轉maroACC基因抗除草劑玉米CC-2的側翼序列及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術領域，設及一種用于轉maroACC基因抗除草劑玉米CC-2的側 翼序列及其應用。
【背景技術】
[0002] 玉米是全球種植范圍最廣、產量最大的谷類作物，居Ξ大糧食（玉米、小麥、水稻） 之首。我國是玉米生產和消費大國，播種面積、總產量、消費量僅次于美國，均居世界第二 位。近年來，雖然我國玉米發展勢頭良好，但仍需大量進口，且進口量逐年快速遞增。隨著 工業化、城鎮化快速發展和人民生活水平不斷提高，我國已進入玉米消費快速增長階段。從 未來發展看，玉米將是我國需求增長最快、也將是增產潛力最大的糧食作物。抓好玉米生 產，就抓住了糧食持續穩定發展的關鍵。挖掘生產潛力、降低生產成本、保持玉米能夠基本 自給，是確保國家糧食安全的關鍵。
[0003] 在我國玉米種植分布極為廣泛，而雜草種類及危害也十分復雜，有調查表明：不 論是人工除草地塊還是出苗前封閉除草地塊，100%的田塊都有雜草危害，危害嚴重的雜草 有禾本科、蘋科、大戟科、寥科和鴨趾草科雜草。農田雜草給玉米生產帶來極大的困擾及危 害。由于雜草比農作物具有更粗壯的根系；生長能力很強，繁殖快，密度大，數量多，與作物 爭光、爭肥、爭水，因此，嚴重影響作物的產量和質量；許多雜草是農作物病蟲害的中間寄 主，病菌，害蟲因為雜草的存在而繁殖、傳播。如碑草、狗尾草、蘆韋是稻飛風、稻攝病、水稻 紋枯病的寄主。據保守估計，我國每年玉米草害面積達667萬公頃，嚴重危害的占20%，每 年玉米因雜草危害而減產的損失率達10%W上。同時。雜草還帶來了其它方面的危害，如 妨礙農事操作，影響人畜健康狀況，造成灌概麻煩，增加生產費用和勞動力等。人工働草是 一種原始而有效的方法，但是效率低且辛苦繁重。在世界上許多地區，特別是發展中國家， 防治雜草是農業生產中用工量最多的工作。為了除草，要進行大量的耕、翻、祀、働、粉等作 業，結果加大±壤通透性，使腐殖質減少，并導致±壤沖刷與水±流失。轉aroA、igrA、Ba;r、 Gat等抗除草劑基因玉米不但能有效的防治雜草，而且對環境、有益昆蟲及人畜等均無不良 影響。
[0004] 近年來，生物技術的迅速發展大大地推動了植物育種研究手段的革新與研究水平 的不斷提高，植物抗除草劑生物技術育種已開始進入實用化階段。利用生物技術手段將外 源抗除草劑基因導入植物基因組內，打破了植物種屬甚至物種之間難W雜交的天然屏障， 實現了抗除草劑基因的轉移，從而使植物迅速地、定向地獲得抗除草劑特性，同時又能保留 原有的良好農藝性狀。由于草甘麟的廣譜滅生性，因此使用草甘麟除草較人工除草防治效 果要好且穩定，還能夠節省人力和物力，有效的節約社會資源。因此，培育和推廣抗草甘麟 玉米品種在我國有著廣闊的應用前景，將為玉米生產和農民增收提供保障。 陽0化]轉maroACC基因抗除草劑玉米CC-2是中國農業大學將CP4EPSPS基因按照玉米密 碼子特征進行優化，獲得了適合在玉米中高表達的EPSPS基因，優化的基因擁有自主知識 產權狂L201210406176.8)，同時克隆了高梁EPSPS基因的葉綠體信號膚（趙海銘等，《農業 生物技術學報》，2013, 21 (9) : 1009-1018)，將其與優化的EPSPS基因連接，命名為maroACC。 通過基因槍共轉化的方法把maroACC基因轉入到具有高轉化效率的玉米自交系ΗΠΙΑ和 ΗΠΙΒ的雜交組合中，用草甘麟進行篩選，獲得了 500余個maroACC蛋白陽性的轉化體，通 過拷貝數檢測及表達量篩選獲得的一個優良轉化體。在栽培地環境中，轉基因玉米CC-2與 其對應的非轉基因玉米在生育期、株高、產量等方面均一致，可正常生長；在荒地環境中，轉 基因玉米CC-2及其對應的非轉基因玉米與雜草相比不具競爭優勢，無雜草化風險（宋新元 等.轉基因抗除草劑玉米CC-2生存競爭能力研究.作物雜志，2014年06期）。
[0006] 如今轉基因成分檢測受到越來越廣泛的關注，根據轉基因插入片段的旁側序列設 計轉化體特異的檢測引物是最為有效的檢測方法。目前已經有部分專利和文獻報道了轉基 因植物外源插入載體旁側序列，例如：彭于發等人于2007年利用基因步移和LD-PCR方法分 析了水稻品系科豐6號的外源插入片段的旁側序列，建立了轉基因水稻科豐6號的品系特 異性檢測方法。然而，在對現有的專利和文獻的分析中發現，還沒有任何關于轉maroACC基 因抗除草劑玉米CC-2的外源插入片段的旁側序列的文章和專利報道。
【發明內容】
[0007] 本發明的一個目的是提供一種用于檢測或輔助檢測待測玉米是否為轉maroACC 基因抗除草劑玉米CC-2的引物對或引物對組。
[000引本發明所提供的引物對具體為引物對1或引物對2。
[0009] 本發明所提供引物對組具體由所述引物對1和所述引物對2組成。
