專利名稱：一種葡萄試管內集成脫毒方法
技術領域：
本發明涉及一種葡萄試管內集成脫毒方法，屬于植物繁殖技術。
背景技術：
在現有技術中，葡萄(Kz'iis vinifera )為葡萄科葡萄屬落葉藤本植物,是當今世界上人們喜食的第二大果品，在全世界的果品生產中，葡萄的產量及栽培面積一直居于首位。葡萄具有解除疲勞、抗毒殺菌、改善過敏癥狀、抗貧血、調養腸胃、利膽、利尿消腫、安胎、美容養顏、補益和興奮大腦神經等功效。葡萄不僅在食用和藥用方面價值高，而且在釀酒行業中具有極大的經濟和社會效益。由于栽培種葡萄苗都是通過無性繁殖獲得，葡萄中的病毒會隨同無性繁殖材料傳播擴散，因此無性繁殖數量越大，病毒傳播速度也越快。經過幾年的栽培后，由于受病毒的影響，導致葡萄光合作用急劇下降，造成葡萄大幅度減產和葡萄果實質量降低，發病嚴重時可導致絕收。經調查發·現，葡萄病毒病有幾十種之多，其中葡萄扇葉病毒(GrapevineFanLeaf Virus,簡稱 GFLV)和葡萄卷葉病毒(Grapevine Leafroll Associated Virus,簡稱GLRaV)導致的葡萄病毒病在栽培種葡萄和野葡萄發病率較高且具有普遍性。目前，葡萄脫毒大多采用單一的莖尖組培脫毒、單一的熱處理、單一微米型嫁接和分生組織培養等方法進行脫毒，盡管脫毒效果較好，但莖尖、微米型嫁接和分生組織培養脫毒需要材料微小，需在顯微鏡下完成部分工作；而熱處理因葡萄植株在高溫條件下，濕度和光照等不易控制會導致葡萄植株生長異常，活力下降且不適合大量生產，以上脫毒方法存在步驟繁瑣、脫毒效果差、可操作性難等缺點。
發明內容
本發明的目的是針對上述不足而提供一種方法簡單、操作方便、效果好的的葡萄試管內集成脫毒方法。本發明的技術解決方案是:一種葡萄試管內集成脫毒方法，其步驟如下:
(I)將葡萄休眠枝條水培促使休眠芽萌發生長，處理后的莖尖作為外植體備。(2)將切取的葡萄莖尖接種至附加吲哚丁酸0.08 0.13 mg噸―1和赤霉素2.20
3.30 mg.Ι^，添加食用白糖5 g.!/1，瓊脂條8.0 g.L—1的基本培養基中進行脫除葡萄扇葉病毒和卷葉病毒培養；所述的基本培養基成份及使用用量為:183 mg.IZ1NH4NO3,100mg.L-1CaCl2.2H20，87 mg.L-1MgSO4.7H20，436 mg.L-1KH2PO4 ；9.2mg.L-1FeSO4.7H20,12.5mg.L-1Na2.EDTA.2H20 ；3.4 mg.L-1MnSO4.4H20,1.7 mg.L-1ZnSO4.7H20, 2.2 mg.L-1H3BO3,
0.025 mg.L 1CuSO4.5H20,0.15 mg.L 1KI ；0.5 mg.L 1 煙酸，5.8 mg.L 1 鹽酸批口多醇 VB6,37 mg.L-1肌醇。優選卩引哚丁酸0.08 mg.L-1和赤霉素2.20 mg.I71。(3)培養溫度控制在45 48 °C，培養51 57 d后，實現葡萄扇葉病毒和卷葉病毒脫除。(4)當莖尖生長至1.0 cm時，即可切割0.03 0.05 cm的莖尖進一步開展無毒苗培養。步驟(I)中的處理是指待休眠芽長至5.0 cm時，將1.0 cm的莖尖剪下并去除葉片和葉柄，在超凈臺上用70%酒精涮洗10 S，用飽和次氯酸鈉溶液浸泡6 min，無菌水沖洗10次，用無菌濾紙吸干表面水分，切除被殺菌消毒劑損傷部分后，將葡萄莖尖切取0.05
