將基因導入到植物材料中的方法

專利名稱：將基因導入到植物材料中的方法
技術領域：
本申請要求基于2003年8月13日提出的日本專利申請2003-293125的優先權。
本發明是關于通過土壤桿菌屬細菌來進行將基因導入到植物材料中的方法。
背景技術：
根據土壤桿菌法的基因導入，是利用土壤桿菌機能的植物轉化方法。根瘤土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)具有下列機能感染植物時，使作為與土壤桿菌病原性相關的Ti(tumor-inducing)質粒的一部分的T-DNA重組到植物基因組中。根據土壤桿菌法的植物轉化方法是下述方法制備將Ti質粒的T-DNA結構域置換為希望向植物染色體組中導入的基因的轉化用質粒，使用制備成具有該轉化用質粒代替了Ti質粒的土壤桿菌，通過利用土壤桿菌的上述機能，將希望向該植物染色體組中導入的基因導入到植物染色體組中的方法。
由于認為土壤桿菌僅以雙子葉植物為宿主，并不寄生在單子葉植物中，當初，根據土壤桿菌法的植物轉化法主要是作為雙子葉植物轉化法來發展的。進行了關于根據土壤桿菌法向單子葉植物進行基因導入的各種各樣的嘗試，開發了具有強病原性土壤桿菌一部分病原性基因的超級雙元載體(super binary vector)，據報告，在使用該載體的方法中，在水稻、玉米等單子葉植物中也穩定，可以效率比較高的進行轉化(Hiei等，1994，；Ishida等，1996；特許第2,649,287號；特許第3,329,819號)。而且，報道了根據土壤桿菌法也在小麥、大麥以及高梁這樣的單子葉植物中轉化的成功例子，達到了在單子葉植物中也可廣泛進行根據土壤桿菌法的轉化。
根據土壤桿菌的轉化法，一般的具有效率高，被導入的基因拷貝數少，不用將叫做T-DNA的特定結構域片段化就可導入，因為通過短期培養就可獲得轉化體所以培養變異少等很多優異的特征。因此，現在它作為在不論雙子葉還是單子葉的很多種類的植物中最有用的轉化手段而廣泛應用。
根據土壤桿菌的轉化方法，根據植物種類，受試材料、培養基的組成不同，但共同點是不管是哪種植物，都是使組織材料與土壤桿菌懸浮液接觸，在共培養后，進行轉化細胞的篩選，制備出轉化植物。一般地，構成材料的植物組織，視需要進行滅菌處理，但除此之外沒有特別的處理，進行土壤桿菌的感染(Rogers等，1988；Visser，1991；McCormick 1991；Lindsey等，1991)。
根據土壤桿菌的轉化在很多種類的植物中都有報道，但也存在其轉化效率隨植物的種類、基因型以及構成材料的組織而有很大不同(Potrykus等，1998)的問題。在培育導入具有實用性基因的品種時，制備出很多的轉化植物是必要的，通過一年而高效率地穩定地獲得轉化植物的技術開發是重要的。還有，不依賴植物的種類或基因型的轉化法，在高效率地培育實用品種方面是極為有用的。而且，不依賴于形成材料的植物組織的轉化法的開發，也在高效率地促進轉化方面是必要的。
開發象這樣地使基因導入效率提高的方法、或者是基因導入困難的植物種類或基因型也能進行轉化的方法是重要的。到現在有很多報道。然而，其中大多是通過研究培養基組成或標記基因、啟動子的改變或者受試材料的報告。盡管有研究將土壤桿菌感染前的植物組織處理成適合于基因導入的狀態的處理方法的例子，但它們是通過刀(メス)(Chan等，1993)、粒子槍(パ一テイクルガン)(Tingay等，1997)、超聲波(Trick和Finer 1997，Amoah等，2001)、酶處理(Weber等，2003)等，每種都是由于破壞組織來提高感染效率。
Hiei等發現將植物材料離心處理后，通過土壤桿菌進行基因導入，以與沒處理的組織相比高的效率進行轉化(WO 02/12520，特開2000-342256)。盡管通過離心處理而提高轉化效率的機理細節還不明確，但認為與上述物理破壞組織的方法不同，采用離心處理，在基因導入容易進行的生理狀態下細胞發生變化。同樣發現，實施熱處理或者實施離心處理和熱處理二者的情況，與沒處理的組織相比，也以高效率進行轉化(特開2000-342255；特開2000-342253)。
Teasdale等申請了將植物組織浸漬于含有具有感染性的轉化載體的培養基中進行減壓或/還加壓的轉化方法的專利(WO 99/48335)。Teasdale等將加壓處理作為為了促進轉化載體向植物組織中的浸透而進行的。然而，在其實驗例中，盡管記載了進行減壓處理的例子，但沒有記載進行加壓處理的例子。因此，實際上完全沒有顯示證明加壓處理具有提高基因導入效率的效果數據。
Pullman和Peter申請了通過在加壓條件下培養植物組織來提高胚發生(エンブリオジエニツク)的愈傷組織形成率的方法的專利(US 6,492,174)。在8周的培養期間中施加了1-2.5atm加壓強度的試驗中，1.5atm的培養顯示最高的愈傷組織形成率。此外，其他試驗完全是在極低的加壓條件1.5atm下進行的。關于加壓處理對基因導入帶來的效果沒有被記載。
專利文獻1國際專利公開公報WO 02/12520專利文獻2國際專利公開公報WO 99/48355專利文獻3美國專利公報第6,492,174號專利文獻4特許公報第2,649,287號專利文獻5特許公報第3,329,819號專利文獻6特開2000-342256專利文獻7特開2000-342255專利文獻8特開2000-342253專利文獻9國際專利公開公報WO 95/06722專利文獻10國際專利公開公報WO 03/027290非專利文獻1Amoah，B.K.，Wu，H.，Sparks，C.和Jones，H.D.(2001)Factors influencing Agrobacterium-mediated transient expression of uidA inwheat inflorescence tissue.Journal of Experimental Botany 521135-1142.
