專利名稱：基于色素突變體選擇的條斑紫菜誘變育種方法
技術領域：
本發明涉及一種條斑紫菜誘變育種方法。
背景技術：
條斑紫菜屬于大型經濟栽培海藻，其生活史包含單倍體的配子體(葉狀體)階段與二倍體的孢子體(絲狀體)階段，因其葉狀體在海區栽培，故自然海區的育種材料的選擇比較困難，因此研究育種工作需要以實驗室培養配子體為研究對象，通過對配子體的定向選擇，再取得其二倍體孢子作為種質，并通過海上養殖實驗，觀察其性狀表現，以此為基礎，結合選擇育種、雜交育種等多種育種手段與方法進行定向的遺傳改良工作，培育出可以應用于養殖生產的條斑紫菜優良品種。而傳統的實驗室誘變育種工作主要是集中在突變體的選擇，對于前期的改造階段，則主要以突變體的生產特性為主要判斷依據，即在突變體生長至可明確判斷經濟性狀是否優良的階段進行關于品種(系)性狀的判斷與篩選，而無法根據藻體的外在突變性狀(如色素體類別)對經過實驗改良的優良品系的藻體進行鑒別，必須通過海上養殖才能確認育種工作的成效。而且在養殖海區直接進行大田選育的方法所耗費時間長，并且需要數年時間完成對性狀的純化工作，才能培育出新的品種。這種技術方法造成的育種周期長，效率低下的問題，需要新的育種技術手段的來解決。
發明內容
本發明的目的在于提供一種高效、快速、簡便、操作性強的基于色素突變體選擇的條斑紫菜誘變育種方法。本發明的技術解決方案是:
一種基于色素突變體選擇的條斑紫菜誘變育種方法，其特征是:包括下列步驟:
(I)人工誘變:采用自然海區養殖的野生或經改良的條斑紫菜葉狀體，除去雜藻，洗凈，對其進行人工誘變處理；誘變采用6ciCo-Y射線進行輻照，照射劑量為500-1000Gy，經過誘變處理的條斑紫菜葉狀體在黑暗中靜置3天后，在光照強度30 μ mo I m —2*s —1溫度18°C的條件下進行充氣培養，15天后進行變異細胞的酶解與分離；
(2)變異細胞的酶解與分離:用海洋細菌酶處理經誘變后的葉狀體，分離出色素突變細胞，并將其培養為葉狀體；
(3)依據良種選拔目標選拔出優良再生葉狀體，進行單株培養；
(4)對篩選出來的優良色素突變體再生葉狀體的生長性狀以及主要光合色素和色素蛋白以及活體吸收光譜進行定性和定量測定，以鑒定條斑紫菜色素突變體再生葉狀體的生長性狀與經濟品質的優劣與遺傳穩定性；
(5)將確定為優良品系的色素突變 葉狀體進行再次酶解，培養成再生葉狀體，待藻體成熟之前通過單性生殖技術取得二倍體純系絲狀體；
(6)純系絲狀體通過促熟，使其放散殼孢子，培養成Fl代葉狀體，并檢驗其品質與遺傳穩定性；(7)經過驗證的良種純系絲狀體粉碎后進行貝殼育苗試驗，在貝殼絲狀體上采苗于養殖網簾，進行葉狀體色素突變體優良品系海區養殖試驗；
(8)良種的自由絲狀體保持在實驗室。所述生長性狀為藻體在60日齡內的長度，藻體厚度、藻體濕重及耐高溫性。主要光合色素和色素蛋白為:葉綠素a、藻紅蛋白和藻藍蛋白。所述選拔目標為葉片長度、厚度、蛋白含量、生長周期或成熟期長短。步驟(I)中的照射劑量為500Gy。上述所用酶解液的酶為海洋細菌酶。本發明將大型栽培藻類條斑紫菜育種由后期海上栽培實驗檢測，轉變為早期的實驗室內預測和判斷，利用Y-射線輻照處理獲得條斑紫菜色素突變體的穩定遺傳，選擇與育種目標性狀相關的突變個體，以此作為育種對象進行育種。本發明將大型海藻條斑紫菜的選育工作由局限于生活史后期的海上栽培階段轉變為早期實驗室內對色素突變體的檢測與篩選。本發明可以結合多種生物學技術進行育種工作，如以高溫為選育條件可以篩選耐高溫品系，以鹽度為選育條件可以篩選耐高鹽與耐低鹽品系。
