專利名稱：抗應激發酵蛋白飼料及其生產方法
技術領域：
本發明涉及ー種多元蛋白原料配方及通過二次發酵エ藝生產的抗應激發酵蛋白濃縮飼料。
背景技術：
經過近二十年的實踐，集約化和エ業化養殖已成為水產、畜禽養殖的主要模式。這一模式在給養殖業帶來了革命性變化的同時，也嚴重暴露出背后存在著這一體系所無法克服的問題——動物應激綜合征，它已成為障礙養殖業發展最活躍的因素。1936年加拿大病理生理學家Selye提出應激學說，應激是機體受外界和內在環境中存在的生物、物理和化學等因子過度刺激后，隨即產生的一系列非特異性全身適應性反應。這些不同程度的應激反應，不但能直接影響動物的正常生長發育，而且嚴重的可導致機體免疫力下降，誘發患病甚至死亡。應激反應的發生首先是由于受到各種應激源的刺激。動物養殖生長過程中，經常遭受接種疫苗，使用藥物、搬遷、酷熱、氣候突變等應激。由應激導致才采食量下降、氨基酸、維生素、電解質吸收減少，且體內合成能力下降，引起營養、生理、代謝的一系列的變化。應激給畜禽生產造成的損失不容忽視。隨著動物生產規模化和產業化，養殖集約化程度越來越高，動物遭受到越來越多的應激，造成應激過度，即動物機體受到長時間或高強度的應激源刺激時，就會產生嚴重的不利影響，從而危害機體。由此引起的應激常導致動物機體內分解代謝增強，合成代謝降低，表現為生長停滯、體重下降、飼料轉化率降低、產品質量下降、機體免疫力降低，在生產中越來越影響到動物的生產成績(楊玉鳳等，抗應激添加劑在畜禽生產上的應用。今日畜牧獸醫，2006年08期)。早期對應激的發生機制的研究主要集中在神經和內分泌系統，后來發現應激還與機體免疫系統密切相關。強烈的應激刺激可導致神經、內分泌失調，免疫功能障礙，總體表現為T、B淋巴細胞、NK細胞等免疫細胞的數量減少，増殖活性減低，特異和非特異性免疫反應能力減弱，免疫調節因子(IL - 2、IFN等)產生減少(Tracy BH, Sheldon C.stress and immunity in humans : a meta analytic review. Psychosomatic Medicine,1993，55: 364 - 379.)。在應激反應的初期主要表現為下丘腦-垂體-腎上腺皮質軸系(HPA ax2is)及交感神經-腎上腺髓質系統的興奮，糖皮質激素分泌增高，而免疫功能失調是神經和內分泌反應的直接結果，中后期則表現為應激障礙，免疫功能低下(Eskandari F , Sternberg EM. Neural immune interactions in health and disease.Ann N Y Acad Sci，2002, 966: 20 - 27.)。不同類型的應激對免疫功能的影響可能有一定差異，但對免疫功能的影響以細胞免疫反應為主，表現為T淋巴細胞數量減少，增殖活性降低，免疫調節和殺傷能力下降。體液免疫反應相對復雜，與應激源種類、強度、持續時間等有夫，比如在熱應激的早中期階段，B淋巴細胞抗體產生增多，而后則表現為細胞活性下降，抗體產生抑制(靳杭紅等，生理和心理應激反應對免疫功能的影響及保護措施。中華現代護理學雜志，2007 (4)，7 :591-594)。所以，應激是通過增高血漿皮質醇、降低吞噬細胞功能及抑制抗體反應來影響動物免疫功能的。另外，應激使體內自由基増加，進ー步影響體內維生素E的含量，降低了機體的抗病能力(李留安等，運輸應激對動物機體功能影響的研究進展。黑龍江畜牧獸醫，科技版，2010，9 :40-41)。機體免疫力下降、抗病カ減弱，易造成傳染病和流行病的流行。所以說應激是萬病之源。目前對應激發生的防治盡管方法很多，但對緩解或控制應激的措施尚不十分完善。所以要取得良好的抗應激效果，應盡可能弄清應激源，采取綜合性措施(加強飼養管理、合理配制日糧、使用無毒副作用的抗應激劑等)，才能取得滿意的效果(楊玉鳳等，抗應激添加劑在畜禽生產上的應用。今日畜牧獸醫，2006年08期)。抗應激因子是指具有緩解、防治由應激源引起的應激綜合癥的物質，抗應激的作用機理也各有不同，概括起來，主要有幾個方面①調節中樞神經系統，起安定鎮靜、降低應激敏感性作用。如通過營養如色氨酸、酪氨酸、牛磺酸、5-0H色胺，中草藥如柴胡等影響下丘腦腎上腺皮質激素釋放激素分泌；調低代謝速度，防止代謝過度對機體的損傷。