專利名稱：一種黃姑魚雌核發育二倍體的誘導方法
技術領域：
本發明屬于細胞工程培育領域，涉及海水魚類雌核發育方法，尤其涉及一種黃姑魚雌核發育二倍體的誘導方法。
背景技術：
利用細胞工程技術培育水產優良品種具有重要的理論意義和廣闊的應用前景。雌核發育作為一種細胞工程技術，是進行魚類品種改良的重要途徑。在魚類養殖中采用雌核發育技術的主要目的就是建立純系和生產全雌魚。通過不同純系間雜交技術，把一些隱性基因幾乎全部去掉，從雜交后代中篩選培育出性狀優良的新品種(系)。人工誘導雌核發育 已經廣泛應用于國內外多種魚類遺傳育種的研究與實踐中。例如日本利用該技術培育出全雌虹鱒和牙鲆等供養殖利用，美國則利用該技術培育出草魚優良品系。我國自20世紀70年代中期開始展開雌核發育研究，在鯉、鯽、草、鰱等人工誘導雌核發育取得了一定的成就。在海水魚類中，我國利用雌核發育技術已經在牙鲆、大黃魚等重要經濟魚類培育出新品種，在養殖過程中顯示了明顯的優勢。黃姑魚是我國是重要的海水經濟魚類。近年來，隨著黃姑魚繁育技術的日趨成熟，其養殖規模也逐漸擴大，成為繼大黃魚后我國網箱養殖的重要品種。借鑒其他海、淡水魚養殖中良種培育的經驗，對黃姑魚進行品種改良是保證其養殖業健康持續發展的重要因素。采用傳統的育種方式(定向選擇+近交)基因純合速度慢，育種周期長，不符合當前養殖業發展的迫切需要。利用雌核發育技術可以快速排除與減少群體中存在的不良及有害基因，增加優良基因與基因型的頻率，是對黃姑魚進行遺傳改良的有效方法。另一方面，黃姑魚的雌雄兩性個體的生長存在著顯著的差異，雌魚生長顯著快于雄魚。因此有必要開展可加速育種進程的人工雌核發育技術研究，而關于黃姑魚人工雌核發育研究，國內外尚未見報道。
發明內容
本發明提供了一種黃姑魚雌核發育二倍體的誘導方法，本發明的目的是建立人工誘導黃姑魚雌核發育誘導方法，培育雌核發育二倍體苗種。為實現上述發明目的，本發明采用下述技術方案予以實現一種黃姑魚雌核發育二倍體的誘導方法，它包括以下步驟(I)黃姑魚或條石鯛精子的遺傳滅活黃姑魚精子的遺傳物質滅活將黃姑魚精液用精子稀釋液稀釋25 75倍，置于18 72mJ/mm2紫外線強度照射；條石鯛精子的遺傳物質滅活將條石鯛精液用精子稀釋液稀釋20 50倍，置于12 54mJ/mm2紫外線強度照射；(2)未受精卵與滅活精子的授精將經紫外照射的滅活精液5 30mL與成熟的黃姑魚卵子20 200mL混合，輕輕搖動混勻，加入5 IOmL海水后繼續混勻，再加入20 200mL海水置于22 23°C室溫下放置I 4min,用于染色體加倍處理；(3)雌核發育魚卵染色體加倍在授精后I 4min，將卵浸入0 4. 5°C的海水浴中進行處理5 20min，取出處理后的卵在12 15°C海水過渡10 15min，然后放入22 23°C海水中準備進行孵化；(4)染色體加倍冷休克誘導處理在休克溫度0 4. 5°C、冷休克時間5 20min條件下誘導雌核發育二倍體。對上述技術方案的進一步改進所述步驟(I)中精子稀釋液配方為NaC16g/L，KCl
0.4g/L, CaCl2O. 2g/L, pH 值 7. O。