下面結合附圖和實施例對本發明作進一步說明。圖1是經6tlC0- Y射線輻·射后條斑紫菜葉狀體上形成的不同顏色變異細胞塊示意 其中:1.野生型細胞；2.深紅色變異細胞塊；3.紅色變異細胞塊；4.桔黃色變異細胞塊；5.紫紅色變異細胞塊；6.金黃色變異細胞塊；7.淺灰色變異細胞塊；8.青橄欖色變異細胞塊；9.黃綠色變異細胞塊。1-9均為經6tlCo- Y射線輻射(500 Gy)后再培養4周的細胞，圖中標尺均代表50 Mm。圖2是條斑紫菜色素突變體的再生小葉狀體示意 其中:1.野生型葉狀體；2-9.色素突變體,分別為ros (桔紅色)、ro# (深紅色)、co/ (紫紅色)、oro (紅色)、/re (淺桔黃色)、iec (紅褐色)、_Fe7 (青橄欖色)、沿"r (綠色)。1-9中的苗齡均為25 d0圖中標尺均代表50 Mm。圖3是經6tlCo-Y射線輻射后獲得的條斑紫菜色素突變體示意圖。1.野生型葉狀體；2-9.色素突變體，分別為(桔紅色(深紅色)、co/7(紫紅色)、oro (紅色)、/re (淺桔黃色)、iec (紅褐色)、_Fe7 (青橄欖色)、■§.# (綠色)。I中的苗齡為70 d ;2、8、9中的苗齡為83d ;3、4、5中的苗齡為65 d;6，7中的苗齡為52 d。圖中標尺均代表50 Mm。
具體實施例方式一種基于色素突變體選擇的條斑紫菜誘變育種方法，其特征是:包括下列步驟:
(I)人工誘變:采用自然海區養殖的野生或經改良的條斑紫菜葉狀體，除去雜藻，洗凈，
對其進行人工誘變處理；誘變采用6ciCo-Y射線進行輻照，照射劑量為500-1000Gy，經過誘變處理的條斑紫菜葉狀體在黑暗中靜置3天后，在光照強度30 μ molm —2*s —1溫度18°C的條件下進行充氣培養，15天后進行變異細胞的酶解與分離；(2)變異細胞的酶解與分離:用海洋細菌酶處理經誘變后的葉狀體，分離出色素突變細胞，并將其培養為葉狀體；
(3)依據良種選拔目標選拔出優良再生葉狀體，進行單株培養；
(4)對篩選出來的優良色素突變體再生葉狀體的生長性狀以及主要光合色素和色素蛋白以及活體吸收光譜進行定性和定量測定，以鑒定條斑紫菜色素突變體再生葉狀體的生長性狀與經濟品質的優劣與遺傳穩定性；
(5)將確定為優良品系的色素突變葉狀體進行再次酶解，培養成再生葉狀體，待藻體成熟之前通過單性生殖技術取得二倍體純系絲狀體；
(6)純系絲狀體通過促熟，使其放散殼孢子，培養成Fl代葉狀體，并檢驗其品質與遺傳穩定性；
(7)經過驗證的良種純系絲狀體粉碎后進行貝殼育苗試驗，在貝殼絲狀體上采苗于養殖網簾，進行葉狀體色素突變體優良品系海區養殖試驗；
