專利名稱：一種基于莖節增殖的金錢松快速繁殖方法
技術領域：
本發明涉及一種植物繁殖技術，即一種基于莖節增殖的金錢松快速繁殖方法。
背景技術：
在現有技術中，金錢松amabilis (Nelson) Rehd.為松科金錢松屬落葉喬木。金錢松是我國珍貴的特產樹種，與南洋杉、雪松、金松和北美紅杉合稱為世界五大公園樹種，也是全世界唯一的一種。本種分布于江蘇南部、安徽南部、浙江西部、江西北部、福建北部、四川東部、湖南和湖北等地。多生長于低海拔山區或丘陵地帶，適宜溫涼濕潤氣候。金錢松是著名的古老殘遺植物，被《中國珍稀瀕危保護植物名錄(第一冊)》定為稀有種，國家二級重點保護植物。被《國家重點保護野生植物名錄(第一批)》定為國家二級重點保護植物。最早的化石發現于西伯利亞東部與西部的晚白堊世地層中，古新世至上新世在斯匹次卑爾根群島、歐洲、亞洲中部、美國西部、中國東北部及日本亦有發現。由于氣候的變遷，尤其是更新世的大冰期的來臨，使各地的金錢松滅絕。只在我國長江中下游少數地區幸存下來，繁衍至今。因分布零星，個體稀少，結實有明顯的間歇性，種子萌發率極低。金錢松木材可供建筑、橋梁、船舶和家具等用；種子可榨油；根皮藥用，含二萜類、二萜葡萄糖甙、酚類、鞣質及色素等重要化學成分，具有抗菌消炎、止血等功效，可治頑癬、食積和抑制肝癌細胞活性等癥；林業部門已把金錢松列為分布區中山、丘陵的重要造林及園林綠化樹種，許多城市和植物園已引種栽培。金錢松通常以種子或插條扦插繁殖為主，但其種子萌發極低；插條扦插繁殖不僅生根率和移栽成活率極低，而且導致野生資源受到滅絕性威脅。因此，大規模人工栽培、開發和利用受到極大限制。
發明內容
本發明的目的是針對上述不足而提供一種在試管內誘導莖段生根同時腋芽萌發生長，以達到莖節增殖的一步快繁目標，解決了種子繁殖困難和扦插繁殖生根率和移栽成活率低及野生資源受滅絕性威脅等問題的基于莖節增殖的金錢松快速繁殖方法。本發明的技術解決方案是:一種基于莖節增殖的金錢松快速繁殖方法，其步驟如下:
(1)取金錢松苗主干上的新發嫩莖處理后莖段作為外植體備用；
(2)接種到基本培養基+吲哚乙酸0.02 0.04 mg.Γ1 +萘乙酸0.03 0.06mg.I71 + 6-節氨基嘌呤0.10 0.12 mg.I71 +赤霉素2.70 2.80 mg.I71中進行金錢松莖段生根同時腋芽萌發生長培養；基本培養基成分和含量為:110.0 mg.Γ1 (NH4)2SO4,660.0 mg.L-1KNO3, 38.0 mg.L-1CaCl2.2H20,42.0 mg.L-1MgSO4.7H20,85.0 mg.L-1KH2PO4 ；2.7 mg.L-1MnSO4.4H20, 2.4 mg.L-1ZnSO4.7H20, 0.35 mg.IZ1KI，1.2 mg.[1H3BO3 ；4.6mg.L 1FeSO4.7H20,6.3 mg.L 1Na2.EDTA.2H20 ；0.8 mg.L 1 鹽酸硫胺素(VB1)，0.3 mg.L 1煙酸,0.3 mg.L—1鹽酸批卩多醇(VB6)，1.50 mg.L—1甘氨酸，15.0 g.L—1肌醇。優選基本培養基+吲哚乙酸0.04 mg.L—1 +萘乙酸0.03 mg.L—1 + 6-芐氨基嘌呤0.12 mg.L—1 +赤霉素 2.80 mg.L I。(3)金錢松植株的快速繁殖、煉苗和移栽。步驟(I)中的處理是指摘去針葉及短小葉柄，用70%乙醇涮洗60 S，移至飽和次氯酸鈉溶液中浸泡10 min，無菌水沖洗8次，無菌濾紙吸干表面水分，去除被乙醇和次氯酸鈉毒傷的組織后切割成1.0 cm的莖段。步驟(3)中的快速繁殖是指按每瓶接種10個莖段，35天為I個周期，每個莖段在I個培養周期內平均可切割成4 5段，每年有多個周期進行擴繁，滿足金錢松工廠化育苗和規模化栽培的需要。步驟(3)中的煉苗和移栽是指當種苗擴繁到一定數量后，選取2.00 cm以上的小植株進行煉苗移栽，小植株成活率可達到93.8%以上。本發明的優點是:1、本發明利用植物組織培養技術，采用金錢松野生實生苗主干上的嫩莖尖為材料，在試管內誘導莖段生根同時腋芽萌發生長，以達到莖節增殖的一步快繁目標，解決了種子繁殖困難和扦插繁殖生根率和移栽成活率低及野生資源受滅絕性威脅等問題。2、本發明為進一步人工規模化繁殖和栽培金錢松提供優質種苗。3、成苗率達