[0010] 所述引物對1中的上游引物根據序列表中序列5的第1-500位設計獲得，下游引 物根據序列表中序列5的第501-1000位設計獲得，序列5中l-500bp為插入序列5'端側 翼的玉米基因組序列，501-1000bp為插入序列的組成部分；所述引物對2中的上游引物根 據序列表中序列6的第1-500位設計獲得，下游引物根據序列表中序列6的第501-1000位 設計獲得，序列6中l-500bp為插入序列的組成部分，501-1000bp為插入序列3'端側翼的 玉米基因組序列。 W11] 更加具體的，所述引物對1為如下（1)-做所示引物對中的任一種；所述引物對2 為如下（4)-(6)所示引物對中的任一種： 陽01引（1)由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對； 陽01引似由序列表中序列8和序列9所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對；
[0014] (3)由序列表中序列10和序列11所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對；
[0015] (4)由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對；
[0016] (5)由序列表中序列12和序列13所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對；
[0017] (6)由序列表中序列14和序列15所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對。
[0018] 在本發明中，所述引物對中兩個單鏈DNA分子既可W單獨包裝，也可W等摩爾混 合包裝。所述引物對組中每個引物對的兩個單鏈DNA分子既可W單獨包裝，也可W等摩爾 混合包裝。
[0019] 所述引物對或所述引物對組在制備用于檢測或輔助檢測待測玉米是否為轉 maroACC基因抗除草劑玉米CC-2的試劑盒中的應用也屬于本發明的保護范圍。
[0020] 本發明的另一個目的是提供一種用于檢測或輔助檢測待測玉米是否為轉maroACC 基因抗除草劑玉米CC-2的試劑盒。
[0021] 本發明所提供的試劑盒，具體包含有所述引物對或所述引物對組。
[0022] 所述試劑盒中還可含有PCR反應所需的常規試劑，如DNA聚合酶、dNTP等。
[0023] 所述試劑盒的制備方法也屬于本發明的保護范圍。
[0024] 所述試劑盒的制備方法，可為如下（al)或（曰2):
[00巧](al)包括如下步驟：將所述引物對中的兩條單鏈DNA分子分別單獨包裝；
[00%] (a2)包括如下步驟：將所述引物對組中每個引物對的兩條單鏈DNA分子分別單獨 包裝。
[0027] 所述引物對或所述引物對組，或所述試劑盒，在檢測或輔助檢測待測玉米是否為 轉maroACC基因抗除草劑玉米CC-2中的應用也屬于本發明的保護范圍。
[002引本發明的再一個目的是提供一種檢測或輔助檢測待測玉米是否為轉maroACC基 因抗除草劑玉米CC-2的方法。
[0029] 本發明所提供的檢測或輔助檢測待測玉米是否為轉maroACC基因抗除草劑玉米 CC-2的方法，可為如下（A)或度）：
[0030] (A)包括如下步驟：
[00川 （al)W所述待測玉米的基因組DNA為模板，采用所述引物對1進行PCR擴增，獲得 PCR產物；
[0032] (a2)根據所述PCR產物的大小，按照如下方法確定所述待測玉米是否為轉 maroACC基因抗除草劑玉米CC-2 :若所述PCR產物中含有預期大小的DNA片段，則所述待測 玉米為或候選為轉maroACC基因抗除草劑玉米CC-2 ;若所述PCR產物中不含有預期大小的 DNA片段，則所述待測玉米不為或候選不為轉maroACC基因抗除草劑玉米CC-2 ;
[003引所述預期大小的DNA片段如下：若所述引物對1為由序列表中序列1和序列2所 示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對，則所述預期大小的DNA片段為292bp的DNA片段；若 所述引物對1為由序列表中序列8和序列9所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對；則所 述預期大小的DNA片段為25化P的DNA片段；若所述引物對1為由序列表中序列10和序列 11所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對，則所述預期大小的DNA片段為32化P的DNA片 段；
[0034] 度）包括如下步驟：
[0035] 化1)W所述待測玉米的基因組DNA為模板，采用所述引物對2進行PCR擴增，獲得 PCR產物；
[0036] 化2)根