非專利文獻2Chan，M-T.，Cheng，H-H.，Ho，S-L.，Tong，W-F.和Yu，S-M.(1993)Agrobacterium-mediated production of transgenic rice plants expressing achimeric α-amylaze promoter/β-glucuronidase gene.Plant Molecular Biology，22，491-506.
非專利文獻3Hiei，Y.，Ohta，S.，Komari，T.和Kumashiro，T.(1994)Efficient transformation of rice(Oryza sativa L.)mediated by Agrobacterium andsequence analysis of the boundaries of the T-DNA.The Plant Journal，6，271-282.
非專利文獻4Hoekema，A，Hirsch，P.R.，Hooykaas，P.J.J.和Schilperoort，R.A.(1983)A binary plant vector strategy based on separation of vir- andT-region of the Agrobacterium tumefaciens Ti-plasmide.Nature，303，179-180.
非專利文獻5Ishida，Y.，Saito，H.，Ohta，S.，Hiei，Y.，Komari，T.和Kumashiro，T.(1996)High efficiency transformation of maize(Zea mays L.)mediated by Agrobacterium tumefaciens.Nature Biotechnology.14，745-750.
非專利文獻6Komari，T.(1990)Genetic characterization of adouble-flowered tobacco plant obtained in a transformation experiment.Theor.Appl.Genet.80167-171.
非專利文獻7Komari，T.和Kubo T.，(1999)，Methods of GeneticTransformationAgrobacterium tumefaciens.In Vasil，I.K.(ed.)Molecularimprovement of cereal crops.，Kluwer Academic Publishers，Dordrecht，pp.43-82.
非專利文獻8Lindsey，K.，Gallois，P.和Eady，C.(1991)Regeneration andtransformation of sugarbeet by Agrobacterium tumefeneration.Plant TissueCulture Manual，B71-13.Kluwer Academic Publishers.
非專利文獻9McCormick，S.，(1991)Transformation of tomato withAgrobacterium tumefaciens.Plant Tissue Culture Manual，B61-9.KluwerAcademic Publishers.
非專利文獻10Potrykus，I.，Bilang，R.，Futterer，J.，Sautter，C.和Schrott，M.(1998)Agricultural Biotechnology，NYMercel Dekker Inc.pp.119-159.
非專利文獻11Rogers，S，G.，Horsch，R.B.和Fraley，R.T.(1988)Genetransfer in plantsProduction of transformed plants using Ti plasmid vectors.Method for Plant Molecular Biology，CAAcademic Press Inc.pp.423-436，非專利文獻12Tingay，S.，McElroy，D.，Kalla，R.，Fieg，S.，Wang，M.，Thornton，S.和Brettell，R.，(1997)Agrobacterium tumefaciens-mediated barleytransformation.The Plant Journal 111369-1376.
非專利文獻13Trick，H.N.和Finer，J.J.，(1997)SAATsonication-assistedAgrobacterium-mediated transformation.Transgenic Research，6329-336.
非專利文獻14Visser，R.G.F.，(1991)Regeneration and transformation ofpotato by Agrobacterium tumefaciens.Plant Tissue Culture Manual，B51-9.Kluwer Academic Publishers.
非專利文獻15Weber，S.，Friedt，W.，Landes，N.，Molinier，J.，Himber，C.，Rousselin，P.，Hahne，G和Horn，R.(2003)Improved Agrobacterium-mediatedtransformation of sunflower(Helianthus annuus L.)assessment of maceratingenzymes and sonication.Plant Cell Reports 21475-482.