對上述技術方案的進一步改進所述步驟(I)中黃姑魚精液稀釋40 50倍，黃姑魚精子紫外滅活的最適劑量為42mJ/mm2。對上述技術方案的進一步改進所述步驟(I)中條石鯛精液稀釋30 40倍，條石鯛精子紫外滅活的最適劑量為30mJ/mm2。對上述技術方案的進一步改進所述步驟(I)中黃姑魚精子和條石鯛精子遺傳物質滅活所用稀釋液的厚度為0.1 0. 3cm。對上述技術方案的進一步改進所述步驟(3)中授精后2min染色體開始加倍的誘
導率最聞。對上述技術方案的進一步改進所述步驟(4)中在2. 5 3. 5°C下冷休克處理Smin的雌核發育誘導率最高。與現有技術相比，本發明的優點和積極效果是1、本發明利用異源精子和同源精子誘導黃姑魚雌核發育，首次建立了黃姑魚人工雌核發育誘導方法，獲得了雌核發育二倍體苗種，所述誘導方法操作方便，高效、實用、可靠，獲得了較高的雌核發育誘導率。2、通過本發明誘導獲得的黃姑魚后代只含有雌性親本的遺傳物質，可加速優良基因純化，使優良的遺傳性狀得以迅速固定，因此，本發明可以應用于黃姑魚的快速育種，在黃姑魚遺傳分析和性別控制研究方面也具有重大的應用價值和推廣應用前景。結合附圖閱讀本發明的具體實施方式
后，本發明的其他特點和優點將變得更加清
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圖1為本發明實施例獲得的黃姑魚初孵仔魚圖，其中圖1a為雌核發育二倍體初孵仔魚圖，圖1b為單倍體初孵仔魚圖。圖2為本發明實施例獲得的黃姑魚初孵仔魚的細胞流儀檢測圖，其圖2a為正常二倍體初孵仔魚的細胞流儀檢測圖，圖2b為黃姑魚單倍體初孵仔魚的細胞流儀檢測圖，圖2c為黃姑魚雌核發育二倍體初孵仔魚的細胞流儀檢測圖。
具體實施例方式下面結合附圖和具體實施方式
對本發明的技術方案作進一步詳細的說明。實施例1本發明所述黃姑魚雌核發育二倍體的誘導方法包括以下步驟1、黃姑魚和條石鯛精子的遺傳物質滅活；2、未受精卵與滅活精子的授精；3、確定染色體加倍的起始時間；4、確定染色體冷休克溫度及處理時間。1、黃姑魚和條石鯛精子的遺傳物質滅活利用浙江省海水增養殖重點實驗室培育的黃姑魚雌魚和雄魚(采集自舟山海域)各10尾，條石鯛雄魚(采集自舟山海域)5尾，經人工催產后采集精子和卵子。經過實驗表明，同源的黃姑魚精子和異源的條石鯛精子均可誘導黃姑魚卵子進行雌核發育。黃姑魚精子的遺傳滅活條件為將黃姑魚精液用預冷的精子稀釋液(配方為NaCl6g/L，KCl 0. 4g/L，CaCl2O. 2g/L，pH值7. 0)稀釋25 75倍，平鋪于培養皿中，調整稀釋液厚度0.1 0. 3cm，設置18、30、36、42、48、60、72、84mJ/mm2等不同紫外線強度照射，然后與黃姑魚卵混合。條石鯛精子的遺傳物質滅活條件為將條石鯛精液用精子稀釋液稀釋20 50倍，平鋪于培養皿中，調整稀釋液厚度0.1 0. 3cm，用12、18、24、30、36、42、48、54、60mJ/mm2等不同紫外線強度照射，然后與黃姑魚卵子混合。人工授精后在22 23 °C的海水中孵化，培育期間統計受精率、孵化率和單倍體率。綜合考慮受精率、孵化率和單倍體率的情況，表明黃姑魚精液稀釋40 50倍，紫外滅活的最適劑量為42mJ/mm2 (如表I所示)；條石鯛精液稀釋30 40倍,紫外滅活的最適劑量為30mJ/mm2 (如表2所示)。表I不同紫外照射劑量對受精率、孵化率和單倍體誘導率的影響(黃姑魚，n=3)
