玉米抗除草劑蛋白及其在植物育種中的應用的制作方法

專利名稱：玉米抗除草劑蛋白及其在植物育種中的應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于植物蛋白質領域，具體而言，本發明涉及能賦予植物(尤其是玉米)除草劑抗性(耐受性)的蛋白及其在植物育種中的應用。
背景技術：
農田中雜草是影響農作物產量的最重要因素之一，而人工除草所需要消耗的人力資源和成本很高，而且不便于農業集約化生產，嚴重制約了農作物種植向高產、優質和低成本方向的發展進程。因此，除草劑就運應而生，其使用為解決農田草害、促進栽培方式的革新及增產中起了很大的作用。常見的除草劑，包括有磺酰脲類、咪唑啉酮類、嘧啶并三唑類、水楊酸嘧啶類等除草劑，目前已經大面積商業推廣使用。然而，由于這些除草劑通常也能殺死農作物本身，因此對一般不具有除草劑抗性(耐受性)的農作物而言，除草劑的使用在時間和空間上受到了極大限制，如需要在農作物播種前一段時間使用除草劑。為此，人們研究開發具有除草劑抗性(耐受性)的植物(農作物)，這樣可以在種植期間使用除草劑，殺死雜草，但不影響植物本身的生長，由此拓寬了除草劑的使用范圍。盡管當前有不少文獻報道在某些基因上進行突變再導入野生型植物成為轉基因植物，可以給植物帶來除草劑抗性，但是實驗多針對擬南芥等遺傳背景比較清楚的模式植物，但是對于實際種植的農作物，尤其是經過大量前期轉基因和/或非轉基因育種獲得的具有良好性狀(同時遺傳背景復雜)的農作物來說，往往情況很不樂觀，如我們發現，在體外和/或擬南芥導入測試具有除草劑抗性的突變基因，導入玉米等后卻發生大量發生了回復喪失除草劑抗性的情況，有些雖然保留了除草劑抗性，但是玉米生長發育不正常而根本無法實踐中應用，這很可能是由于玉米中大量基因協同作用的結果。所以，對于復雜遺傳背景的植物(如玉米，尤其是改良過的玉米 )，具有除草劑抗性的植物及其真實能起決定性的物質(如蛋白、基因等)目前還沒有理論來定向設計出，只能依賴于科研人員艱苦實踐而獲得，尤其是依賴長期篩選，并且憑借一些運氣才能獲得。本發明人正是長期而艱苦的研究實踐，憑借運氣偶然地在玉米自交系京21突變植株中發現了一系列(突變)蛋白，其能夠在除草劑存在的條件下基本保持原有蛋白的正常植物生理功能，從而使得玉米(尤其是京21)具有除草劑抗性(耐受性)。本發明人還開發了這些蛋白及其編碼基因在轉基因或者非轉基因植物育種中的應用，可用于培育具有除草劑抗性的植物，尤其是農作物，如玉米等。

發明內容
本發明要解決的技術問題在于提供新的使植物具有除草劑抗性的蛋白質。另外，本發明還提供了編碼這些蛋白質的核酸以及基因工程中間體(如，表達盒、載體和細胞等)，獲得具有除草劑抗性的植物的方法和應用，并且提供了判斷植物是否采用本發明方法獲得的鑒定方法。
具體而言，在第一方面，本發明提供了 ALS突變蛋白質，其氨基酸序列如SEQ IDNO:2或4所示。該蛋白質能使植物(如玉米，尤其是京21)具有除草劑抗性。在本文中，ALS就是乙酰乳酸合成酶(acetolactate synthase)的簡稱,其酶分類編號為EC4, 1.3.18。乙酰乳酸合成酶是支鏈氨基酸合成中的一個關鍵酶，如在纈氨酸和亮氨酸的合成中催化丙酮酸生成乙酰乳酸和二氧化碳，在異亮氨酸的合成中催化丙酮酸與丁酮酸生成2-乙醛基-2-羥基丁酸。本發明第一方面的蛋白質是經過大量篩選從本發明人突變的玉米植株(如，京21)中發現的，能使相應植株具有除草劑抗性。目前，還沒有報道表明，在來自玉米的氨基酸序列如SEQ ID NO:2或4所示的突變蛋白，會使得相應植物(尤其是玉米)具有除草劑抗性，更無法預測在保持除草劑抗性的同時，還能保持正常的生長情況。在本文中，京21，又稱京21號，是由中國農業科學院作物科學研究所玉米研究中心開發的玉米自交品系，其具有株型緊湊、抗病性好、抗倒伏以及配合力強等性狀特點。本發明人發現該品系可以在高濃度咪草煙的種子浸泡實驗中被篩選出抗咪草煙突變植株。公眾可以通過商業渠道獲取京21，例如可以從中國農業科學院作物科學研究所玉米研究中心購買。除了本發明具體實施方式
