一種條斑紫菜質體遺傳轉化載體的構建方法
【專利摘要】本發明公開了一種條斑紫菜質體遺傳轉化載體的構建方法，由構建含rrsB-trnI-trnA-rrsL同源重組片段的骨架載體、構建含抗生素篩選基因表達盒的條斑紫菜質體表達載體、構建條斑紫菜質體基因組定點整合表達的載體組成。本發明采用質體遺傳轉化的思路，為質體遺傳轉化提供載體基礎，以期實現質體遺傳轉化外源基因表達效率高、來自原核的基因無需修飾改造、安全性好、易保持純系、后代不分離的優勢。
【專利說明】一種條斑紫菜質體遺傳轉化載體的構建方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物工程【技術領域】，涉及一種條斑紫菜質體遺傳轉化載體的構建方法。
【背景技術】
[0002]紫菜是目前經濟價值最高的一種栽培海藻，我國是紫菜栽培大國，紫菜干品的年產量達到1.6萬噸,長江以北以條斑紫菜(pyropia yezoensis)為主,長江以南,特別是福建、浙江主要栽培壇紫菜(Pyropia haitanensis)。近年來,隨著栽培面積的擴大,紫菜養殖面臨品種退化和病害頻發的嚴峻局面。因此，利用現代分子生物學手段開展紫菜基因工程研究，培育紫菜抗逆新品種，是解決上述問題的重要途徑之一。
[0003](I)質體遺傳轉化的研究
[0004]高等植物細胞中，細胞核、質體和線粒體都含有DNA，它們構成了既相對獨立又相互聯系的三個遺傳系統。自70年代初基因工程技術誕生以來，向細胞核導入外源基因的核基因轉化技術已經廣泛應用于重要農作物改良及分子生物學研究中。幾十年來，核基因轉化一直是植物基因工程的主要研究方向。然而，隨著研究的深入進展，人們逐漸認識到核基因轉化有其難以克服的弊 端，例如:細胞核基因組大，背景復雜；導入的外源基因難以控制；外源基因表達效率低，后代不穩定；對于來自原核的基因必須加以修飾改造等等，這些問題嚴重影響著核基因轉化技術的實際應用。為了克服核基因轉化存在的某些不足，1988年Boynton等人獨辟蹊徑，以萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardii)為材料用基因槍向葉綠體中轉化外源基因，使突變體成功轉化為能進行光合作用的正常萊茵衣藻，首次證實了葉綠體轉化技術的可行性。后來，Svab等人將此技術應用于煙草，獲得了穩定的質體轉化體，由此帶來了高等植物質體遺傳轉化的研究高潮。質體遺傳轉化在一定程度上克服了核基因轉化的不足，具有獨特的優越性，例如:將未經改造的蘇云金殺蟲蛋白基因(Bt基因)轉化煙草葉綠體，其表達量比核基因轉化提高了 50倍以上。近幾年來，質體基因轉化技術發展迅速，已開始成為植物基因工程中新的熱點。目前實現質體遺傳轉化的物種有:衣藻、煙草、馬鈴薯、擬南芥、番茄、油菜、胡蘿卜、棉花、大豆、矮牽牛、西蘭花、萵苣、楊樹、水稻、甘藍、地錢、甜菜、茄子、小麥等。質體遺傳轉化過程一般分以下4步進行:(1)構建質體定點整合表達載體；(2)將含外源DNA的質體定點整合表達載體通過適當的轉化方法導入質體中，使外源DNA整合到基因組中；(3)篩選成功轉化的質體的細胞；(4)穩定質體轉化株的繁殖和鑒定。其中，成功構建高效表達的遺傳轉化載體是質體遺傳轉化的前提。
[0005]在載體構建中，利用與質體基因組完全同源的兩翼片段實現外源基因與質體基因組的同源重組。
[0006]表達載體具有宿主葉綠體基因組l_2kb大小的左側和右側的側翼序列，用于通過同源重組將外源基因插入到葉綠體DNA中。在葉綠體基因組中的插入位點是由所選擇的位于標記基因和目的基因兩側的葉綠體DNA片段決定的。高等植物中，葉綠體基因組成功實現定點整合的位點包括:trnV-3' rpsl2, trnl-trnA 和 trnfM-trnG。trnV-3' rpsl2 和trnl-trnA位點都位于葉綠體DNA中25kb的反向重復序列區域,而插入這些位點的基因能夠在反向重復序列區域被快速復制成兩個拷貝。
[0007]構建的載體需要有自身調控轉錄和表達的能力，此功能的實現有賴于外源基因兩側的調控序列。
[0008]調控序列:葉綠體的基因表達水平主要是由啟動子和5'端非翻譯區元件決定的，因此，一個包含有核糖體結合位點(RBS)的合適的5'非翻譯區是葉綠體表達載體的重要組成元件。為了通過轉基因表達使蛋白大量積累，首先需要一個強啟動子來保證高水平的mRNA。轉基因mRNA的穩定性也是由轉基因兩側的5' -UTR和3' -UTR序列保證的，轉基因蛋白的積累依賴于插入到編碼目的基因的開放閱讀框上游的5' -UTR序列。最常用的5' -UTR 是 Prrn、psbA，常用的 3' -UTR 是 atpA3' -UTR、rbcL3' -UTR、psbA3' -UTR 即TpsbA0