96.6% ;金錢松小植株的煉苗和移栽成活率可達到93.8%以上。下面將結合實施例對本發明的實施方式作進一步詳細描述。
具體實施例方式一種基于莖節增殖的金錢松快速繁殖方法:
I材料與方法
1.1材料及處理
5月上旬，取金錢松2年生苗主干上的新發嫩莖(2.5 3.5 cm)，摘去針葉及短小葉柄，用70%乙醇(體積分數)涮洗60 s,移至飽和次氯酸鈉溶液中浸泡10 min,無菌水沖洗8次，無菌濾紙吸干表面水分，去除被乙醇和次氯酸鈉毒傷的組織后切割成1.0 cm的莖段作為外植體備用。1.2金錢松莖段生根同時腋芽萌發生長、植株快速和煉苗栽培
基本培養基成分和含量:110.0 mg.T1(NH4)2SO4^e0.0 mg.L-1KNO3, 38.0mg.L-1CaCl2.2Η20，42.0 mg.L-1MgSO4.7Η20，85.0 mg.L-1KH2PO4 ；2.7 mg.L-1MnSO4.4Η20,2.4 mg.L-1ZnSO4.7Η20, 0.35 mg.IZ1KI，1.2 mg.[1H3BO3 ；4.6 mg.L-1FeSO4.7H20, 6.3mg.L-1Na2.EDTA.2Η20 ；0.8 mg *L_1 鹽酸硫胺素(VB1), 0.3 mg *L_1 煙酸,0.3 mg *L_1 鹽酸批哆醇(VB6)，1.50 mg七1甘氨酸，15.0 g.L-1肌醇;基本培養基中附加吲哚乙酸IAA (0.07 0.12 mg *L O、蔡乙酸NAA (0.04 0.09 mg *L O、6_節氛基嘿呤6_ΒΑ(0.02 0.07 mg *L和赤霉素GA3 (1.50 2.60 mg.L—1)，瓊脂條8.5 g. Λ添加食用白糖10.0 g.L—1，調節pH值至5.7，嫩莖段在光照周期7 hM'光照強度800 Ix和溫度(24±2) °C條件下培養。為提高金錢松嫩莖段生根和腋芽 萌發生長的速度及生根率，通過均勻設計法設計實驗，選用U12(124)均勻表，每個處理接種10個嫩莖段，重復3次，篩選確定影響金錢松莖段生根同時腋芽萌發生長的吲哚乙酸、萘乙酸、6-芐氨基嘌呤和赤霉素最佳濃度配比。莖段培養35d統計生根率和長度，以均出現莖段生根和腋芽萌發生長的苗為準。生根率=(生根的莖段數/接種的莖段總數)X100%,生長率=(苗總長度-1.0)/1.0X 100%。莖段生根后腋芽萌發生長至2.50 cm時，在無菌條件下打開培養瓶，將植株留0.50剪下苗干，并將苗干切割成0.5 Cm的莖段，再次將小莖段轉接到莖段生根同時腋芽萌發生長培養基中，計算出每個莖段生根同時腋芽萌發生長的增殖倍數和周期。當種苗擴繁到需要數量后，且小植株長至2.00 cm時，將小植株從培養瓶中取出，放在殺毒礬溶液(濃度為5 mg.L-1)中洗凈根上的瓊脂，將小植株栽植到經殺毒礬(200倍液)消毒過的腐熟草炭土、腐爛松針和珍珠巖(3: 2:1)的基質中，覆蓋塑料薄膜(透性好)進行保溫保濕，溫度控制在(20±2) °C，保持相對濕度在70%，自然光照10 h.(Γ1，溫度升高時，適當通風換氣。2結果與分析
2.1吲哚乙酸、萘乙酸、6-芐氨基嘌呤和赤霉素對金錢松莖段生根的影響數據(表I)經均勻設計軟件分析處理后可得回歸方程為7=109 - 302X, - 35LT2 +416為，顯著性水平σ = 0.05，復相關系數TP= 0.9894，剩余標準差S= 1.6800，檢驗值6 =123.4 >臨界值/Vow， =4.066，回歸方程具有顯著性，吲哚乙酸、萘乙酸和6-芐氨基嘌呤對莖段的生根影響具有顯著性，赤霉素對莖段的生根影響不顯著。通過計算吲哚乙酸、萘乙酸和6-芐氨基嘌呤對生根的貢獻值和貢獻率可知，M = 253,/i/= 24.2% 'U2 = Ml,UJU=32.6% -,U,=亂_ = 57.8%，說明3個因素對金錢松莖段生根的貢獻順序為:6_芐氨基嘌呤 > 萘乙酸〉吲哚乙酸，因6-芐氨基嘌呤與生根率呈正相關，而吲哚乙酸和萘乙酸與生根率呈負相關。由此推測，6-芐氨基嘌呤質量濃度高于0.07 mg -Γ1,吲哚乙酸和萘乙酸質量濃度分別低于0.07 mg.Γ1和0.04 mg.