發明內容
發明所要解決的課題本發明提供通過土壤桿菌屬細菌來進行將基因導入到植物材料中的方法。本發明的方法以包含以下工序為特征1)將植物材料進行加壓處理，然后2)使土壤桿菌感染植物材料。
本發明方法與未進行工序1)的加壓處理的情況相比較，提高了基因導入效率。
解決課題的手段本發明者們為解決上述問題銳意研究努力的結果是，發現通過將植物組織在加壓處理后與土壤桿菌進行共培養，與沒處理的組織相比，獲得穩定高效率的基因導入。而且，確認了由加壓處理而提高基因導入效率的效果，無論單子葉、雙子葉都能確認。此外，就基因導入了的植物材料，進一步進行轉化細胞的篩選以及轉化植物的再分化時，加壓處理的材料與沒處理的材料相比，發現轉化效率飛躍性地提高。進一步明確了通過加壓處理，植物組織的增殖(例如由未成熟胚的愈傷組織增殖)變得旺盛。
據此，本發明關于通過土壤桿菌屬細菌來進行將基因導入到植物材料中的方法，包括
1)將植物材料進行加壓處理，然后2)使土壤桿菌感染植物材料。
即，在本發明中，植物材料的加壓處理不是與土壤桿菌感染同時進行，而是在其之前進行。
加壓處理沒有特殊的限定，優選1.7氣壓～10氣壓的范圍，更優選優選以2.4～8氣壓范圍進行。最優選4～8氣壓。上述加壓處理的范圍是以常壓為1氣壓。因此，例如，1.7氣壓的加壓處理是指在常壓上加0.7氣壓的狀態，同樣地，10氣壓的加壓處理是指常壓加上9氣壓的狀態。此外，加壓處理的時間沒有特殊的限定，優選0.1秒～4小時，更優選1秒～30分鐘。
加壓處理，也可以在液體或氣體中進行。液體沒有特別限定，可以使用水(例如滅菌蒸餾水)、液體培養基、其他不抑制植物組織生長的液體等。氣體沒有特別限定，可以使用空氣、氧氣、其他不抑制植物組織生長的氣體等。
加壓處理的方法，可以通過例如與注射器組合，用夾子將注射器夾住，通過夾緊夾子來提高注射器內的壓力來進行。加壓的強度，例如可以由注射器內空氣體積的減少率來算出。或者，加壓處理也可以通過以下來進行1)用壓縮機等將氣體送入含有植物組織的容器中提高容器的內壓，或者2)將裝入到密封成不與外面氣體接觸的袋子等中的植物組織，沉入到液體中，通過水壓而加壓。
本發明的方法特征在于使用加壓處理了的植物材料作為土壤桿菌屬細菌要感染的植物材料，而作為使用土壤桿菌屬細菌的基因導入或轉化方法本身，可以直接使用公知的方法。
使用土壤桿菌屬細菌進行的基因導入以及轉化方法使用土壤桿菌屬細菌進行的基因導入，一般地包括以下工序a)制備植物材料的工序；b)制備含有具有所要導入基因的載體的土壤桿菌屬細菌的工序；c)使b)制備的土壤桿菌屬細菌感染工程a)制備的植物材料的工序；進一步，為了得到轉化體，在上述工序c)之后也可以實施d)篩選轉化細胞的工序；以及
e)根據要求，將篩選的轉化體進行再分化的工序。
關于工序a)在本說明書中，供基因導入的“植物”包括單子葉植物以及雙子葉植物。在單子葉植物中包括水稻(イネ)、玉米、大麥、小麥、石刁柏(アスパラガス)、高梁和其他，但并不限于這些。優選水稻或玉米。雙子葉植物中包括煙草、大豆、馬鈴薯、向日葵和其他，但并不限于這些。優選是煙草。
此外，所說“植物材料”非限定性的包括為以土壤桿菌法進行的轉化而提供的該植物的細胞、葉、根、莖、果實、及其他的任何部位的植物組織，未成熟胚，愈傷組織或者不定胚樣組織(以下在本說明書中稱作愈傷組織等，或者簡稱為愈傷組織)，或者整個植物體等植物所有的形態。
作為本發明方法中使用的植物形態，優選未成熟胚或愈傷組織，最優選未成熟胚。在本說明書中，所說的植物的細胞、組織、整個植物體采用的是在本技術領域中一般采用的意義。在本說明書中，所謂的未成熟胚是受粉后處于成熟過程的未成熟種子的胚。此外，供本發明方法所用的未成熟胚的階段(熟期)，沒有特別的限制，在受粉后的任何時期采摘的都可以。最優選受粉后2天以后的未成熟胚。轉化之后，優選使用能夠誘導出具有再生正常個體能力的愈傷組織的未成熟胚胚盤。此外，未成熟胚優選近親交配、近親交配之間的F1、近親交配與自然受粉品種之間的F1、市售F1品種的未成熟胚。在本說明書中，所謂愈傷組織是指無秩序增殖的未分化狀態的細胞塊。為了得到愈傷組織，可以將植物組織分化的細胞置于含有植物生長激素(例如2，4-D(2，4-二氯苯氧基乙酸)或者細胞分裂素等植物生長調節物質的培養基(叫做脫分化培養基)中培養得到。為得到該愈傷組織而做的處理叫做脫分化處理，該過程叫做脫分化過程。
在工序a)中，根據需要，將植物組織、未成熟胚等從植物體、種子等中取出，制備成適合轉化的材料。此外，根據要求，也可以將植物材料在用土壤桿菌感染之前培養。
本發明中，以在工序a)中的植物材料制備過程或制備之后在工序c)中的使土壤桿菌感染之前對植物材料實施加壓處理為特征。
關于工序b)很久以前就已知根瘤的土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)引起很多雙子葉植物的冠癭病(crown gall disease)，在二十世紀70年代，發現Ti質粒與病原性相關，而且作為Ti質粒的一部分的T-DNA被重組到植物染色體組。之后明白了該T-DNA上存在與合成誘發腫瘤所必要的激素(細胞分裂素和植物生長激素)相關的基因，盡管是細菌基因卻在植物中發現了。在切割T-DNA與向植物的傳遞中，在Ti質粒上的病毒結構域(vir結構域)中存在的基因組是必要的，此外為了將T-DNA切出得到，T-DNA兩端上存在的邊界序列(ボ-ダ-配列)是必要的。作為其他的土壤桿菌屬細菌的毛根土壤桿菌(Agrobacterium rhizogenes)也具有根據Ri質粒的同樣的系統(例如特開2000-342256的圖3和圖4)。