(8)良種的自由絲狀體保持在實驗室。所述生長性狀為藻體在60日齡內的長度，藻體厚度、藻體濕重及耐高溫性。主要光合色素和色素蛋白為:葉綠素a、藻紅蛋白和藻藍蛋白。所述選拔目標為葉片長度、厚度、蛋白含量、生長周期或成熟期長短。步驟(I)中的照射劑量為500Gy ;在輻照劑量為O 500 Gy范圍內，葉狀體上色素變異細胞塊的出現頻率隨著輻照劑量的增加而增加；但輻照劑量增至700 Gy時，色素變異細胞塊出現的頻率反而下降 ，說明500 Gy是合適的輻照劑量。色素變異細胞塊出現的頻率在同一葉狀體的不同部位是不同的，從基部到梢部，隨著部位的上移而逐漸增加。在O 500 Gy范圍內，在葉片的基部、中部到稍部等三個部位，色素變異細胞塊出現的頻率均隨著輻照劑量的增加而增加，尤其在細胞分裂旺盛的稍部其增加更加明顯，但超過500 Gy后，各部位的色素變異細胞塊數量均隨著誘變劑量的增加反而減少。上述所用酶解液的酶為海洋細菌酶。用酶解法把含色素變異細胞的葉狀體細胞單個分離出來并進行離體培養，在它們的再生體中，出現了多種單色的色素突變體，分離到row (深紅色)、co/7 (紫紅色)、oro (紅色)、/re (淺桔黃色)、iec (紅褐色(桔紅色)、yel (青橄欖色)、μτ (綠色)等多種不同顏色的純色突變體。8種突變體葉狀體的活體吸收光譜與野生型葉狀體一樣，在波長350 750 nm之間，均有5個明顯的吸收高峰，但各吸收峰的形狀和各峰頂所處的波長與打相比存在一定的差異。與野生型(#)相比，多種色素突變體的主要色素和色素蛋白含量均發生了明顯的變化，其中，PE的變化最明顯；色素突變體的三種主要色素之間的比例也存在著明顯的差
巳用酶解法將經6tlCo-Y射線處理后的條斑紫菜葉狀體細胞單個分離出來并進行離體培養，從它們的再生體中，還篩選到YZ-1、YZ-2、YZ-3, YZ-4和YZ-5等5個優良純系。它們與傳統養殖的野生品系(^)相比，在藻體的體型、顏色、主要光合色素和色素蛋白含量、生長和成熟等方面均具有明顯的優良特性。在波長350 750 nm之間，5個優良品系的葉狀體活體吸收光譜曲線與wt 一樣，均有5個明顯的吸收高峰，各峰的形狀和峰頂所處的波長與wt相比存在一定的差異，尤其是各峰值的差別很大，尤其是5個優良品系的P3和P4兩個峰值均比wt高。5個優良品系ΥΖ-1、ΥΖ-2、ΥΖ-3、ΥΖ-4和7U的藻膽蛋白含量(PE和PC含量之和)分別比Wt高出96%、75%、35%、60%和58%，其中PE含量的增加尤為顯著，分別比wt增加了 74%、59%、25%、58%和41%。與wt相比，5個優良品系的主要色素之間的比例也存在明顯的差異。各優良品系的優良特征在F1葉狀體里均充分地表現出來，每個品系內的F1葉狀體其顏色和形態很一致，說明這5個優良品系是純系，其優良性狀能穩定地遺傳下去。在進行耐高溫實驗中，和7K兩個優良品系表現出較強的耐高溫性。野生型(#)的葉狀體圓盤體在23 °C培養時，第10天就開始腐爛，而FZ-J和YZ-4的圓盤體分別在第20天和30天才開始腐爛。5個優良品系的F1葉狀體生長曲線顯示，它們的成熟期均比Wt晚，快速生長期至少比wt延長了一倍以上。與wt相比，5個優良品系的F1葉狀體的特定生長率在培養的第31 70天內，差異不明顯；但在第71 90天之間，差異非常顯著，是打的13 20倍。另夕卜，這5個優良品系 的成熟期均比wt品系推遲許多。