所述的突變植株篩選和擴增方法之外，在蛋白質序列已知的情況下，本領域技術人員有能力通過改變已知蛋白質的編碼基因序列并將其導入表達載體，就可以制備出取代、添加或缺失了氨基酸殘基的蛋白質，這些方法記載于《分子克隆實驗指南》(北京:科學出版社，2002年)等文獻中。通過轉基因技術，編碼這些蛋白質的基因可以導入植物中，優選導入玉米中，例如導入(野生型)京21中，從而賦予植物抗除草劑性倉泛。目前，以抑制ALS為靶位的除草劑包括磺酰脲類、咪唑啉酮類、嘧啶并三唑類、水楊酸卩密唳類等除草劑(Peter Babczinski, Thomas Zelinsk1.Mode of action herbicidalALS—inhibitors on acetolactate synthase from green plant cell cultures, yeast,and Escherichia col1.Pesticide science, 1991，31:305-323;鄭培忠，沈健英.乙酸乳酸合成酶抑制劑的種類及其耐藥性研究進展.雜草科學，2009，2:4-8)。因此，在本文中，除草劑抗性指的是對包括磺酰脲類、咪唑啉酮類、嘧啶并三唑類、水楊酸嘧啶類在內的除草劑具有耐受性。優選在本發明中，除草劑是咪唑啉酮類除草劑，如在本發明的具體實施方式
中，除草劑是咪草煙(其化學名稱為(RS) 5-乙基-2- (4-異丙基-4-甲基-5-氧代-3-咪唑啉-2-基)煙酸，CAS號為81335-77-5)。即優選在本發明中，除草劑抗性是咪唑啉酮類除草劑抗性，更優選是咪草煙抗性。在第二方面，本發明提供了核酸，其編碼本發明第一方面的蛋白質。在本文中，核酸可以是DNA，也可以是RNA，優選是DNA。在知曉所編碼蛋白序列或核酸序列的前提下，通過常規的密碼子對應關系和宿主表達頻率，運用PCR方法、DNA重組法或人工合成的方法，本領域技術人員有能力獲得并優化編碼本發明第一方面的蛋白質的核酸。一旦獲得該核酸，就可以將其克隆入載體，再轉化或轉染入相應的細胞，然后通過常規的宿主細胞進行增殖，從中分離得到大量的核酸。優選本發明第二方面的核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO:1或3所示。在第三方面，本發明提供了表達盒(cassette)，其包含本發明第二方面的核酸。本發明第三方面的表達盒優選在5’ -3’ 的轉錄方向上包含啟動子區、本發明第二方面的核酸和轉錄和翻譯的終止區。本發明第三方面的表達盒優選適合在植物中表達本發明第二方面的核酸。示例性的啟動子包括來自CaMV35S啟動子或者稻肌動蛋白I基因、玉米醇脫氫酶基因、玉米矮縮I基因或煙草花葉病毒(TMV) Q元件的啟動子；示例性的轉錄和翻譯的終止區包括轉錄終止元件或多聚腺苷酸化信號等。本發明第三方面的表達盒還可以包括，在細菌中復制所需的復制起點(例如，來自PBR322或P15Aori的ORI區)，土壤桿菌T-DNA轉移所需要的元件(例如，T-DNA的左邊界和/或右邊界)，從而方便從細菌往植物中的轉化過程。