②抗氧化、清除活性氧自由基、調節由應激導致的自由基代謝紊亂，是許多抗應激添加劑發揮作用的主要方式，如VC、VE 、谷胱甘肽、蝦青素等)；③調節機體各種物質代謝，調節由應激導致的機體代謝異常；④提高機體免疫力，增強抗病能力。下面重點介紹幾種與本發明相關的，能提高機體免疫能力，具有抗氧化、清除氧自由基作用的抗應激因子。谷胱甘肽(glutathione，GSH)是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成的含有巰基的天然三肽，作為真核細胞內普遍存在的小分子抗氧化劑，在機體內的氧自由基消除上起關鍵作用。谷胱甘肽易與某些藥物、毒素(如自由基、碘こ酸、芥子氣，鉛、汞、神等重金屬)等結合，具有抗氧化作用和整合解毒作用。在生物體內對于維持機體適宜的氧化還原環境起著全天直要的作用(Izawa S，etal. Oxidative stress response in yeast: effectof glutathione on adaptation to hydrogen peroxide stress in Saccharomycescerevisiae. FEBS Lett. 1995, Jul, 10: 368(1) :73-6.;朱選等，飼料中添加谷胱甘肽對草魚組織中谷胱甘肽沉積和抗氧化能力的影響。中國水產科學，2008,01 :160-166 )。研究表明，GSH可提高水產動物的抗氧化能力和消化酶活性，激發機體免疫力，提高抗應激能力，從而促進機體生長(Zambohino Infante J. etal; Partial substitution of diandtripeptides for native proteins in sea bass diets improve dicentrarchus labraslarval development. J Nutr., 1997 Apr; 127 (4) : 608-14 ;劉曉華等，飼料中添加谷胱甘肽對凡納濱對蝦肝胰腺抗氧化指標和脂質過氧化物含量的影響。水產學報，2007，02 235-240 ;趙紅霞等，飼料中添加谷胱甘肽對草魚生長、生理指標和抗病力的影響。中國水產科學，2007，04 =678-683 ；曹俊明等，飼料中添加谷胱甘肽對凡納濱對蝦非特異性免疫因子和相關酶活性的影響。華中農業大學學報，2007年04期528-532)。大豆異黃酮屬異黃酮類植物雌激素，主要存在于豆科植物中，其主要成分為染料木素、大豆苷元和大豆黃素，具有抗氧化、調節機體免疫系統及內分泌系統等多種生物學功能，在畜牧、水產養殖業中有著極其廣泛的用途，其應用前景非常廣闊。(張蕊；大豆異黃酮的特性及其應用研究進展，動物營養學報，2011年11期1884-1890。)
大豆異黃酮可以促進動物生長(王琨等，半胱胺、大豆異黃酮、3 -葡聚糖對美洲鰻幼鰻生長的影響。福建農業科技，2008，06 :75-77 ;米海峰等，飼料中大豆異黃酮和大豆皂甙對牙鲆肝臟和腸道蛋白質消化酶活性和基因表達的影響。中國海洋大學學報(自然科學版)，2011,41 (12) :40-45)，增強機體免疫力(黃桂菊等，大豆異黃酮對魚類免疫增強作用的初步研究。南方水產，2005，02 :35-40)，提高消化酶活性，且通過提高體內的抗氧化活性和ACP活性而增強魚體的抗應激能力(葉繼丹等，大豆黃素對美洲鰻生長及肝、腸組織中幾種代謝酶活性的影響。集美大學學報(自然科學版)，2008，13 (1):1-6)。同時，大豆異黃酮還具有增強免疫功能的作用。研究表明大豆異黃酮能明顯刺激小鼠的脾淋巴細胞增值、轉化作用，促進小鼠遲發型變態反應作用，提高小鼠抗體生成細胞數和血清溶血素水平，促進小鼠單核-巨噬細胞碳廓清作用，增強小鼠的單核-腹腔巨噬細胞吞噬能力，提高小鼠NK細胞活性。(韓彥彬等；大豆異黃酮對小鼠免疫功能影響的研究，中國衛生檢驗雜志，2010 (05) :1046-1048+1058)。染料木素為大豆內主要異黃酮成分，因此，可以通過檢測染料木素的含量來代表蛋白濃縮料中大豆異黃酮相關的抗應激生物活性因子的含量。已證明能提高畜禽動物免疫系統的發育，增強機體免疫功能(謝振興等；異黃酮染料木素對蛋雞外周血T淋巴細胞轉化力的影響，動物生理生化學分會第八次學術會議暨全國反芻動物營養生理生化第三次學術研討會，2004年，長春；王洋等，大豆異黃酮片對肉仔公雞免疫功能的影響，中國農學通報，2009年20期35-37 ;金光明等，大豆異 黃酮對鴨小腸黏膜內淋巴細胞分布的影響，安徽科技學院學報，2011 年 02 期 69-72 ;Yaghoubi SM, Ghorbani GR, Rahmani HR, Nikkhah