因為由于土壤桿菌的感染，T-DNA可以重組到植物染色體組中，因此如果在T-DNA上插入所需要的基因，期望能將該基因重組到植物染色體中。然而，因為Ti質粒是190kb或190kb以上非常大，用標準的基因工程方法在質粒上的T-DNA上插入基因是困難的。因此，開發了為在T-DNA上插入外源基因的方法。
首先，制備了從腫瘤性Ti質粒的T-DNA上去除了激素合成基因的解除型菌系(disarmed strains)LBA4404(Hoekema等，1983)、C58C1(pGV3850)、GV3Ti11SE等。通過使用這些，開發了2種方法將所要的基因導入到土壤桿菌的Ti質粒T-DNA中，或者將具有所要基因的T-DNA導入到土壤桿菌中。其中的一種是進行容易的基因操作就可能插入所要的基因方法，該方法通過三系雜交法(triparental mating)，通過同源重組，將在大腸桿菌中能夠復制的中間載體導入到土壤桿菌的解除型Ti質粒的T-DNA結構域中，稱作中間載體法。
還有一種是稱作雙元載體(binary vector)法，該法是基于在將T-DNA重組到植物中時，需要有病毒(vir)結構域，但沒有必要為了機能而存在于同一質粒上。在該vir結構域中存在有virA、virB、virC、virD、virE以及virG，(植物生物技術事典(エンタプライズ株式會社發行(1989)))，所謂vir結構域，是指包含全部virA、virB、virC、virD、virE以及virG。因此，雙元載體是將T-DNA重組到可在土壤桿菌和大腸菌雙方中復制的小質粒中的東西，將其導入到具有解除型Ti質粒的土壤桿菌中來使用。
在向土壤桿菌導入雙元載體時，可以通過電穿孔法或三系雜交法等公知的方法進行。在雙元載體中，有pBIN19、pBI121、pGA482等，以這些為基礎，構建了大量的新型雙元載體用于轉化。此外，在Ri質粒系統中，也構建了同樣的載體用于轉化。
土壤桿菌A281是強病原性(super-virulent)菌系，其宿主范圍廣，轉化效率比其他菌系高。該特性是由于A281具有的Ti質粒的pTiBo542。使用pTiBo542到目前開發了2種新系統。一種是使用了具有pTiBo542解除型Ti質粒的菌系EHA101以及EHA105，由于適用于上述雙元載體系統，這些作為轉化能力高的系統而在各種植物的轉化中被利用。
還有一種是超級雙元載體(“super-binary”vector)(Hiei等，(1994)；Ishida等，(1996)；Komari等，(1999)；WO95/06722)系統(例如特開2000-342256的圖4)。由于該系統是由具有vir結構域(virA、virB、virC、virD、virE以及virG(以下也將這些各叫做“vir片段結構域”))的解除型Ti質粒以及具有T-DNA的質粒組成，因此是雙元載體系統的一種。但在使用超級雙元載體這點上是不同的，超級雙元載體是在具有T-DNA的端的質粒上，即在雙元載體上，重組了基本上去除了vir片段結構域中至少一種vir片段結構域的vir結構域片段(其中優選至少含有virB或virG的片段，更優選含有virB和virG的片段)。此外，在具有超級雙元載體的土壤桿菌中導入重組了所要基因的T-DNA結構域時，通過三系雜交法的同源重組可作為容易的手法來利用。
在本發明方法中，作為成為宿主的的土壤桿菌屬細菌，沒有特別的限制，可以優選使用根瘤土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)(例如上述的土壤桿菌LBA4404(Hoekema等，1983)以及EHA101。
根據本發明的方法，只要是基于土壤桿菌屬細菌中病原性(vir)結構域的基因組的表達的基因導入系，可以沒有特別的限制就能得到有意義的效果。因此，對于上述的中間載體、雙元載體、強病原性雙元載體、超級雙元載體等中的任何載體系統都可以使用，可以取得本發明的效果。在使用將這些載體改變的不同載體系統時，也是同樣的(例如將土壤桿菌屬細菌vir結構域的一部分或者全部切除，然后重組到質粒中，將vir結構域的一部分或者全部切除，作為新的質粒的一部分導入到土壤桿菌中等)。此外，根據本發明的方法，在野生型的土壤桿菌屬細菌中，也可以提高野生型T-DNA結構域向植物的導入效率，事實上提高感染效率。
期望向植物中導入的基因可以基于以下適當的選擇標準來選擇可以通過常規方法重組到上述質粒的T-DNA結構域中的限制酶部位中，對在該質粒上同時或者是以別的途徑重組的卡那霉素、巴龍霉素等藥物具有耐藥性的基因等。由于體積大，具有多數限制部位的，以通常亞克隆手法將期望的DNA導入到T-DNA結構域內不是都容易。在這樣的情況下，可以通過三系雜交法，利用土壤桿菌屬細菌細胞內的同源重組，將目的DNA導入。盡管是非限定性的，但被導入的基因的大小優選是大約100bp～200kbp。
此外，將質粒導入到根瘤土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)等土壤桿菌屬細菌中的操作可以通過現有方法進行，舉例的話包括上述的三系雜交法或電穿孔法、電子注射法、PEG等化學處理的方法。
想要導入到植物中的基因，與現有技術一樣，基本上是配置在T-DNA的左右邊界序列之間的。然而，因為質粒是環狀的，邊界序列的數可以是1，在想要將多個的基因配置在不同部位上時，邊界序列也可以是3個或3個以上。此外，在土壤桿菌屬細菌中，可以配置在Ti和Ri質粒上，或者也可以配置在其他質粒上。甚至，也可以配置在多種類的質粒上。