0.10 cm 備用 ο進行葡萄脫毒種苗快速繁殖；具體是在步驟(4)后待無毒莖尖生長至1.0 1.5cm和基部生根后，在無菌條件下打開培養瓶，將植株留I葉切下苗干，并割成一葉一段再轉接到上述基本培養基中進行腋芽萌發生長及莖段基部生根培養，實現成苗。進行葡萄脫毒試管苗的煉苗和移栽；具體是待無毒莖段基部發出5 7條根且長至1.5 cm以上，苗高達3 cm時，從培養瓶中取出試管苗，在含有質量百分比10%殺毒礬溶液中洗去苗上殘留的瓊脂，然后植入經二氯丙烷200 g/m2和溴甲烷75 g/m2消毒過的腐爛松針、田園土和細河砂=2:2:1混合的基質中，用透光好的塑料薄膜覆蓋以保濕保溫，濕度保持在75%，溫度控制在20 ±2 °C，每天自然光照12 h，每天中午適當揭開部分塑料薄膜進行通風換氣20 30 min, 7 d后揭去薄膜，每天早晨噴灑清水I次，無毒苗成活率達97.0%以上。本發明的優點是:1、本發明針對以上方法中的不足，在光照和保濕的葡萄正常生長條件下，通過篩選確定影響脫毒率的培養基、培養溫度、培養時間及莖尖大小等因素的最佳范圍后，在試管內利用相對較大的莖尖進行熱處理的集成脫毒方法，避免了以往單一方法脫毒的種種不足、可操作性差、脫毒率低等難點。具有方法簡單、操作方便的特點。本發明可直接應用于葡萄脫毒苗的工廠化生產。2、葡萄扇葉病毒和卷葉病毒脫除率達100.0% ；無毒苗成活率達97.0%以上。3、本發明可直接應用于威代爾葡萄或其它葡萄品種脫毒種苗的工廠化生產，為葡萄標準化和規模化無公害栽培生產提供優質脫毒種苗。下面將結合實施例對本發明的實施方式作進一步詳細描述。
具體實施例方式葡萄試管內集成脫毒方法:
I材料與方法
1.1葡萄品種、來源及處理
葡萄品種為威代爾(Vidal)，屬于白色葡萄品種類，是白玉霓(Ugni blanc)和白謝瓦爾(Seyval Blanc)的雜交后代，在法國稱為Vidal Blanc或Vidal 256，在加拿大與美國東部有大量種植，是一耐寒品種是加拿大釀造典型冰葡萄酒的主要原料品種之一。該品種具有十分耐寒，果皮厚，不易腐爛，易保存，產量高，抗病強等特點，含糖量高(30 34%)。其休眠枝條采自吉林省葡萄種植區。將休眠枝條水培促使休眠芽萌發生長，待休眠芽長至5.0 cm時，將1.0 cm的莖尖剪下并去除葉片和葉柄，在超凈臺上用70%酒精涮洗10 S，用飽和次氯酸鈉溶液浸泡6 min，無菌水沖洗10次，用無菌濾紙吸干表面水分，切除被殺菌消毒劑損傷部分后作為外植體備用。
1.2威代爾葡萄病毒完全脫除的莖尖長度、培養溫度和培養時間篩選 基本培養基成份及使用用量:183 mg.L-1NH4NO3,100 mg.L^1CaCl2.2H20，87
mg.L-1MgSO4.7H20,436 mg.L-1KH2PO4 ；9.2mg.L-1FeSO4.7H20,12.5 mg.L-1Na2.EDTA.2H20 ；3.4 mg ^r1MnSO4.4Η20，1.7 mg 'L-1ZnSO4.7Η20，2.2 mg ^r1H3BO3j0.025 mg.L-1CuSO4.5Η20，