A.Growth, weaning performance and blood indicators oi humoral immunity inHolstein calves fed supplemental flavonoids. J Anim Physiol Anim Nutr (Berl).2008 Aug; 92 (4) :456-62. Epub 2007 Sep 14.);染料木素還具有抑菌和抗氧化性等生理活性(王海濤等，染料木素的抑菌活性及其機制的研究，營養學報，2008，30 (4):403-406 ;謝明杰等，大豆異黃酮的抑菌作用，大豆科學，2004，23 :101 — 105)。抑菌作用可以減少病原微生物應激源；抗氧化活性可以清除活性氧自由基，調節由應激導致的自由基代謝紊亂；免疫功能的提高也增強對疾病的抵抗作用。所以染料木素(大豆異黃酮)是ー類能提高機體免疫能力，具有抗氧化功能的抗應激因子。蝦殼、腸膜蛋白中富含幾丁質(又稱甲殼質、甲殼素)，通過N-脫こ酰基作用，可降解為殼聚糖，化學名稱為聚葡萄糖胺(1-4)-2-氨基-B-D葡萄糖。可以通過檢測氨基葡萄糖的含量來代表蛋白濃縮料中殼聚糖類的抗應激因子的含量。殼聚糖作為飼料添加劑對動物具有促生長效果，井能夠提高水產動物的抗病、免疫功能，表現良好的抗應激功能(劉興國等，低分子殼聚糖對羅非魚肝組織抗氧化能力和肝脂含量影響的研究。海洋漁業，2004，26 (4):291-294;沈錦玉等，免疫增強劑對中華絨螯蟹免疫功能的影響，浙江農業學報，2004，16 ( I) :25-29 ;胡品虎，稀土甲殼素在河蟹養殖中的應用。水產養殖，1999，05 13-14 ;李明春等，羧甲基殼聚糖抗應激損傷的作用。實用醫藥雜志，2008，25 (02) :221 ;陳云波等，殼聚糖對異育銀鯽生長及抗菌能力的影響。上海水產大學學報，2006，15 (2):243-246 ;王紅權等，殼聚糖對草魚生長及肌肉營養成分的影響。湖南農業大學學報(自然科學版)，2008，34 (5) :576-578)。殼聚糖和氨基葡萄糖具有抑菌和抗氧化作用(韓寶芹等，羧甲基殼聚糖、鹽酸氨基葡萄糖及N-こ酰氨基葡萄糖對大鼠胰島細胞生長及胰島素分泌量的影響，中國生物醫學工程學，2004，02 =187-191 ;張蘭杰等，D-氨基葡萄糖鹽酸鹽的制備及抗氧化特性的研究，食品科學，2007，28 (04): 103-105)，能減少應激并調節由應激導致的氧自由基代謝紊亂。氨基葡萄糖對特異性細胞免疫功能和體液免疫功能以及非特異性免疫功能均有明顯的促進作用，能夠增強小鼠免疫功能(付辰煒等，氨基葡萄糖對小鼠免疫功能的影響，營養學報，Acta Nutrimenta Sinica, 2007年01期51-53+57)。氨基葡萄糖及其衍生物還具有自由基清除能力，還原力，金屬絡合能力以及對羥自由基誘導的生物大分子如脂類、脫氧核糖和蛋白質的氧化性損傷的保護作用(楊艷；殼寡糖，氨基葡萄糖及其衍生物的抗氧化功能研究，中國海洋大學，生物化學，2005，博士論文)。氨基葡萄糖能提高機體免疫能力，具有抗氧化、清除氧自由基作用，是很有應用前景的抗應激因子。抗菌肽(Antimicruobial peptides)是生物體免疫系統產生的ー類抵抗外界病原體感染的小分子肽類生物活性物質。