權利要求
1.一種基于色素突變體選擇的條斑紫菜誘變育種方法，其特征是:包括下列步驟: (I)人工誘變:采用自然海區養殖的野生或經改良的條斑紫菜葉狀體，除去雜藻，洗凈，對其進行人工誘變處理；誘變采用6ciCo-Y射線進行輻照，照射劑量為500-1000Gy，經過誘變處理的條斑紫菜葉狀體在黑暗中靜置3天后，在光照強度30 μ mo I m —2*s —1溫度18°C的條件下進行充氣培養，15天后進行變異細胞的酶解與分離； (2)變異細胞的酶解與分離:用海洋細菌酶處理經誘變后的葉狀體，分離出色素突變細胞，并將其培養為葉狀體； (3)依據良種選拔目標選拔出優良再生葉狀體，進行單株培養； (4)對篩選出來的優良色素突變體再生葉狀體的生長性狀以及主要光合色素和色素蛋白以及活體吸收光譜進行定性和定量測定，以鑒定條斑紫菜色素突變體再生葉狀體的生長性狀與經濟品質的優劣與遺傳穩定性； (5)將確定為優良品系的色素突變葉狀體進行再次酶解，培養成再生葉狀體，待藻體成熟之前通過單性生殖技術取得二倍體純系絲狀體； (6)純系絲狀體通過促熟，使其放散殼孢子，培養成Fl代葉狀體，并檢驗其品質與遺傳穩定性； (7)經過驗證的良種純系絲狀體粉碎后進行貝殼育苗試驗，在貝殼絲狀體上采苗于養殖網簾，進行葉狀體色素突變體優良品系海區養殖試驗； (8)良種的自由絲狀體保持在實驗室。
2.根據權利要求 1所述的基于色素突變體選擇的條斑紫菜誘變育種方法，其特征是:所述生長性狀為藻體在60日齡內的長度，藻體厚度、藻體濕重及耐高溫性。
3.根據權利要求1或2所述的基于色素突變體選擇的條斑紫菜誘變育種方法，其特征是:主要光合色素和色素蛋白為:葉綠素a、藻紅蛋白和藻藍蛋白。
4.根據權利要求1或2所述的基于色素突變體選擇的條斑紫菜誘變育種方法，其特征是:所述選拔目標為葉片長度、厚度、蛋白含量、生長周期或成熟期長短。
5.根據權利要求1或2所述的基于色素突變體選擇的條斑紫菜誘變育種方法，其特征是:步驟(I)中的照射劑量為500Gy。
全文摘要
本發明公開了一種基于色素突變體選擇的條斑紫菜誘變育種方法，包括人工誘變、變異細胞的酶解與分離、依據良種選拔目標選拔出優良再生葉狀體單株培養、對篩選出來的優良色素突變體再生葉狀體進行定性和定量測定；再次酶解，培養成再生葉狀體，通過單性生殖技術取得二倍體純系絲狀體，再培養成F1代葉狀體；良種純系絲狀體粉碎后進行貝殼育苗試驗，在貝殼絲狀體上采苗于養殖網簾，進行葉狀體色素突變體優良品系海區養殖試驗。本發明將大型栽培藻類條斑紫菜育種由后期海上栽培實驗檢測，轉變為早期的實驗室內預測和判斷，利用射線輻照處理獲得條斑紫菜色素突變體的穩定遺傳，選擇與育種目標性狀相關的突變個體，作為育種對象進行育種。
文檔編號A01H1/04GK103109741SQ20131007637
公開日2013年5月22日 申請日期2013年3月12日 優先權日2013年3月12日
發明者呂峰, 嚴興洪, 李峰, 王小紅, 周榮彬 申請人:呂峰