟動子的序列具體如序列表中序列2所示。所述終止子可為NOS終止子。在本發明的一個實施例中，所述NOS終止子來源于載體pAHC25，所述NOS終止子的序列具體如序列表中序列3所示。在本發明的一個實施例中，所述植物為小麥，具體為小麥(Triticum aestivumL.)品種科農199或濟麥22。在本發明的一個實施例中，所述目的基因為GUS基因，所述GUS基因來源于載體PAHC25 ;在本發明的另一個實施例中，所述目的基因為GmDREB3基因。更加具體的，所述GmDREB3基因的序列如序列表中序列4所不；所述GUS基因的序列如序列表中序列5所示。在實際應用中，所述DNA片段是與抗性篩選基因共同導入到所述目的植物中的。所述抗性篩選基因是以抗性基因表達盒的形式導入所述目的植物中的。所述抗性基因表達盒自5’端至3’端，依次由啟動所述抗性基因轉錄的啟動子、所述抗性基因，以及終止所述抗性基因轉錄的終止子組成。在本發明的一個實施例中，所述抗性基因為Bar基因；啟動所述Bar基因轉錄的啟動子為Ubiquitin啟動子；終止所述Bar基因轉錄的終止子為NOS終止子。在上述方法中，所述轉化為基因槍轉化。本發明所提供 的轉化植物的方法在培育轉基因植物中的應用，也屬于本發明的保護范圍。本研究在最小表達框(啟動子-目的基因編碼序列-終止子)兩端加SAR序列。通過轉化GUS報告基因比較了不加SAR序列的線性載體與加SAR序列的線性載體的轉化效率及GUS基因的表達穩定性。同時，采用加SAR序列的線性載體轉化抗逆相關基因GmDREB3，通過PCR的方法鑒定轉基因小麥中插入片段的完整性，結果表明，本研究改進的最小表達框轉化技術可以提聞小麥基因槍轉化效率，同時，提聞了目的基因在轉基因小麥中的表達效率及遺傳穩定性，且片段完整性良好。改進的最小表達框轉化技術為獲得安全轉基因小麥提供了新思路。
圖1為重組表達載體pS⑶S的酶切鑒定圖。其中，A為KpnI和SpeI雙酶切，泳道I為DNA分子量標準DL10000，泳道2為pS⑶S質粒經Kpn1、SpeI雙酶切，泳道3為pS⑶S質粒對照，泳道4為DNA MarkerIII ；B為SacI和BamH I雙酶切，泳道M為DNA Marker III，泳道1-2為pS⑶S質粒經Sac1、BamHI雙酶切，泳道3為pS⑶S質粒對照。圖2為重組表達載體pS⑶S中線性片段pS⑶S的結構示意圖。其中，在與EcoRV相鄰的下游有一個HindIII酶切位點，在與Kpn I相鄰的上游有一個Xho I酶切位點未在圖中顯示。圖3為重組表達載體pSHGmDREB3中線性片段pSHGmDREB3的結構示意圖。其中，在與EcoR V相鄰的下游有一個Hind III酶切位點，在與Kpn I相鄰的上游有一個Xho I酶切位點未在圖中顯示。圖4為EcoRI單酶切pAHC25質粒結果。泳道I為DNA分子量標準DL10000 ;泳道2為pAHC25質粒經EcoRI酶切的結果；泳道3為pAHC25質粒對照；泳道4為DNA MarkerIII。圖5為獲得轉線性片段PS⑶S的轉基因小麥的過程。A為培養；B為壯苗；C為移栽。
圖6為Ttl及T1代轉線性片段pS⑶S的小麥PCR檢測結果(⑶S基因檢測)。其中，A為轉線性片段pS⑶S的Ttl代小麥PCR檢測結果，泳道1-2為陽性植株，泳道3為陰性對照，泳道4為受體親本科農199，泳道5為質粒對照pAHC25，泳道M為DNA分子量標準DL2000 ；B為轉線性片段PS⑶S的T1代小麥PCR檢測結果，泳道M為DNA分子量標準DL2000，泳道1_9為陽性植株，泳道10為陰性對照，泳道11為受體親本科農199，泳道12為質粒對照pAHC25。圖7為轉線性片段PSGUS的小麥不同部位不同時期GUS報告基因表達檢測結果。其中，A為Ttl代轉基因小麥根部染色結果；B為T1代轉基因小麥胚乳染色結果；C為T1代轉基因小麥小花染色結果。M2-1、M2-2、M2-3、M2-4表示四個PCR陽性的轉基因株系，kenongl99為受體親本科農199。圖8為轉線 性片段pSHGmDREB3的小麥的分子檢測結果。其中，A為利用引物GmDREB3-F2和GmDREB3_R2進行PCR的檢測結果，泳道M為DNA分子量標準DL2000，泳道1-6為陽性株系，泳道7為陰性對照，泳道8為受體親本濟麥22，泳道9為質粒對照；B為利用引物DREB3-F1和DREB3-R1進行RT-PCR的檢測結果，泳道M為DNA分子量標準DL2000，泳道1-5為陽性株系，泳道6為陰性對照，泳道7為受體親本濟麥22，泳道8為質粒對照；C為轉線性片段pSHGmDREB3的小麥插入片段5’端完整性檢測結果(引物A2和Cl)，泳道M為DNA Markerlll，泳道1_4為陽性株系，泳道5為陰性對照，泳道6為受體親本濟麥22，泳道7為質粒對照；D為轉線性片段pSHGmDREB3的小麥插入片段3’端完整性檢測結果(引物BI和D1)，泳道M為DNA Markerlll，泳道1_4為陽性株系，泳道5為陰性對照，泳道6為受體親本濟麥22，泳道7為質粒對照。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。