抗菌肽可以提高魚類(王四新等，抗菌肽對草魚生長性能的影響，飼料研究，2011，04 29-31 ;王四新等，抗菌肽對鯉魚生長性能的影響，飼料研究，2012，05 :64-65+73)、對蝦(王廣軍等，抗菌蛋白在南美白對蝦養殖中的應用試驗，飼料エ業，2005，08 :33-34)和河蟹(王ー娟等，抗菌肽對河蟹生長、免疫及抗氧化能力的影響，江蘇農業科學，2011，02 :340-343)、以及禽類(王秀青等；抗菌肽CecropinB對雞生長發育及免疫功能的影響，寧夏醫科大學學報，2010年01期39-41+46 ;李麗；抗菌肽Abaecin制備及其對肉雞生長及免疫影響的研究，內蒙古農業大學，動物營養與飼料科學，2010，博士論文；王靜；抗菌肽對肉雞生產性能和免疫功能的影響研究，山東農業大學，動物營養與飼料科學， 2007，碩士論文)的日增重和飼料轉化率，調節免疫機能，減少應激。CN 102293351A公開了ー種用于花鰱養殖的生物飼料，將豆柏、花生柏、棉柏、菜柏進行混合，在混合料中加入枯草芽胞桿菌進行攪拌和發酵；CN 102524535A公開了ー種飼用動植物復合低聚肽添加剤，以豆柏、菜柏、棉柏、玉米蛋白粉或酒糟等植物蛋白質原料和魚粉、魚、蝦、蟹或水產品旳加工下腳料等動物蛋白質原料，經接入乳酸菌、酵母菌和芽孢桿菌固態發酵制成；CN102669483A公開了ー種混合植物蛋白魚飼料，包括以下原料發酵制成菜柏和棉柏的混合物、枯草芽孢桿菌發酵液、糞腸球菌發酵液、黑曲霉發酵液、釀酒酵母發酵液和無機鹽；CN102334601A公開了ー種蛋雞飼料，利用乳酸菌和釀酒酵母對瓜爾豆柏進行發酵；CN102178092A公開了ー種禽類飼料，首先利用復合菌液發酵豆柏、棉柏、酒糟蛋白飼料制得發酵蛋白飼料，后將發酵蛋白飼料和玉米混合制得；CN102178093A公開了ー種豬飼料，以豆柏、棉柏、酒糟蛋白飼料和玉米為原料，接入酵母菌、乳酸菌和枯草芽孢桿菌進行發酵而成；CN102715341A公開了ー種雞、豬和牛的飼料，以生產酒精的濕渣、豆柏和棉柏為原料，經復合微生物菌群發酵，包括乳酸菌群、酵母菌群、放線菌群、絲狀菌群等；CN102100302A 公開了ー種畜禽飼料，由枯草芽孢桿菌發酵餅柏和麩皮而成；CN102488084A公開了ー種畜禽飼料，以秸桿、餅柏、糠麩和玉米面為原料，加入少量硫酸銨和尿素，用1%石灰水調pH至5. 5-6. 5，接種白地霉菌、乳酸菌、地衣芽孢桿菌混合發酵制成；CN101449739公開了ー種微生態發酵蛋白飼料及其制備方法，將豆柏和蠶蛹以枯草芽孢桿菌、釀酒酵母、乳酸桿菌和少孢根霉混菌固態發酵制成；CN102246884A公開了ー種蛋雞蛋白飼料，利用枯草芽孢桿菌和保加利亞乳桿菌等混菌固態發酵而成。但這些現有技術均沒有利用多元配方和采用二次發酵エ藝生產，并且所生產的飼料沒有涉及具有抗應激的效果。
發明內容
本發明采用多種源性蛋白原料，及特有的配方、合適的配比，通過特殊的二次發酵エ藝進行混菌發酵，得到功能性高、抗應激效果好、經濟性強的蛋白飼料產品。本發明的蛋白飼料采用植物源性蛋白原料35-90%、陸生動物源性蛋白原料3-20%、海洋動物源性蛋白原料2-60%，接種復合菌種，進行高溫、中溫兩階段發酵制成。本發明還提供一種本發明蛋白飼料的生產方法，包括將植物源性蛋白原料、陸生動物源性蛋白原料、海洋動物源性蛋白原料按比例混合；接種高溫發酵復合菌種進行一次發酵；接種中溫發酵復合菌種進行二次發酵。本發明還涉及本發明的蛋白飼料在配制水產或畜禽飼料中的用途。本發明的蛋白飼料，通過微生物發酵，使不同來源、不同組成的蛋白，與微生物源性菌體蛋白一起，形成營養成分的平衡，更利于動物快速生長的全面營養需求。為方便本發明蛋白原料的選擇，提高本發明飼料的碳氮比值，本發明優選采用腸膜蛋白粉作為陸生動物源性蛋白原料，魚粉和/或蝦殼粉作為海洋動物源性蛋白原料，豆柏、棉柏和菜柏作為植物源性蛋白。這些原料均屬于我國2012年6月農業部發布的1773號公告“飼料原料目錄范圍”中。本發明中，可以同時使用豆柏、棉柏和菜柏作為植物源性蛋白原料，它們在飼料原料中的比例可以是丑柏20-80%,棉柏3-40%,菜柏3_40%。柏除了具有氛基酸平衡、適ロ性好等特點外，還含有大豆異黃酮，具有提高動物免疫力，抗應激作用。大豆異黃酮的主要活性成分是染料木素(genistein)、大豆素(daidzein)和黃豆黃素(glycitein)。通過二次發酵エ藝，將豆柏中的大豆異黃酮轉化為染料木素等，從而具有抑菌、抗氧化活性，并能提高機體免疫能力，抗應激功能。