另外，本發明第三方面表達盒還可以包含增強子、內含子、多克隆位點、操縱基因、阻遏物結合位點、轉錄因子結合位點等，例如來自TMV、玉米褪綠斑點病毒(MCMV)或苜蓿花葉病毒(AMV)的前導序列等作為增強子，又如可以包括來自Adhl、bronzel、肌動蛋白I或肌動蛋白2的內含子。在第四方面，本發明提供了載體，其包含本發明第二方面的核酸。在本文中，載體是指本領域中常用的細菌質粒、粘粒、噬菌粒、酵母質粒、植物細胞病毒、動物病毒及其它各種病毒載體。根據所應用的目的不同，載體可以分為克隆載體、表達載體和轉化載體，指的是所使用的目的分別針對克隆并驗證基因、表達相應基因和將相應基因轉化。本發明中可用的載體包括但不限于:在細菌中表達用的載體(原核表達載體)、在酵母中表達用的載體(如畢赤酵母載體)、在昆蟲細胞中表達的桿狀病毒載體、在哺乳動物細胞中表達用的載體(痘苗病毒載體、逆轉錄病毒載體、腺病毒載體、腺伴病毒載體等)、在植物中表達用的植物病毒載體以及在哺乳動物乳腺中表達用的各種載體。本發明第四方面的載體是轉化載體，尤其是植物轉化載體，特別是適合農桿菌轉化植物的載體。這些載體很多已經商品化了。在第五方面，本發明提供了細胞，其包含本發明第二方面的核酸。細胞可以是原核細胞，也可以是真核細胞，如，細菌細胞、酵母細胞、植物細胞、昆蟲細胞、哺乳動物細胞等。在本文中，植物細胞指的是來自植物的細胞(可以包括細胞群，但優選是單個細胞)，但是這些細胞不能僅僅借助光合作用而以水、二氧化碳和無機鹽等無機物合成碳水化合物、蛋白質來發育成存活的單個植株。植物細胞可以是必須使用有機物(如某些植物激素)才能發育的植物細胞或細胞群，也可以是完全無發育成植株能力的植物細胞或細胞群，通俗地說，即死亡的植物細胞或細胞群，如干燥粉碎過的市售小麥面等。本發明的第二方面的核酸可被插入轉化進細胞中的任何載體中。優選的細胞是細菌細胞，尤其是用于克隆或儲存核酸、或是用于轉化植物細胞的細菌細胞，例如農桿菌、大腸桿菌，包括根瘤土壤桿菌和毛根土壤桿菌等。另外優選的細胞是植物細胞，優選是玉米細胞，更優選是京21細胞，所述植物細胞中包含的本發明第二方面的核酸可以是通過轉基因技術導入植物細胞的，包括導入到植物細胞的核、葉綠體、線粒體和/或質體中，也可以是通過突變技術(如本發明具體實施方式
所述的技術)使得本發明第二方面的核酸存在于植物細胞中的。 在第六方面，本發明提供了植物，其包含本發明第二方面的核酸，和/或其表達本發明第一方面的蛋白質。由于引入了本發明第二方面的核酸和本發明第一方面的蛋白質，本發明第六方面的植物具有除草劑抗性。在本文中，植物指的是借助光合作用，以水、二氧化碳和無機鹽等無機物就能合成碳水化合物、蛋白質來維系生存的單個植株、植株群或其繁殖材料，包括植物、植物品種、植株、植物事件、植物后代、植物種子或其他植物的可繁殖部分。其中，植物后代本身就是植物，包括通過轉基因技術產生的植物后代、與其他植物品種雜交產生的植物后代、以及回交或自交產生的植物后代。本發明第六方面的植物可以是雙子葉植物，也可以是單子葉植物。示例性的植物包括小麥、水稻、玉米、黑麥、燕麥、大麥、大豆、馬鈴薯、油菜、甜菜、甘蔗、高粱、西紅柿、南瓜、辣椒、生菜、向日葵、咖啡、茶、棉花、苜蓿、煙草、或擬南芥等。在本發明的具體實施方式
中，優選本發明第六方面的植物是玉米，更優選是京21。當然，如在本發明的具體實施方式