Γ1可能有更高的生根率。為驗證此推測，又以 6-芐氨基嘌呤為 0.07,0.08,0.09,0.10,0.11,0.12,0.13,0.14 和 0.15 mg. Λ 吲哚乙酸質量濃度為0.07,0.06,0.05,0.04,0.03,0.02和0.01 mg.Ι^，萘乙酸質量濃度為0.04、0.03,0.02和0.01 mg.L—1開展9個水平的補充試驗，重復3次。結果發現，吲哚乙酸質量濃度為(0.02 0.05 mg.L—1)、萘乙酸質量濃度為(0.03 0.06 mg.L—1)和6-芐氨基嘌呤質量濃度為(0.09 0.12 mg.Γ1)時，金錢松嫩莖段生根率最高，平均生根率達99.7%以上。均高于表I所列12個 處理的生根率。表I影響金錢松嫩莖段生根和腋芽生長因素的U12(124)試驗設計與結果
權利要求
1.一種基于莖節增殖的金錢松快速繁殖方法，其特征在于步驟如下: (I)取金錢松苗主干上的新發嫩莖處理后莖段作為外植體備用；(2)接種到基本培養基+吲哚乙酸0.02 0.04 mg.Γ1 +萘乙酸0.03 0.06 mg.Γ1 + 6-芐氨基嘌呤0.10 0.12 mg.Γ1 +赤霉素2.70 2.80 mg.Γ1中進行金錢松莖段生根同時腋芽萌發生長培養；基本培養基成分和含量為:110.0 mg.Γ1 (NH4)2SO4,660.0 mg.T1KNO3, 38.0mg.L-1CaCl2.2Η20，42.0 mg.L-1MgSO4.7Η20，85.0 mg.L-1KH2PO4 ；2.7 mg.L-1MnSO4.4Η20,2.4 mg.L-1ZnSO4.7Η20, 0.35 mg.IZ1KI，1.2 mg.[1H3BO3 ；4.6 mg.L-1FeSO4.7H20, 6.3mg.L-1Na2.EDTA.2H20 ；0.8 mg.L-1 鹽酸硫胺素(VB1), 0.3 mg.L-1 煙酸,0.3 mg.L-1 鹽酸批卩多醇(VB6), 1.50 mg.L—1甘氨酸，15.0 g.L—1肌醇； (3)金錢松植株的快速繁殖、煉苗和移栽。
2.按照權利要求1所述的一種基于莖節增殖的金錢松快速繁殖方法，其特征在于步驟(1)中的處理是指摘去針葉及短小葉柄，用70%乙醇涮洗60S，移至飽和次氯酸鈉溶液中浸泡10 min，無菌水沖洗8次，無菌濾紙吸干表面水分，去除被乙醇和次氯酸鈉毒傷的組織后切割成1.0 cm的莖段。
3.按照權利要求1所述的一種基于莖節增殖的金錢松快速繁殖方法，其特征在于步驟(3)中的快速繁殖是指按每瓶接種10個莖段，35天為I個周期，每個莖段在I個培養周期內平均可切割成4 5段，每年有多個周期進行擴繁，滿足金錢松工廠化育苗和規模化栽培的需要。
4.按照權利要求1所述的一種基于莖節增殖的金錢松快速繁殖方法，其特征在于步驟(3)中的煉苗和移栽是指當 種苗擴繁到一定數量后，選取2.00 cm以上的小植株進行煉苗移栽，小植株成活率可達到93.8%以上。
5.按照權利要求1所述的一種基于莖節增殖的金錢松快速繁殖方法，其特征在于步驟(2)中基本培養基+吲哚乙酸0.04 mg.Γ1 +萘乙酸0.03 mg.Γ1 + 6-芐氨基嘌呤0.12mg.L-1 + 赤霉素 2.80 mg.I71。
全文摘要
本發明涉及一種植物繁殖技術，即一種基于莖節增殖的金錢松快速繁殖方法。其步驟如下(1)取金錢松苗主干上的新發嫩莖莖段作為外植體；(2)接種到基本培養基＋吲哚乙酸0.02～0.04mg·L-1＋萘乙酸0.03～0.06mg·L-1＋6-芐氨基嘌呤0.10～0.12mg·L-1＋赤霉素2.70～2.80mg·L-1中進行金錢松莖段生根同時腋芽萌發生長培養；(3)金錢松植株的快速繁殖、煉苗和移栽。采用金錢松野生實生苗主干上的嫩莖尖為材料，在試管內誘導莖段生根同時腋芽萌發生長，以達到莖節增殖的一步快繁目標，為人工規模化繁殖和栽培金錢松提供優質種苗。成苗率達96.6%；成活率可達到93.8%以上。
文檔編號A01H4/00GK103109747SQ20131007445
公開日2013年5月22日 申請日期2013年3月10日 優先權日2013年3月10日
發明者朱俊義, 顧地周, 顧川岳, 姜云天, 楊麗娟, 梁宇 申請人:通化師范學院