研究表明，過高的蛋白質本身就是應激源(陳平潔等，水產養殖中的擁擠脅迫和操作脅迫，飼料エ業，2007，28 (22) :18-21 )。通過二次發酵エ藝，而蛋白質降解的中間產物小肽具有參與動物機體免疫系統的調節作用，促進機體的抗應激能力。而且抗菌活性的小肽能抑制和殺滅動物體內的病原微生物、維持魚苗的身體健康，提高成活率(孫克年，水產養殖動物抗應激飼料添加剤，內陸水產，2004，10 45-46)0隨著蛋白質消化吸收及代謝規律研究的不斷深入，發現部分小肽可穿過動物腸壁屏障被吸收進入循環系統(林煌映，小肽吸收機制研究進展，畜牧市場，2005，08 :76-78)。與氨基酸相比，小肽更利于促進動物的消化吸收和生長發育，增強抗病能力，可提高飼料利用率。將餅柏類中的大分子蛋白質降解成小分子短肽，與具有相同氨基酸組成的蛋白質相比，具有促進動物生長性能，增強機體免疫力，促進微量元素吸收、促進腸道黏膜結構和功能發育等生物學作用(陳培賽等，小肽的動物營養研究，養殖與飼料，2008 (4) : 95-97)。而蝦殼、腸膜蛋白中富含幾丁質(又稱甲殼質、甲殼素)，通過二次發酵エ藝，可降解為殼聚糖及氨基葡萄糖。這些代謝中間產物與微生物分泌的谷胱甘肽、抗菌肽和活性肽類一起，使本發明生產的發酵蛋白濃縮料不僅增強所飼動物的免疫力，而且表現良好的抗應激功能。腸膜蛋白粉是采用豬小腸組織作為原料，經過生物酶水解、附著和烘干制成，其實一種動物源性飼料蛋白質，富含短鏈肽和平衡的氨基酸；增強動物特別是幼小動物的生產性能和健康水平；以短鏈肽形式存在的氨基酸和自由氨基酸具有較高的生物活性。作為海洋動物源性蛋白原料，魚粉和蝦殼粉可以擇ー使用，也可以同時使用。如果同時使用魚粉和蝦殼粉，它們之間比例可以是任意比例混配。本發明中，發酵菌種優選選用枯草芽孢桿菌UaciBy1S仰況iBk)、地衣芽孢桿菌iBacIiCUs lincheniformi51)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和乳酸片球菌iPediococcus acidilactic1、。這四種菌均屬于我國農業部2008年12月發布的第1126號公告“飼料添加劑品種目錄”中。通過復合菌種的二次發酵后，產生多肽、活性多糖、氨基酸，維生素、酶類等中間代謝產物和抗應激營養元素，及大豆異黃酮和染料木素、谷胱甘肽、殼聚糖及氨基葡萄糖、以及抗菌肽等抗應激活性因子。不僅增強所飼動物的免疫力，也表現良好的抗應激力。在一個優選的實施方案中，在發酵階段，首先接種枯草芽孢桿菌subtillis、和地衣芽抱桿菌iBaclicus lincheni formi s ),在55-65 °C條件下高溫好氧發酵6-24小時，然后在培養基溫度降低到40-50 °C時，再接種釀酒酵母cerevisiae、和乳酸片球菌iPediococcus acidilactici ),在30_50°C條件下,進行中溫兼性厭氧發酵24-72小吋。枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌是能夠產生芽孢的好氧菌，能耐受高溫、高壓和酸堿，生命力強。枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌能夠產生維生素B1、B2、B6等B族維生素、VC、蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶等酶以及多種代謝產物，對飼料的降解消化吸收和動物的營養代謝起到促進作用(李永凱等，益生菌發酵飼料研究及應用現狀，畜牧與獸醫，2009，03 90-93);同時枯草和地衣芽孢桿菌能分泌多種抗菌物質，目前研究證實，枯草芽孢桿菌能夠產生40多種抗菌物質，如subtilin, subtilosin A, TasA和sublancin等抗菌蛋白和多肽(胡瑞萍等，枯草芽孢桿菌BSD-2—種抗菌肽的分離純化與鑒定，華北農學報，2011，06 201-206)。孫穎鋒等(芽孢桿菌抗菌肽對對蝦養殖環境中錸孢菌的抑菌效應，廣東農業科學，2011，18 :95-97)報道，芽孢桿菌抗菌肽對對蝦養殖環境中錸孢菌的抑菌效應，從而改善水體環境，減少應激源。