中，擬南芥也是可選的植物品種。在第七方面，本發明提供了本發明前述各方面在獲得具有除草劑抗性的植物過程中的應用。在獲得具有除草劑抗性的植物過程中，可以應用到本發明前述各方面。本發明第七方面所提供的包括，本發明第一方面的蛋白質在獲得具有除草劑抗性的植物過程中的應用，本發明第二方面的核酸在獲得具有除草劑抗性的植物過程中的應用，本發明第三方面的表達盒在獲得具有除草劑抗性的植物過程中的應用，本發明第四方面的載體在獲得具有除草劑抗性的植物過程中的應用，本發明第五方面的細胞在獲得具有除草劑抗性的植物過程中的應用，本發明第六方面的植物在獲得具有除草劑抗性的植物過程中的應用。優選在本發明的第七方面中，除草劑是咪唑啉酮類除草劑，優選是咪草煙。在本發明的具體實施方式
中，優選本發明第七方面中獲得的具有除草劑抗性的植物是玉米，更優選是京21。當然，如在本發明的具體實施方式
中，擬南芥也是可選的植物品種。在本文中，獲得包括制備、培育、生產或以其他方式產生得到，包括通過轉基因育種方式獲得，如將本發明第二方面的核酸轉化入植物后使之表達本發明第一方面的蛋白質；也包括通過非轉基因育種方式獲得，如通過雜交、回交、自交或無性繁殖本發明第六方面的植物并分選出仍舊包含本發明第二 方面的核酸并表達本發明第一方面的蛋白質的植物。因此，本發明的第七方面提供的應用包括，在獲得具有除草劑抗性的轉基因植物過程中的應用和在獲得具有除草劑抗性的非轉基因植物過程中的應用。在第一個獨立的方面，本發明提供了(野生型)京21在獲得具有除草劑抗性的植物(如，玉米)中的應用，優選是在獲得包含本發明第二方面的核酸和/或表達本發明第一方面的蛋白質的具有除草劑抗性的玉米中的應用。京21本身具有優良的性狀，但是更重要的是，本發明人發現，對它的種子用除草劑(如，咪唑啉酮類除草劑，優選是咪草煙)進行誘變，能夠獲得具有除草劑抗性的玉米。在第八方面，本發明提供了獲得具有除草劑抗性的植物的方法，其包括如下步驟:(I)使植物包含本發明第二方面的核酸；和/或，(2)使植物表達本發明第一方面的蛋白質。優選在本發明第八方面的方法中，植物是玉米，更優選是京21。當然，如在本發明的具體實施方式
中，擬南芥也是可選的植物品種。可以采用前述或者本領域技術人員能獲知的轉基因和非轉基因方法，使植物包含本發明第二方面的核酸，或者使植物表達本發明第一方面的蛋白質。實施本發明第八方面的方法，能夠獲得本發明第六方面的植物。優選在本發明的第八方面中，可以采用的步驟包括轉基因、雜交、回交、自交或無性繁殖步驟。這些步驟本身對于轉基因或非轉基因育種領域的技術人員來說，都是可以獲知并實施的。在第九方面，本發明提供了鑒定本發明第六方面的植物或者本發明第八方面的方法獲得的植物的方法，其包括如下步驟:(I)測定所述植物是否包含本發明第二方面的核酸；和/或，(2)測定所述植物是否表達本發明第一方面的蛋白質。通過該方法，可以判斷植物是否屬于本發明的植物，即是否屬于本發明第六方面的植物，或者是否屬于本發明第八方面的方法獲得的植物。測定的步驟可以通過常規的核酸檢測和/或蛋白質檢測方法來進行，只需要能夠檢測出蛋白質或其編碼核酸帶有如SEQID NO:2或4所示的突變蛋白或其相應核酸突變的方法都納入本發明。示例性的方法包括蛋白質測序、核酸測序、聚合酶鏈式反應(PCR)檢測、探針雜交檢測等。本發明取得的有益效果在于獲得可替代現有技術的使植物具有除草劑抗性的蛋白質、核酸、表達盒、載體、細胞、植物、獲得具有除草劑抗性的植物的應用和方法、以及鑒定本發明的植物的方法，并且可以通過轉基因或非轉基因方法獲得具有除草劑抗性的植物品種，尤其是能繼承京21號優良特性的玉米品種。
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本發明引用了公開文獻，這些文獻是為了更清楚地描述本發明，它們的全文內容均納入本文進行參考，就好像它們的全文已經在本文中重復敘述過一樣。為了便于理解，以下將通過具體的附圖和實施例對本發明進行詳細地描述。需要特別指出的是，這些描述僅僅是示例性的描述，并不構成對本發明范圍的限制。依據本說明書的論述，本發明的許多變化、改變對所屬領域技術人員來說都是顯而易見的了。