關于工序c)通過土壤桿菌屬細菌進行基因導入的方法，可以通過使植物材料與土壤桿菌屬細菌單獨的接觸來進行。例如，可以通過制備大約106～1011細胞/ml程度的細胞濃度的土壤桿菌屬細菌懸浮液，將植物材料在該懸浮液中浸漬3～10分鐘左右，在固體培養基上進行數日的共培養來進行。
優選在使土壤桿菌感染植物材料的同時，或者感染之后除去土壤桿菌之前，將植物材料與土壤桿菌共培養。在共培養中使用公知的培養基。例如，在實施例中使用的nN6-As培養基、nNB-As培養基、LS-AS培養基或者其他、N6S3-AS培養基、2N6-AS培養基(Hiei，Y等，1994))等培養基是已知的。
在本發明中，在使土壤桿菌感染植物材料的工序c)之前或者進行中時，也可以對植物材料進行選自以下的至少一種處理加壓處理、熱處理、離心處理、以及超聲處理。已知這些處理在通過土壤桿菌屬細菌向植物材料導入基因的方法中也會提高基因的導入效率。例如，關于離心處理，例如在WO 02/12520、特開2000-342256中被記載，優選以100G～25萬G、進行離心1秒～4小時。關于熱處理，例如特開2000-342255中被記載，優選在33℃～60℃的溫度范圍內，進行熱處理5秒～24小時。進一步，關于超聲處理，例如在Trick和Finer 1997、Amoah等2001中被記載。
這些加壓、加熱、離心等處理，可以進行任意1種，也可以多種組合來進行。例如特開2000-342253記載了關于將熱處理和離心處理組合來進行。
關于工序d)以及e)進一步根據要求，為了得到轉化體，在上述工序c)之后，必需進行d)篩選轉化細胞的工序；以及e)根據要求，將篩選的轉化體進行再分化的工序即，一般地，為了進行植物的轉化，在將外源基因導入到植物細胞后，篩選外源基因穩定地重組到染色體上的植物細胞是必要的。
篩選被轉化細胞的工序是指，篩選具有表型的數據以及物理數據至少之一、優選二者的目的性狀的細胞。
表型的數據例如轉化效率可以通過進行以下評價來得到與所要導入到植物中的基因一起，導入標記基因和/或選擇標記基因，評價其表達。作為標記基因和/或選擇標記基因，可以使用例如GUS(β-葡糖醛酸酶)基因、或耐抗生素基因(例如耐PPT(フオスフイノスライシン)基因、耐卡那霉素基因)等。作為標記基因使用GUS基因時，轉化效率的評價可以通過由X-gulc(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖醛酸)的GUS的切割而伴隨的顯色來評價。作為選擇標記基因使用耐抗生素基因時，在轉化后，可以由在加有抗生素的選擇培養基上生長的情況來評價。
進一步，為了確認外源基因穩定地重組到染色體上，優選得到Southern印跡等的物理數據。更優選通過有性生殖向后代傳遞的工序、以及基于向后代基團的遺傳性以及分子性分析的選擇的工序。
也可以根據所要進行篩選的轉化體的再分化，培育再分化個體，然后得到完整的植物體。在由篩選的轉化細胞再生長成完整的植物體中，可以根據公知的方法(例如Hiei等1994；Ishida等1996)進行。
本發明方法，與不進行加壓處理的情況相比較，提高了基因導入效率以及/或轉化效率。基因導入效率可以通過例如評價導入的基因的暫時性表達范圍來進行評價。在后面的實施例中，將未成熟胚的胚盤中的GUS基因的暫時性表達評價為1(散見點狀的表達)～5(整個胚盤均見表達)的5個階段指數。或者，在全體的表達量較低的情況下，也可以通過計算所有的點數來評價。
轉化效率可以通過例如將由接種的未成熟胚得到的再分化植物中顯示了GUS基因表達的作為轉化體來計數，以接種的未成熟胚的數除其總數來算出。或者也可以通過將再分化植物中對于篩選壓力顯示出抵抗性的作為轉化體來計數，以接種的未成熟胚的數除其總數來算出。
本發明還提供生產轉化植物的方法。本發明的方法包括1)將植物材料進行加壓處理，2)使土壤桿菌感染植物材料，3)篩選轉化細胞，然后4)將所要篩選的轉化體進行再分化。
效果本發明開發了比現有的土壤桿菌法更高效率地進行基因導入的廉價并且簡單的方法。此外，提供對認為用現有土壤桿菌法進行基因導入很困難的植物種以及品種也適用的方法。本發明的方法與未進行加壓處理的情況相比較，提高了基因導入效率及/或轉化效率。
如


圖1所示，通過在單子葉植物水稻中進行加壓處理，與未處理的情況相比較，基因導入效率提高到2倍～3倍。此外，如圖3所示，通過在雙子葉植物煙草中進行加壓處理，與未處理的情況相比較，基因導入效率提高到3倍～4倍。據此，通過使用本發明的方法，優選將基因導入效率實質性提高，更優選提高2倍或2倍以上。此外，轉化效率如表1所示的那樣，在水稻中通過進行加壓處理，與未處理的情況相比較，提高到3倍～9倍。據此，通過使用本發明的方法，優選將轉化效率實質性提高，更優選提高3倍或3倍以上。
附圖的簡單說明
圖1顯示在氣體中加壓處理對基因導入效率帶來的效果(水稻，品種ゆきひかり)。對照無前處理；pres.w/o water氣體中+5.7atm，5分鐘加壓處理；在水中加壓蒸餾水中+6.6atm，5分鐘加壓處理。各處理后，接種LBA4404(pSB134)，進行7天共培養后，進行GUS分析。
圖2顯示加壓處理對基因導入效率帶來的效果(玉米)。A無前處理(對照)；B15,000rpm，10分鐘離心處理；C+3.2atm，10分鐘加壓處理；D+6.6atm，5分鐘加壓處理。各處理后，接種LBA4404(pSB131)，進行3天共培養后，進行GUS分析。