酵母菌體中含有非常豐富的蛋白質、B族維生素、脂肪、糖、酶等多種營養成分。大量的應用研究試驗證明，酵母在提高動物免疫力、提高動物生產性能和減少應激等方面均起作用。酵母的促生長作用和抗應激作用可能與其所含豐富的游離氨基酸、核苷酸、P -葡聚糖、甘露聚糖等有夫。許多研究表明，將酵母碎片添加到飼料中顯著提高了動物免疫力、抗菌防病能力和抗應激能力(陳昌福，免疫多糖(酵母細胞壁)對受免異育銀鯽免疫應答的調節作用。淡水漁業，2004，4 55-57 ;陳國鳳等，酵母膏對異育銀鯽生長和抗應激能力的影響，飼料エ業，2009，18 :22-25)，因為酵母碎片中富含P -葡聚糖(劉棟輝等，P -葡聚糖和維生素C對斑節對蝦生長和抗病力的效果。中山大學學報(自然科學版)，2002，04 59-62 ；banoo PK.善,The effect of dietary immunomodul atj on upon Edwardsiella tardavaccination in healthy and immunocompromised Indian major carp (Labeo rohita).Fish Shellfish Immunol. 2002 Jan; 12 (I) : 1-16)、甲殼素(莊承紀等，殼多糖對羅氏沼蟲下苗、斑節對蝦苗的生長和防菌抗病作用的研究。湛江海洋大學學報，1998，18 (3):30-34 ;劉恒等，免疫多糖對南美白對蝦作用的研究。海洋與湖沼，1998,29 (3):113-118)和核苷(張一平等，酵母核苷酸對團頭魴生長性能、抗氧化功能和抗病カ的影響。動物營養學報，2012，Vol. (3) :583-590)等。有明顯抗應激功能的谷胱甘肽也一般用酵母菌發酵法生產(賈學杰等，復合誘變和抗性篩選高產谷胱甘肽酵母菌株，中國醫藥エ業雜志，2005，10 =604-607 ；賈建萍等，谷胱甘肽高產菌株的選育，微生物學通報，2003，04 :24-29)。所以本發明二次發酵選擇酵母為主要菌種之一。乳酸菌是應用最早、最廣泛的益生菌，是目前世界公認安全的食品級微生物，研究發現其代謝產物和活菌液對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌都有很強的抑菌效果，隨著PH值的降低抑菌作用逐漸變強，活菌體內和代謝產物中含有較高的超氧化物歧化酶(S0D)，能增強動物免疫(李曉暉，飼用微生物的種類和主要作用，飼料エ業，2002，02 :30-32)。乳酸菌抗菌肽Nisin是世界公認安全的天然食品防腐劑；以Pediocin為代表的Class II a類抗菌肽具有抑菌譜廣、穩定性高、分散性好、安全高效等優點倍受關注(易華西等，乳酸菌細菌素抗菌潛カ挖掘研究進展乳酸菌細菌素抗菌潛カ挖掘研究進展，中國食品添加剤，2010，01 :73-76)。在本發明中，菌種可單獨地按常規方法從低溫保存的菌種中挑取菌種劃線接種到固體平板培養基，于合適條件下培養，待長出菌落，再接種于液體培養基進行振蕩培養；然后高溫復合菌枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌分別進行固體發酵培養，控制發酵條件使其充分產酶，培養物可以馬上作為菌種使用，也可以烘干保存，最長達一年時間。可以按比例(0. 25-2. 5) 1分別接種進行一次發酵，或將培養物按活菌數比例混合后再進行接種發酵。而酵母和乳酸菌菌種則分別接種于適合的液體培養基中進行發酵，由于乳酸菌培養物不易保存，一般馬上使用，在進行二次發酵前可以將兩種菌按活菌數比例(1-5) 1 ニ次接種。發酵之后，獲得 的蛋白飼料可以直接使用。也可以將上述發酵好的物料進行濃縮，使水分減少至物料含水率在12%或更低，再對物料進行篩分、計量。本發明的方法可以通過本領域常用的方法和常規的設備來實現。在ー個具體的實施方式中，本發明的方法可以使用申請號為200920108353. 8發明名稱為《有機垃圾生化處理機》的中國發明專利中公開的設備來實施。該整套設備共由五部分構成熱風循環系統、攪拌系統、排風和集塵系統、補氧系統、自動提升喂料系統、及電控系統。整個電控系統在程序控制下，對發酵內的溫度、壓力、補氧量、循環風溫度、排風溫度等，按特定的エ藝流程，進行有效調節，使得物料在預設的時間內，自動完成發酵干燥和冷卻的全過程。利用該專利中記載的生化處理機可以完成本發明的整個發酵過程，發酵的エ藝參數控制可以使用計算機自動化控制體系，提供完全合適的好氧和兼性厭氧發酵條件，保證蛋白飼料產品技術指標具有一致性、穩定性和可重復性。本發明將結合這個具體的實施方案，對本發明的抗應激發酵蛋白濃縮飼料多元配方、二次發酵エ藝及其生產方法具體過程進行進ー步描述