0.15 mg.L-1KI ；0.5 mg.L-1 煙酸，5.8 mg.L-1 鹽酸吡哆醇 VB6, 37 mg.L-1 肌醇。基本培養基中附加吲哚丁酸ΙΒΑ0.08 0.13 mg.Γ1和赤霉素GA3 2.20 3.30 mg. Λ添加食用白糖5 g.L—1，瓊脂條8.0 g.L_\ pH 6.0。將外植體材料嫩莖尖分別切割成0.30
0.50 cm的大小接種到培養基中，置于溫度為30 42 °C條件下，培養18 45 d過程中，每隔5天檢測脫毒率。為了提高威代爾葡萄中葡萄扇葉病毒和葡萄卷葉病毒的脫除速度及脫毒率，采用均勻設計法設計實驗，每個處理數接種莖尖數為10個，重復3次取平均值，選用Ultl(103)均勻表，篩選威代爾葡萄中葡萄扇葉病毒和葡萄卷葉病毒全部脫除的最佳莖尖長度、培養溫度和培養時間。檢測方法采用電子顯微鏡檢測法(直觀且速度快)，具體為利用負染色法(背景顏色采用苯胺黑)對脫毒處理的葉片進行染色，再將染色后的葉片制成40 60 nm的超薄切片，然后在電子顯微鏡下觀察，觀察被測葉片中是否有病毒顆粒子存在，以證明是否脫除病毒。脫毒率計算方法:脫毒率(%)=(無病毒莖尖數/接入莖尖總數)X 100%。1.3威代爾葡萄脫毒苗的快繁和煉苗移栽
以全部脫毒的威代爾葡萄莖尖為材料，將無毒莖尖接種至附加吲哚丁酸ΙΒΑ0.08 0.13 mg.171和赤霉素GA3 2.20 3.30 mg.L_\添加食用白糖5 g.171,瓊脂條8.0 g.L-1的基本培養基中，調節培養基pH至6.0，在溫度(26±2) °C，光照強度1400 lx，光照周期14h.Cf1條件下培養。待莖尖生長至需要高度和莖尖基部生根后，在無菌條件下打開培養瓶，將植株留I葉切下苗干，并割成一葉一段再轉接到上述培養基中進行腋芽萌發生長及莖段基部生根培養。培養一段時間后，待莖段生根和苗生長到一定高度時，統計計算出增殖周期和倍數。待無毒莖段基部發出一定數量根且長至需要高度時，從培養瓶中取出試管苗，在含有殺毒礬溶液中洗去苗 上殘留的瓊脂，然后植入經溴甲烷和二氯丙烷等消毒劑聯合消毒過的腐爛松針、田園土和細河砂(2:2:1)混合的基質中，用透光好的塑料薄膜覆蓋以保濕保溫，每天注意自然光照，通風換氣，待苗成活并開始生長后揭去薄膜，每天適當噴灑清水。注意防治線蟲、長尾粉蚧、無花果粉蚧和橘粉蚧對葡萄扇葉病毒和葡萄卷葉病毒的傳播。2結果與分析
2.1威代爾葡萄莖尖長度、培養溫度和培養時間對葡萄扇葉病毒和葡萄卷葉病毒脫除的影響
表I影響威代爾葡萄扇葉病毒和卷葉病毒脫除主要因素的Uici(IOs)試驗設計與結果
權利要求
1.一種葡萄試管內集成脫毒方法，其特征在于步驟如下: (1)將葡萄休眠枝條水培促使休眠芽萌發生長，處理后的莖尖作為外植體備； (2)將切取的葡萄莖尖接種至附加吲哚丁酸0.08 0.13 mg.Γ1和赤霉素2.20 3.30 mg.Ι^，添加食用白糖5 g.!