圖3顯示加壓處理對基因導入效率帶來的效果(煙草，品種プチハバナSR1)。對照無前處理；加壓+6.6atm，5分鐘加壓處理。各處理后，接種LBA4404(pSB134)，進行4天共培養后，進行GUS分析。
實施例以下通過實施例具體地說明本發明，但這些不限制本發明的技術范圍。本領域人員可以基于本說明書容易地對本發明添加修飾或變更，這些也包含在本發明的技術范圍內。
實施例1加壓對水稻的轉化帶來的效果(1)加壓處理在5mL的一次性注射器的前端上插入前端加熱破碎了的微量加樣器吸頭，以適當長度切掉后，用石蠟膜蓋住前端。向注射器中加入土壤桿菌混懸用液體培養基(AA 主要無機鹽、LS 微量無機鹽、MS 維生素、AA 氨基酸、0.2g/L 酪蛋白水解物、4g/L 蔗糖、2g/L 葡萄糖，pH5.2)或者無菌蒸餾水3mL，向其中加入無菌采取的未成熟胚(品種コシヒカリ，朝の光)。此外，向沒有加入培養基或蒸餾水等液體的注射器中加入采集的未成熟胚(品種ゆきひかり)。將注射器組合，用夾子夾住注射器，通過夾緊夾子來提高注射器內的壓力。在加壓的狀態下于室溫靜置。加壓的強度由注射器內空氣體積的減少率算出。對照是將幾乎相同數量的未成熟胚采集到裝有液體培養基或無菌蒸餾水的2mL埃彭道夫管中，于室溫靜置。
(2)接種在土壤桿菌的菌系以及土壤桿菌質粒載體中，使用根瘤土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)超級雙元載體LBA4404(pSB134)(具有在T-DNA結構域上結合有玉米泛素啟動子驅使的泛激素(ユビキチン)內含子的HPT基因，以及具有結合了以花椰菜花葉病毒35S啟動子驅使的蓖麻過氧化氫酶內含子的GUS基因)。pSB134的制備是在pKY205(Komori等WO03/027290)上，通過將作為表達標記的由pSB32得來的35S-intron GUS-nos片段插入到Hind III部位中來進行的。
將注射器從夾子中取出，將注射器內的未成熟胚轉移至裝有液體培養基的2mL埃彭道夫管中，在含有50mg/L潮霉素(ハイグロマイシン)和50mg/L 壯觀霉素(スペクチノマイシン)的AB培養基上培養3～4天，以白金接種環挑取LBA4404(pSB134)，混懸于含有100μM 乙酰丁香酚的大約109cfu/ml濃度的液體培養基1ml中。向除去了液體培養基的埃彭道夫管中加入土壤桿菌懸浮液1ml，用旋渦混合器攪拌30秒后，于室溫靜止5分鐘。將未成熟胚在nN6-As培養基(N6 無機鹽、N6 維生素、0.5g/L 酪蛋白水解物、0.5g/L L-脯氨酸、1mg/L 2，4-D、0.5mg/L NAA、0.1mg/L 6BA、20g/L蔗糖、10g/L 葡萄糖、10μM AgNO3、100μM 乙酰丁香酚、8g/L 瓊脂糖、pH5.2)或者nNB-As培養基(N6 主要無機鹽、B5 微量無機鹽、B5 維生素、0.5g/L酪蛋白水解物、0.5g/L L-脯氨酸、2mg/L 2，4-D、1mg/L NAA、1mg/L 6BA、20g/L 蔗糖、10g/L 葡萄糖、100μM 乙酰丁香酚、8g/L 瓊脂糖、pH5.2)上接種，于黑暗下在25℃培養1周。
(3)篩選、再分化用解剖刀將共培養后的未成熟胚分成4～6份，接種在nN6CC培養基(N6 無機鹽、N6 維生素、0.5g/L 酪蛋白水解物、0.5g/L L-脯氨酸、1mg/L2，4-D、0.5mg/L NAA、0.1mg/L 6BA、20g/L 蔗糖、55g/L 山梨醇、250mg/L頭孢噻肟(セフオタキシム)、250mg/L 羧芐西林、5g/L 凝膠劑(ゲルライト)、pH5.8)或者NBK4CC培養基(NBK4 主要無機鹽、B5 微量無機鹽、B5 維生素、AA 氨基酸、0.5g/L 酪蛋白水解物、0.5g/L L-脯氨酸、1mg/L 2，4-D、0.5mg/L NAA、0.1mg/L 6BA、20g/L 麥芽糖、55g/L 山梨醇、250mg/L 頭孢噻肟、250mg/L 羧芐西林、5g/L 凝膠劑、pH5.8)中。
于照明下28℃培養1周后，將愈傷組織分成5份，接種在含有50mg/L潮霉素的nN6CC培養基或者NBK4CC培養基中，在相同條件下培養10天。將增殖的細胞塊接種在含有50mg/L潮霉素的再分化培養基(N6 無機鹽、N6 維生素、AA 氨基酸、1g/L 酪蛋白水解物、0.5mg/L 細胞分裂素(カイネチン)、20g/L 蔗糖、30g/L 山梨醇、4g/L 凝膠劑、pH5.8)或者(NBK4 主要無機鹽、B5 微量無機鹽、B5 維生素、AA 氨基酸、1g/L 酪蛋白水解物、2mg/L 細胞分裂素、20g/L 麥芽糖、30g/L 山梨醇、5g/L 凝膠劑、pH5.8)中(4)GUS分析將從共培養后的未成熟胚及再分化個體切取的葉片浸漬于含有0.1％的Triton X-100的0.1M磷酸緩沖液(pH6.8)中，于37℃靜置1小時。用磷酸緩沖液除去土壤桿菌后，添加含有1.0mM 5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖醛酸(X-gluc)以及20％甲醇的磷酸緩沖液。于37℃處理24小時后，于顯微鏡下觀察，考察呈藍色的組織。
(5)轉化效率的計算轉化率的計算具體如以下進行。
在接種土壤桿菌的水稻未成熟胚中，在胚盤的大范圍內觀察到了表示GUS基因的暫時性表達的點。即使從1個胚盤分離的部位觀察到的點，也認為是來自于每個被基因導入的獨立的轉化細胞。在共培養后以及靜置(レステイング)培養后將增殖的未成熟胚分成4～6塊的情況下，認為即使是來自1個未成熟胚，由分割得到的20～30個細胞塊在潮霉素存在下增殖而來的愈傷組織及其再分化植物各自是獨立的轉化體。