權利要求
1.一種黃姑魚雌核發育二倍體的誘導方法，其特征在于它包括以下步驟(1)黃姑魚或條石鯛精子的遺傳滅活黃姑魚精子的遺傳物質滅活將黃姑魚精液用精子稀釋液稀釋25 75倍，置于18 72mJ/mm2紫外線強度照射；條石鯛精子的遺傳物質滅活將條石鯛精液用精子稀釋液稀釋20 50倍，置于12 54mJ/mm2紫外線強度照射；(2)未受精卵與滅活精子的授精將經紫外照射的滅活精液5 30mL與成熟的黃姑魚卵子20 200mL混合，輕輕搖動混勻，加入5 IOmL海水后繼續混勻，再加入20 200mL海水置于22 23°C室溫下放置 I 4min,用于染色體加倍處理；(3)雌核發育魚卵染色體加倍在授精后I 4min，將卵浸入O 4. 5°C的海水浴中進行處理5 20min，取出處理后的卵在12 15°C海水過渡10 15min，然后放入22 23°C海水中準備進行孵化；(4)染色體加倍冷休克誘導處理在休克溫度O 4. 5°C、冷休克時間5 20min條件下誘導雌核發育二倍體。
2.根據權利要求1所述的一種黃姑魚雌核發育二倍體的誘導方法，其特征在于所述步驟(I)中精子稀釋液配方為 NaCl 6g/L, KCl O. 4g/L, CaCl2 O. 2g/L，pH 值 7· O。
3.根據權利要求2所述的一種黃姑魚雌核發育二倍體的誘導方法，其特征在于所述步驟(I)中黃姑魚精液稀釋40 50倍，黃姑魚精子紫外滅活的最適劑量為42mJ /mm2。
4.根據權利要求1或2所述的一種黃姑魚雌核發育二倍體的誘導方法，其特征在于 所述步驟(I)中條石鯛精液稀釋30 40倍，條石鯛精子紫外滅活的最適劑量為30mJ/mm2。
5.根據權利要求1或2所述的一種黃姑魚雌核發育二倍體的誘導方法，其特征在于 所述步驟(I)中黃姑魚精子和條石鯛精子遺傳物質滅活所用稀釋液的厚度為O.1 O. 3cm。
6.根據權利要求1所述的一種黃姑魚雌核發育二倍體的誘導方法，其特征在于所述步驟(3)中授精后2min染色體開始加倍的誘導率最高。
7.根據權利要求1所述的一種黃姑魚雌核發育二倍體的誘導方法，其特征在于所述步驟(4)中在2. 5 3. 5°C下冷休克處理8min的雌核發育誘導率最高。
全文摘要
本發明提供了一種黃姑魚雌核發育二倍體的誘導方法，包括(1)黃姑魚或條石鯛精子的遺傳滅活；(2)黃姑魚未受精卵與滅活精子的授精；(3)雌核發育魚卵染色體加倍起始時間的確定；(4)染色體加倍冷休克溫度和持續時間的篩選。本發明首次建立了采用黃姑魚精子和條石鯛精子誘導黃姑魚卵子進行雌核發育并獲得雌核發育二倍體魚苗的方法，篩選到適合黃姑魚卵雌核發育的冷休克起始時間、冷休克溫度和持續時間。本發明具有操作方便，高效、實用、可靠的特點；通過本發明誘導獲得的黃姑魚后代只含有雌性親本的遺傳物質，可加速優良基因純化、使優良的遺傳性狀得以迅速固定，在黃姑魚育種和性別控制研究方面具有重要的應用價值和推廣應用前景。
文檔編號A01K61/00GK102986571SQ20121055510
公開日2013年3月27日 申請日期2012年12月19日 優先權日2012年12月19日
發明者徐冬冬, 樓寶, 薛寶貴, 史會來, 詹煒, 馬世磊, 毛國民 申請人:浙江省海洋水產研究所