煙草(Nicotiana tabacum L.)品種W38 :記載在“王衛鋒,太帥帥，王魯,劉貫山，李鳳霞，高曉明，孫玉合，煙草NtLS基因RNA干擾表達載體的構建及遺傳轉化，2011，中國煙草科學，32 (4):31-35”一文中，公眾可從中國農業科學院作物科學研究所獲得。其生長條件設置如下光照長日照設為16h光照/8h黑暗，短日照設為IOh光照/14h黑暗；溫度為21。。。大豆(Glycine max L.)品種鐵豐8號記載在“邵桂花,常汝鎮，陳一舞，聞淑榮，大豆耐鹽性遺傳的研究，1994，作物學報，20 (6):721-726” 一文中，公眾可從中國農業科學院作物科學研究所獲得。小麥(Triticum aestivum L.)品種科農199 :記載在“李俊明張相岐張愛民王志國安調過紀軍王靜，高產廣適小麥新品種——科農199，2007，麥類作物學報，27 (2) :368”一文中，公眾可從中國農業科學院作物科學研究所獲得。小麥(Triticum aestivum L.)品種濟麥22 :記載在“殷貴鴻李根英何中虎劉建軍王輝夏先春，小麥新品種濟麥22抗白粉病基因的分子標記定位，2009，作物學報，35 (8)1425-1431” 一文中，公眾可從中國農業科學院作物科學研究所獲得。載體pBluescriptSK :購自 Biovector CO. , LTD 公司，貨號 BiovectorOO8 ；載體pAHC25 :記載在“張志云，張虎生，孫毅，梁愛華，雙價抗蟲基因植物表達載體的構建，2004，西北植物學報，24 (8) :1402-140”一文中，公眾可從中國農業科學院作物科學
研究所獲得。實施例1、含有目的基因表達盒的重組表達載體的構建一、設計引物對載體pBluescriptSK和pAHC25進行酶切位點分析,根據不同目的設計引物(表I)，而小麥內標基因 puroindoline-b 序列參考 LI 等(Li Z-ff, Hansen J L, Liu Y, RobertS，Zemetra R S and Berger P H. Using Real-Time PCR to Determine Transgene CopyNumberin Wheat. Plant Mol Biol R印，2004，22:179-188)報道設計引物。表I目的基因片段及其對應擴增引物序列
權利要求
1.轉化植物的方法，包括將目的基因導入目的植物中的步驟；所述目的基因是通過如下DNA片段導入目的植物中的 5’ -核基質結合區序列-啟動子-目的基因-終止子-核基質結合區序列-3’。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述核基質結合區序列如序列表中序列I所示。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于所述啟動子為Ubiquitin啟動子。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于所述Ubiquitin啟動子的序列如序列表中序列2所示。
5.根據權利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述終止子為NOS終止子。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于所述NOS終止子的序列如序列表中序列3所示。
7.根據權利要求1-6中任一所述的方法,其特征在于所述植物為小麥。
8.根據權利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于所述目的基因為GUS基因，或GmDREB3 基因。
9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于所述GmDREB3基因的序列如序列表中序列4所不；所述GmDREB3基因的序列如序列表中序列5所不。
10.權利要求1-9中任一所述的方法在培育轉基因植物中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種轉化植物的方法。該方法包括將如下DNA片段導入目的植物中的步驟5’-核基質結合區序列-啟動子-目的基因編碼序列-終止子-核基質結合區序列-3’。本發明通過轉化GUS報告基因比較了不加SAR序列與加SAR序列的線性載體的轉化效率及GUS基因的表達穩定性。同時，采用加SAR序列的線性載體轉化抗逆相關基因GmDREB3，通過PCR的方法鑒定轉基因小麥中插入片段的完整性，結果表明，本發明改進的最小表達框轉化技術可提高小麥基因槍轉化效率；同時，提高了目的基因在轉基因小麥中的表達效率及遺傳穩定性，且片段完整性良好；本發明為獲得安全轉基因小麥提供了新思路。
文檔編號A01H5/00GK103045648SQ20121055480
公開日2013年4月17日 申請日期2012年12月19日 優先權日2012年10月31日
發明者陳明, 徐惠君, 馬有志, 徐兆師, 李連城, 蘇瑞波, 杜麗璞 申請人:中國農業科學院作物科學研究所