將從分割而得到的細胞塊增殖而來的抗潮霉素愈傷組織，從1個細胞塊中選擇1個愈傷組織，接種在含有潮霉素的再分化培養基中。將由此得到的再分化植物中顯示了GUS基因的表達，作為轉化體計數，用接種的未成熟胚個數除其總數，算出轉化效率。
(6)加壓強度對基因導入效率帶來的效果將取出的品種“コシヒカリ”的未成熟胚加入到裝有液體培養基的注射器中，分別施加0(常壓)、0.6、1.4、3.2、6.6atm的壓力15分鐘后，浸漬于土壤桿菌混懸液中。在共培養基上培養1周后，考察GUS基因的暫時性表達。在以常壓處理的對照未成熟胚中，盡管零散可見到胚盤的大約一半被染成藍色的未成熟胚，但是大多是顯示在胚盤表面上有點狀的表達。以0.6atm強度加壓的未成熟胚，顯示了與對照的未成熟胚同樣的表達樣式。與此相對比的，以1.4atm強度加壓的未成熟胚的大約半數被染色成藍色。而且，以3.2以及6.6atm強度加壓的未成熟胚，幾乎所有的都是胚盤的整個表面被染成藍色，顯示了基因導入效率顯著提高。
(7)加壓時間對基因導入效率帶來的效果將取出的品種“コシヒカリ”的未成熟胚加入到裝有液體培養基的注射器中，施加+6.6atm的壓力0、1、3、5或60秒后，浸漬于土壤桿菌混懸液中。在共培養基上培養1周后，考察GUS基因的暫時性表達。以0秒(常壓)處理的對照未成熟胚在胚盤表面上顯示了點狀表達。與此相對比的，以+6.6atm強度加壓1秒的未成熟胚，其幾乎所有都在胚盤的整個表面顯示暫時性基因表達。在加壓3秒或3秒以上的未成熟胚中，也顯示與1秒同樣的表達樣式，即使極短時間的加壓處理，也顯示了使基因導入效率顯著提到的效果。
(8)土壤桿菌共存、非共存條件下的加壓處理對轉化效率帶來的效果將取出的品種“コシヒカリ”的未成熟胚分別加入到裝有無菌蒸餾水、液體培養基以及含有混懸有約1×109cfu/ml土壤桿菌LBA4404(pSB134)的100μM乙酰丁香酚的液體培養基的注射器中，以+6.6atm強度加壓15分鐘。在土壤桿菌混懸液中加壓的未成熟胚，在加壓后接種在共培養基上。在無菌蒸餾水以及液體培養基中加壓的未成熟胚，加壓后，浸漬于土壤桿菌混懸液后，接種在共培養基上。考察共培養1周的未成熟胚的GUS基因的暫時性表達。沒有加壓處理的對照的未成熟胚中，一部分的未成熟胚在胚盤的大約一半呈現藍色，但是幾乎所有的未成熟胚顯示了點狀表達。與此相對比的，加壓處理的未成熟胚，不論與土壤桿菌共存還是非共存，供分析的未成熟胚全部都是在胚盤的整個表面上顯示GUS基因的表達。在無菌蒸餾水、液體培養基之間也未見差別。
將在無菌蒸餾水中加壓處理的未成熟胚以及與在土壤桿菌共存下加壓處理的未成熟胚于含有潮霉素的培養基中培養，進行轉化植物的篩選、再分化。在無菌蒸餾水中加壓后，由接種了土壤桿菌的12個未成熟胚，得到63個系的潮霉素抗性并且GUS陽性的轉化植物。轉化效率是525％。另一方面，由在土壤桿菌混懸液中加壓處理的12個未成熟胚，得到54個系的轉化植物，效率是450％。
沒有與土壤桿菌共存而加壓處理的情況是，比與土壤桿菌共存下加壓處理的時候轉化率還要高，由此可以明確，由于本法中所見的加壓處理而致的基因效率提高的效果，不是由于加壓促進土壤桿菌向植物組織的浸透。即，表明本發明是通過與Teasdale等(WO99/48335)所述的作用機制完全不同的作用來提高基因導入效率的。
(9)氣體中的加壓處理對基因導入效率帶來的效果將取出的品種“ゆきかり”品種未成熟胚分別加入到未裝液體的注射器以及裝有無菌蒸餾水的注射器中。未裝液體的注射器以+5.7atm的強度加壓5分鐘。裝有無菌蒸餾水的注射器以+6.6atm的強度加壓5分鐘。將加壓的未成熟胚恢復常壓后，浸漬于土壤桿菌混懸液中，接種在共培養基上。對照的未成熟胚在無菌水中在常壓靜置5分鐘后，浸漬在土壤桿菌混懸液中，接種在共培養基上。以1(散見點狀的表達)～5(整個胚盤均見表達)的5個階段指數，考察共培養1周的未成熟胚的胚盤中GUS基因的暫時性表達。在氣體中加壓的未成熟胚的表達，與在蒸餾水中加壓的未成熟胚相比，稍微差一些，但與沒有處理的對照的未成熟胚相比，顯示出明顯的大范圍表達(
圖1)。
像這樣，可知因加壓而致的提高基因導入效率的效果，不僅是在將土壤桿菌接種前的植物組織在液體中加壓的情況下，而且在在氣體中加壓的情況下也同樣可見。
(10)加壓處理對轉化效率帶來的效果將取出的未成熟胚(品種コシヒカリ，朝の光)加入到裝有液體培養基的注射器中，施加+6.6atm的壓力15分鐘后，浸漬于土壤桿菌混懸液中。在共培養基上培養1周后，在含有潮霉素的培養基中培養，篩選轉化植物，進行再分化。切取再分化的潮霉素抗性植物的葉子的一部分，進行GUS分析。結果顯示于表1。
表1加壓處理對轉化效率帶來的效果(水稻品種コシヒカリ、朝の光)

HmR，GUS+潮霉素抗性、GUS陽性加壓處理的未成熟胚顯示是沒有處理的未成熟胚的3～9倍以上的轉化效率，可知加壓處理對提高轉化效率極具效果。
實施例2加壓對玉米的轉化帶來的效果無菌取出大小約為1.2mm的玉米未成熟胚(品種A188)，浸漬于土壤桿菌混懸用液體培養基(LS-inf，Ishida等，1996)中。將未成熟胚加入到裝有液體培養基的注射器中，通過縮小夾著注射器的夾子的幅度來進行加壓處理。以加壓強度+6.6atm、5分鐘，或者+3.2atm、10分鐘來進行。離心分離是將未成熟胚加入到裝有液體培養基的埃彭道夫管中，離心機15,000rpm，40℃，離心10分鐘進行分離。將加壓或離心處理的未成熟胚，浸漬于含有混懸有大約109cfu/ml土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404(pSB131)菌株(Ishida等，1996年)的100μM乙酰丁香酚LS-inf培養基中后，接種于LS-AS共培養基。于25℃黑暗下培養3日后，進行GUS分析。對照的未成熟胚在采集后，浸漬于液體培養基后，按照相同的方法接種土壤桿菌。