圖1顯示了抗咪唑啉酮類除草劑的玉米突變植株。
具體實施例方式下述實施例中所用方法如無特別說明，均為常用分子生物學、組織培養技術和農學手冊所記載的方法。例如，具體步驟可參見:《Molecular Cloning:A LaboratoryManual(3rdedition)》(Sambrook, J., Russell, David ff.,2001, Cold Spring Harbor),《Plant Propagation by Tissue Culture》(EdwinF.George, Michael A.Hall, Geert-JanDe Klerk, 2008, Springer)。實施例1從京21號突變植株中提取抗咪唑啉酮類除草劑的蛋白突變體播種各品種/品系玉米，其中包括將玉米自交系京21 (可購自中國農業科學院作物科學研究所玉米研究中心)播種，播種前，將各種玉米種子用咪唑啉酮類除草劑咪草煙((RS) 5-乙基-2-(4-異丙基-4-甲基-5-氧代-3-咪唑啉-2-基)煙酸，CAS號81335-77-5)水劑(濃度為0.5%，購自山東先達化工有限公司)浸泡18小時，浙干水分后播種于試驗田，10天后觀察玉米種子萌發情況。經過大量實驗篩選，終于偶然發現，其中有綠色秧苗持續生長(圖1 )，保留并繁殖這些綠色秧苗，確認其為抗咪唑啉酮類除草劑的京21號突變植株2株，這些植株能夠正常生長發育，其余玉米均死亡。分別取各京21號突變植株的葉片，連同野生型的京21號植株葉片，分別提取它們的基因組DNA，委托北京三博遠志生物技術有限公司進行測序并進行序列比較，發現:突變植株I相對于野生型京21號，在乙酰乳酸合成酶(ALS)基因的第518位點發生突變，由C變為T，導致相應編碼蛋白的第173位由丙氨酸變為纈氨酸，即該突變植株的ALS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其編碼的ALS蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；突變植株2相對于野生型京21號，在ALS基因的第1626位點發生突變，由G變為T，導致相應編碼蛋白的第542位由色氨酸變為半胱氨酸，即該突變植株的ALS基因的核苷酸序列如SEQ IDNO:3所示，其編碼的ALS蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。實施例2蛋白突變體的抗咪唑啉酮類除草劑的離體活性測定參照Fan ZJ 等的方法(Specific activity determination of acetolactatesynthase from maize (Zea mays L.).參見 Han WN 等編 The Proceedings of thel8thAsia-Pacific Weed Science Society Conference.515-522.May28-June2,2001.Beijing:Standards Press of China.),提取上述京21號的野生型和各突變植株的ALS酶,并測定相應酶活性被咪唑啉酮類除草劑抑制的比率。過程簡而言之，分別取各植株苗5g切碎后，加入 IOmL pH7 的 50mmoI/LK2HPO4-KH2PO4 緩沖液(其中含 lmmol/L 丙酮酸鈉，0.5mmol/L MgCl2,0.5mmol/L TPP, 10 u mol/L FAD),用石英砂研磨粉碎后用8層紗布過濾,濾液于4°C、20000rpm離心30分鐘。