(I)原材料處理將豆柏、棉柏、菜柏和腸膜蛋白粉以及魚粉和/或蝦殼粉過磅計量，按比例混合后裝入有機垃圾生化處理機。(2) 一次接種高溫發酵復合菌種枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌分別進行固體發酵培養，按活菌數比例(0. 25-2. 5) 1混合成一次接種的混合菌種。將制備好的混合菌種與原料混合。然后，加水調節物料含水率至45-60%，調水是使形成更加適宜微生物快速激活的生長環境。菌種的接種量可以是本領域技術人員根據常規知識和所需發酵程度測定得到的。按每公斤原料物料比例添加12. 5-35g混合菌種，使得每克物料含復合菌活菌數1. 5-2. OXlO70(3) 一次發酵啟動生化處理機，將待發酵物料攪拌均勻；然后啟動自動程序，對發酵物料的溫度、循環風的溫度、排風的溫度和發酵干燥室內的壓カ的有效控制，使物料達到55-65°C ;保持恒溫，發酵6-24小吋。期間循環風機不斷將新鮮空氣送入處理機發酵池中，同時設備以一定的轉速(例如10-20轉/分鐘)攪拌物料。使微生物得到充足的氧氣，達到適合枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌生長、繁殖要求。同時，處理機發酵池內的菌體大量繁殖，并合成所需的各種酶，降解大分子有機質，轉化為小分子蛋白、多肽和代謝寡糖；同時物料在發酵過程中的高溫能殺滅原料中的有害微生物，并降除某些抗營養因子或改變其結構以利于微生物的分解。
(4) 二次接種完成一次發酵后，當物料溫度降低到40°C -50°C時，接種酵母和乳酸菌菌種液體培養物，按活菌數比例(1-5):1混合，每公斤物料添加20-60g混合菌種，使得每克物料含復合菌活菌數1. 5-2. OX IO70這是由酵母和乳酸菌生長溫度決定的，同時二次接種應用液體菌種，可以使菌種快速進入二次發酵，也對高溫發酵后物料水分含量進行補充，使其穩定在45-60%。(5) 二次發酵通過調整生化處理機的計算機自動化控制體系，對發酵內的溫度、壓力、補氧量、循環風溫度、排風溫度等，按特定的エ藝流程，進行有效調節，使物料達到30-50 V ；保持恒溫，發酵24-72小時。使大量有生物活性的中間代謝產物如維生素、葡聚糖、殼聚糖、染料木素、谷胱甘肽、氨基葡萄糖、抗菌肽等能形成，從而使發酵蛋白飼料產品具有非常強的抗應激效果。(6)后加工發酵之后，獲得的發酵蛋白飼料可以直接使用。為方便以產品形成存在，優選將上述發酵好的物料濃縮，使水分減少至物料含水率在12%或更低，再對物料進行篩分、計量。本發明的蛋白飼料產品，經檢測得到其技術指標如下表所示
表I產品主要營養成分 __
權利要求
1.一種抗應激發酵蛋白飼料，其特征在于由植物源性蛋白原料35-90%、陸生動物源性蛋白原料3-20%、海洋動物源性蛋白原料2-60%，通過接種復合菌種，進行高溫、中溫兩階段發酵制成，所述的飼料中，染料木素的含量為51-204 mg/kg，谷胱甘肽的含量為34-430 mg/kg，氨基葡萄糖的含量為20-146 mg/kg。
2.根據權利要求1的抗應激蛋白飼料，其中使用腸膜蛋白粉作為陸生動物源性蛋白原料，魚粉和/或蝦殼粉作為海洋動物源性蛋白原料，豆柏、棉柏和菜柏作為植物源性蛋白。
3.根據權利要求2的抗應激蛋白飼料，其中作為植物源性蛋白原料的豆柏、棉柏和菜柏，它們在飼料原料中的比例是豆柏20-80%，棉柏3-40%，菜柏3-40%。
4.根據權利要求1或2的抗應激蛋白飼料，其中在發酵階段，首先接種枯草芽孢桿菌CZfeciJJw1S subtillis、和地衣芽抱桿菌lincheniformis),在條件下高溫好氧發酵6-24小時，然后在培養基溫度降低到40-50°C時，再接種釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和乳酸片球菌 iPediococcus acidilacticf),在 30_50°C條件下，進行中溫兼性厭氧發酵24-72小時。