對照的未成熟胚顯示在胚盤表面上藍色點狀的GUS基因的暫時性表達。在加壓處理或離心處理后接種土壤桿菌的未成熟胚中，顯示了胚盤的大約1/3都被染色成藍色的區域狀表達。尤其是+3.2atm、10分鐘加壓的未成熟胚中，很多個胚盤的整個表面都顯示了GUS基因表達的未成熟胚(圖2)。通過將土壤桿菌接種前的植物組織進行離心處理來提高轉化效率已有報道(Hiei等，WO02/12520)。
由這些可知，加壓處理是不僅對水稻，而且在其他單子葉植物的玉米中也具有提高基因導入效率的作用，并且其效果與已有報道的離心處理的效果相同或更好。
實施例3加壓對煙草轉化效率帶來的效果將煙草(品種プチハバナSR1)的展開葉以常規方法滅菌后，切成大約1cm方形的葉片。將對照的葉片浸漬于混懸有根瘤土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404(pSB134)的LS-R培養基(Komari，1990)中后，于25℃緩慢振蕩15分鐘后，浸漬于LS-R培養基，于25℃黑暗下培養4日后。加壓區的葉片在裝有LS-R培養基的注射器中加壓+6.6atm、15分鐘后，以與對照葉片同樣的方法接種土壤桿菌，進行培養。對共培養后的葉片進行GUS分析。
根據GUS分析后的各個葉片顯示的GUS基因的表達部位的大小，以0(沒有表達)～3(在整個葉片上表達)的4個階段指數進行考察。結果于圖3顯示。對照的葉片中，在葉的切割部分顯示GUS表達的葉片很多，在葉片中從切割部分向內的很大范圍內幾乎沒有看到表達。與此相對比的是，加壓處理后接種了土壤桿菌的葉片中，幾乎所有的葉片在切割部分以及內部的大范圍內呈現深藍色，顯示在大范圍內導入了基因。由此可知，加壓處理不僅是對水稻、玉米等單子葉植物，而且在雙子葉植物中也具有提高基因導入效率的效果。
實施例4加壓處理對愈傷組織增殖帶來的效果將取出的品種“コシヒカリ”未成熟胚在土壤桿菌混懸用液體培養基中以+6.6atm的強度加壓15分鐘后，接種于NBK4CC培養基上。對照的未成熟胚在常壓下在相同培養基中浸漬后，接種于NBK4CC培養基上。測定25℃黑暗下培養1周后10個未成熟胚的鮮重。試驗重復進行5次。兩個區都沒有進行土壤桿菌的接種。結果顯示于表2。
表2加壓處理對細胞增殖帶來的效果(水稻，品種コシヒカリ)

考察加壓處理后培養1周的未成熟胚的鮮重。
沒有進行土壤桿菌的接種。
將對照的未成熟胚培養1周時的平均鮮重是66.3mg/10個未成熟胚。加壓處理后，培養相同時間的未成熟胚是75.1mg/10個未成熟胚，確認具有有意義的差別。培養1周的對照的未成熟胚，胚盤表面少許愈傷組織化，呈現淡淡的黃白色。與此相對比的是，加壓處理的未成熟胚中，可見瘤狀的愈傷組織化，顯示比對照更深的黃白色。即使在用肉眼的觀察中，也確認了加壓處理的未成熟胚更旺盛的增殖。像這樣可知，加壓處理不僅提高基因導入效率，而且具有活躍細胞增殖的作用。
通過作為本發明的效果之一的高壓力短時間處理而致的植物組織細胞增殖率的提高，與通過以施加+0.5atm的低壓1～10周的狀態進行培養而提高可形成胚的愈傷組織形成率的美國專利第6,492,174號的方法相比，不僅處理條件不同，而且作為處理的結果而得到的效果也是不同的，由此認為是由于其他的機理而致的。
權利要求
1.通過土壤桿菌屬細菌介導來進行將基因導入到植物材料中的方法，本發明的方法包含以下工序1)將植物材料進行加壓處理，然后2)使土壤桿菌感染植物材料。
2.權利要求1所述的方法，其中加壓處理在1.7氣壓～10氣壓的范圍內進行。
3.權利要求2所述的方法，其中加壓處理在2.4氣壓～8氣壓的范圍內進行。
4.權利要求1～3中任一項所述的方法，其中加壓處理進行0.1秒～4小時。
5.權利要求4所述的方法，其中加壓處理進行1秒～30分鐘。
6.權利要求1～5中任一項所述的方法，其中加壓處理在液體中或氣體中進行。
7.權利要求1～6中任一項所述的方法，其中還包括在使土壤桿菌感染植物材料的工序2)之前或之中，對植物材料進行選自熱處理、離心處理、超聲處理中的至少1種處理。
8.權利要求1～7中任一項所述的方法，其中植物材料是單子葉植物。
9.權利要求1～7中任一項所述的方法，其中植物材料是水稻或玉米。
10.權利要求1～7中任一項所述的方法，其中植物材料是雙子葉植物。
11.權利要求1～7中任一項所述的方法，其中植物材料是煙草。
12.權利要求1～11中任一項所述的方法，其中植物材料未成熟胚。
13.權利要求1～12中任一項所述的方法，其中在使土壤桿菌感染植物材料的工序2)之后，還包括以下工序3)篩選轉化體，然后4)將所要篩選的轉化株進行再分化。
14.權利要求1～13中任一項所述的方法，其與不進行工序1)的加壓處理的情況相比較，基因導入效率提高。
15.生產轉化植物的方法，包括1)將植物材料進行加壓處理，2)使土壤桿菌感染植物材料，3)篩選轉化細胞，然后4)將所要篩選的轉化體進行再分化。
全文摘要
本發明涉及通過土壤桿菌屬細菌來進行將基因導入到植物材料中的方法。本發明的方法以包含以下工序為特征1)將植物材料進行加壓處理，然后2)使土壤桿菌感染植物材料。
文檔編號A01H1/00GK1867675SQ20048002989
公開日2006年11月22日 申請日期2004年8月5日 優先權日2003年8月13日
發明者石田佑二 申請人:日本煙草產業株式會社