取上清液，加入硫酸銨使之達到50%飽和度，然后0°C放置2小時后，于4°C、20000rpm離心30分鐘。棄上清液，將沉淀溶解于5mL pH7的50mmol/LK2HPO4-KH2PO4緩沖液(其中含20mmol/L丙酮酸鈉，0.5mmol/L MgCl2),分別得各植株的ALS酶液。將0.1mL0.5%咪草煙水劑(對照用水替代)、0.5mL酶反應液(其中含24mmol/L丙酮酸鈉，0.6mmol/LMgCl2，lmmol/L TPP, 20 u mol/L FAD,50mmol/L K2HPO4-KH2PO4, pH7)和 0.4mLALS酶液混合，與35°C避光靜置反應I小時，然后加入0.lmL3mol/L硫酸終止反應，于60°C放置15分鐘脫羧。然后加入顯色劑(0.5ml0.5% (w/w)肌酸和0.5ml5% (w/w) a -萘酹的混合溶液(溶于2.5mol/L的NaOH溶液))于60°C放置15分鐘顯色，測定525nm處的吸光度。將加入對照的野生型京21號的ALS酶活性分別記為100%，計算咪唑啉酮類除草劑對京21號的野生型和各突變ALS酶的活性的影響。結果如下表所示，京21號的各突變ALS酶都基本保持了野生型ALS酶的活性，而且在存在咪唑啉酮類除草劑的情況下，野生型ALS酶的活性都有十分顯著的下降，而各突變ALS酶卻都保持了原有酶活性，表明突變ALS酶能夠帶來抗咪唑啉酮類除草劑的性能。咪唑啉酮類除草劑對京21號的野生型和突變ALS酶活性的影響表
權利要求
1.ALS突變蛋白質，其氨基酸序列如SEQ IDNO:2或4所示。
2.權利要求1所述的蛋白質，其中除草劑是咪唑啉酮類除草劑，優選是咪草煙。
3.權利要求1或2所述的蛋白質，其來自玉米，尤其是京21。
4.核酸，其編碼權利要求f3之任一所述的蛋白質，優選其核苷酸序列如SEQ ID NO:I或3所示。
5.表達盒、載體或細胞，其包含權利要求4所述的核酸。
6.權利要求f3之任一所述的蛋白質、權利要求4所述的核酸、權利要求5所述的表達盒、載體或細胞、包含權利要求4所述的核酸的植物、表達權利要求f 3之任一所述的蛋白質的植物、或者京21在獲得具有除草劑抗性的植物中的應用，優選其中除草劑是咪唑啉酮類除草劑，優選是咪草煙。
7.獲得具有除草劑抗性的植物的方法，其包括如下步驟: (1)使植物包含權利要求4所述的核酸；或， (2)使植物表達權利要求f3之任一所述的蛋白質。
8.權利要求7所述的方法，其包括轉基因、雜交、回交、自交或無性繁殖步驟。
9.權利要求6或7所述的應用或方法，其中所述植物是玉米。
10.鑒定植物的方法，其中植物是包含權利要求4所述的核酸的玉米、表達權利要求廣3之任一所述的蛋白質的玉米、或者權利要求7、8或9所述的方法獲得的植物(如，玉米)，其包括如下步驟: (1)測定所述植物是否包含權利要求4所述的核酸；或， (2)測定所述植物是否表達權利要求f3之任一所述的蛋白質。
全文摘要
本發明提供了使植物具有除草劑抗性的ALS蛋白質，其氨基酸序列如SEQ ID NO2或4所示。另外，本發明還提供了相應的核酸、表達盒、載體、細胞、植物、獲得具有除草劑抗性的植物的應用和方法、以及鑒定本發明的植物的方法。
文檔編號A01H1/02GK103103176SQ20131004238
公開日2013年5月15日 申請日期2013年2月1日 優先權日2012年11月22日
發明者黃拔嚴, 石久英 申請人:北京興博雅生物技術有限公司