/1，瓊脂條8.0 g.L—1的基本培養基中進行脫除葡萄扇葉病毒和卷葉病毒培養；所述的基本培養基成份及使用用量為:183 mg.IZ1NH4NO3,100mg.L-1CaCl2.2H20，87 mg.L-1MgSO4.7H20，436 mg.L-1KH2PO4 ；9.2mg.L-1FeSO4.7H20,12.5mg.L-1Na2.EDTA.2H20 ；3.4 mg.L-1MnSO4.4H20,1.7 mg.L-1ZnSO4.7H20, 2.2 mg.L-1H3BO3,0.025 mg.L 1CuSO4.5H20,0.15 mg.L 1KI ；0.5 mg.L 1 煙酸，5.8 mg.L 1 鹽酸批口多醇 VB6,37 mg.L—1 肌醇； (3)培養溫度控制在45 48°C，培養51 57 d后，實現葡萄扇葉病毒和卷葉病毒脫除； (4)當莖尖生長至1.0 cm時，即可切割0.03 0.05 cm的莖尖進一步開展無毒苗培養。
2.按照權利要求1所述的一種葡萄試管內集成脫毒方法，其特征在于步驟(I)中的處理是指待休眠芽長至5.0 cm時，將1.0 cm的莖尖剪下并去除葉片和葉柄，在超凈臺上用70%酒精涮洗10 S，用飽和次氯酸鈉溶液浸泡6 min，無菌水沖洗10次，用無菌濾紙吸干表面水分，切除被殺菌消毒劑損傷部分后，將葡萄莖尖切取0.05 0.10 cm。
3.按照權利要求1或2所述的一種葡萄試管內集成脫毒方法，其特征在于進行葡萄脫毒種苗快速繁殖；具體是在步驟(4)后待無毒莖尖生長至1.0 1.5 cm和基部生根后，在無菌條件下打開培養瓶，將植株留I葉切下苗干，并割成一葉一段再轉接到上述基本培養基中進行腋芽萌發生長及莖段基部生根培養，實現成苗。
4.按照權利要求3所述的一種葡萄試管內集成脫毒方法，其特征在于進行葡萄脫毒試管苗的煉苗和移栽；具體是待無毒莖段基部發出5 7條根且長至1.5 cm以上，苗高達3cm時，從培養瓶中取出試管苗，在含有10%殺毒礬溶液中洗去苗上殘留的瓊脂，然后植入經二氯丙烷200 g/m2和溴甲烷75 g/m2消毒過的腐爛松針、田園土和細河砂=2:2:1混合的基質中，用透光好的塑料薄膜覆蓋以保濕保溫，濕度保持在75%，溫度控制在20±2 °C，每天自然光照12 h，每天中午揭開部分塑料薄膜進行通風換氣20 30 min, 7 d后揭去薄膜，每天早晨噴灑清水I次，無毒苗成活率達97.0%以上。
5.按照權利要求1 所述的一種葡萄試管內集成脫毒方法，其特征在于步驟(2)中:吲哚丁酸 0.08 mg.廠1 和赤霉素 2.20 mg.I71。
全文摘要
本發明涉及一種葡萄試管內集成脫毒方法，屬于植物繁殖技術。其步驟如下(1)將葡萄休眠枝條水培促使休眠芽萌發生長，處理后的莖尖作為外植體備。(2)將切取的葡萄莖尖接種至附加吲哚丁酸0.08～0.13mg·L-1和赤霉素2.20～3.30mg·L-1，添加食用白糖5g·L-1，瓊脂條8.0g·L-1的基本培養基中進行脫除葡萄扇葉病毒和卷葉病毒培養；(3)培養溫度控制在45～48℃，培養時間51～57d。(4)當莖尖生長至1.0cm時，即可切割0.03～0.05cm的莖尖進一步開展無毒苗培養。葡萄扇葉病毒和卷葉病毒脫除率達100.0%；無毒苗成活率達97.0%以上。可直接應用于葡萄品種脫毒種苗的工廠化生產。
文檔編號A01H4/00GK103109744SQ201310074449
公開日2013年5月22日 申請日期2013年3月10日 優先權日2013年3月10日
發明者顧地周, 顧川岳, 陸爽, 姜云天, 朱俊義, 楊麗娟, 潘雨, 禚玲玲, 張學士, 王秋爽, 付航, 倪偉佳 申請人:通化師范學院