5.根據權利要求4的抗應激蛋白飼料，其中高溫好氧發酵階段中，枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌按活菌數比例(0. 25-2. 5) 1分別接種或者混合成一次接種的混合菌種，并且發酵菌種的接種量按每公斤原料物料比例添加12. 5-35g的該混合菌種。
6.根據權利要求4或5的抗應激蛋白飼料，其中中溫兼性厭氧發酵階段中，酵母和乳酸菌按活菌數比例(1-5) 1混合成二次接種的混合菌種，并且發酵菌種的接種量按每公斤物料添加20-60g的該混合菌種。
7.根據權利要求1-6任一項的抗應激蛋白飼料，其中將發酵好的物料濃縮，使水分減少至物料含水率在12%或更低。
8.一種抗應激發酵蛋白飼料的生產方法，其特征在于包括將植物源性蛋白原料、陸生動物源性蛋白原料、海洋動物源性蛋白原料，按植物源性蛋白原料35-90%、陸生動物源性蛋白原料3-20%、海洋動物源性蛋白原料2-60%的比例混合；接種高溫發酵復合菌種進行一次發酵；接種中溫發酵復合菌種進行二次發酵；使所得的飼料中，染料木素的含量為51-204 mg/kg，谷胱甘肽的含量為34-430 mg/kg，氨基葡萄糖的含量為20-146 mg/kg。
9.根據權利要求8的抗應激蛋白飼料生產方法，其中使用腸膜蛋白粉作為陸生動物源性蛋白原料，魚粉和/或蝦殼粉作為海洋動物源性蛋白原料，豆柏、棉柏和菜柏作為植物源性蛋白。
10.根據權利要求9的抗應激蛋白飼料生產方法，其中作為植物源性蛋白原料的豆柏、棉柏和菜柏，它們在詞料原料中的比例是ii柏20-80%,棉柏3_40%，菜柏3_40%。
11.根據權利要求8或9的抗應激蛋白飼料生產方法，其中在發酵階段，首先接種枯草芽抱桿菌{Bacillus和地衣芽抱桿菌iBaclicus lincheniformis)，電沿-研>°C條件下高溫好氧發酵6-24小時，然后在培養基溫度降低到40-50°C時，再接種釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和乳酸片球菌 iPediococcus acidilacticf),在 30_50°C條件下，進行中溫兼性厭氧發酵24-72小時。
12.根據權利要求11的抗應激蛋白飼料生產方法，其中高溫好氧發酵階段中，枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌按活菌數比例(0. 25-2. 5) 1混合成一次接種的混合菌種，并且發酵菌種的接種量按每公斤原料物料比例添加12. 5-35g的該混合菌種。
13.根據權利要求11或12的抗應激蛋白飼料生產方法，其中中溫兼性厭氧發酵階段中，酵母和乳酸菌按活菌數比例(1-5):1混合成二次接種的混合菌種，并且發酵菌種的接種量按每公斤物料添加20-60g的該混合菌種。
14.根據權利要求8-13任一項的抗應激蛋白飼料生產方法，其中將發酵好的物料濃縮，使水分減少至物料含水率在12%或更低。
15.權利要求1或2的蛋白飼料在配制水產飼料或畜禽飼料中的用途。
全文摘要
本發明提供了一種抗應激發酵蛋白飼料，由植物源性蛋白原料、陸生動物源性蛋白原料、海洋動物源性蛋白原料，通過接種復合菌種，進行高溫、中溫兩階段發酵制成。本發明蛋白飼料中的大分子物質被消化分解為小分子物質,營養成分中應激源減少，同時增加了染料木素、谷胱甘肽及氨基葡萄糖等抗應激活性因子，增強了所飼動物的免疫力，并表現良好的抗應激能力。本發明還提供了抗應激發酵蛋白飼料的生產方法，采用多種源性蛋白原料，及特有的配方、合適的配比，通過特殊的二次發酵工藝進行混菌發酵，得到功能性高、抗應激效果好、經濟性強的飼料產品。
文檔編號A23K1/00GK103027187SQ20131000162
公開日2013年4月10日 申請日期2013年1月5日 優先權日2013年1月5日
發明者黃謙, 于家伊 申請人:北京嘉博文生物科技有限公司