[0009]質體遺傳轉化的篩選標記:質體基因組含有較多的拷貝，一般高等植物的一個細胞中有100或更多個質體，每個質體中又有多個拷貝的質體基因組，因而同時轉化這么多基因組是不可能的，極易出現轉化的與未轉化的質體組成的異質體，無法保證獲得的性狀穩定遺傳下去。因此，質體基因轉化所面臨的第三個關鍵問題就是去除未轉化的基因組和未轉化質體。這個問題的解決是通過向質體中轉入篩選標記基因、進行抗菌素抗性篩選、淘汰掉不含轉化質體的個體來實現的。第一個用于葉綠體轉化的選擇標記基因是質體16S rRNA基因(rrnl6)轉化株由壯觀霉素抗性篩選而且效率很低。隨后，編碼氨基葡糖苷3'-腺苷酰轉移酶的aadA基因被用作選擇標記基因，用aadA基因作為篩選標記顯著提高了葉綠體轉化子的陽性比例，使被轟擊的每個葉片樣品中平均存在一個轉化子。編碼草丁勝乙酸轉移酶(phosphinothricin acetyl transferase, PAT)的bar基因也曾經被用作標記基因，但其沒有得到廣泛的應用。此外，綠色熒光蛋白(GFP)、增強型綠色熒光蛋白(EGFP)、熒光素酶(LuxAB)等既可作為標記基因又能作為報告基因，尤其是LuxAB基因的應用更加廣泛。Franklin和Mayfield等在萊茵衣藻葉綠體中成功表達了 GFP和LuxCt,其中LuxCt是以熒光素酶基因LuxAB為基礎進行適當改造而成，它在萊茵衣藻葉綠體中的表達使得轉化陽性克隆能夠被直接觀察，便于篩選。針對紫菜這個物種，有研究表明，氯霉素對紫菜原生質體有明顯的致死效應，有望作為紫菜原生質體轉化的有效選擇壓力。氯霉素干擾細胞內核糖體的蛋白質合成，抑制細胞生長并最終導致死亡，而cat基因編碼的氯霉素乙酰轉移酶(chloramphenicol acetyl transferase)則使氯霉素乙酰化而失活。植物細胞內非特異性CAT本底活性很低，不會對轉基因產物的分析造成干擾。在高等植物中，已有很多以cat基因作選擇標記基因成功的實例。
[0010](2)紫菜現有遺傳轉化技術
[0011]目前，紫菜現有的遺傳轉化技術較成熟的是瞬時表達技術。構建載體將外源基因用基因槍法轉化進紫菜葉狀體、單孢子、原生質體等細胞中，由于載體上有完整的啟動子與終止子，所以外源基因可以利用紫菜本身的表達系統短時間內表達。但表達時間短，不能得到穩定的轉化個體。
·[0012]目前，在藻類中僅在衣藻中成功實現了質體的遺傳轉化。關于紫菜質體遺傳轉化的研究還未見報道。
【發明內容】
[0013]為了解決現有技術中存在的問題，本發明提供了一種用于條斑紫菜質體遺傳轉化的載體構建方法。此技術的成功可以有效地解決:1、可用于條斑紫菜質體遺傳轉化的篩選基因表達盒；2、可用于條斑紫菜質體遺傳轉化的定點整合位點；3、可用于條斑紫菜質體遺傳轉化的內源調控序列，包括5'端質體內源啟動子和3'非轉錄區。成功構建條斑紫菜的遺傳轉化體系，也將為后期的條斑紫菜功能基因的研究提供技術平臺。其技術方案如下:
[0014]一種條斑紫菜質體遺傳轉化載體的構建方法，包括以下步驟:
[0015](I)構建含rrsB-trnl-trnA-rrsL同源重組片段的骨架載體。①質體同源重組片段的克隆。以條斑紫菜質體基因組為模板，用下述正向和反向引物Xho1-PyT-Fl 5/ -CCGCTCGAGGAATCACTGGGCGTAAA-3' Sac1-PyT-Rl 5' -CGAGCTCTTCGCTAATGCTTCAAACTA-3'進行PCR擴增，所述正反向引物5'端分別添加了 XhoI和SacI酶切位點和幾個保護堿基，且所述正向引物是3'末端為序列I 5'端第1-18寡核苷酸序列，所述反向引物是3'末端為序列I 3'端第1-20堿基反向互補的寡核苷酸序列。將擴增產物與pMD19-T載體連接，轉化感受態大腸桿菌DH5 a，菌落PCR檢測，得到重組質粒；②用XhoI / SacI雙酶切pBluescriptSK載體(購自北京艾德萊生物科技有限公司)和步驟①中所得重組質粒，切膠回收2890bp和2500bp片段。用T4 DNA Ligase連接，轉化感受態大腸桿菌DH5 a，菌落PCR檢測，得到重組質粒，即含rrsB-trnl-trnA-rrsL同源重組片段的骨架載體；
[0016](2)構建含抗生素篩選基因表達盒的條斑紫菜質體表達載體。①以條斑紫菜質體基因組為模板,用下述正向和反向引物Cla1-PypsbA-Fl 5' -CCATCGATGCAAAAGTTTGTACGAGT-3' HindII1-PypsbA-Rl 5' -CCCAAGCTTCTACCTTATGCTGATTAT-3'對 psbA 序列進行 PCR擴增，所述正反向引物5'端分別添加了 ClaI和HindIII酶切位點和幾個保護堿基，且所述正向引物是3'末端為序列4 3/端第1-18堿基反向互補的寡核苷酸序列，所述反向引物是3'末端為序列3 5/端第1-18寡核苷酸序列。將擴增產物與PMD18-T載體連接，轉化感受態大腸桿菌DH5 a，菌落PCR檢測，得到重組質粒；②抗生素篩選基因(氯霉素抗性基因 cat)的克隆。以 pCAT?3-Control Vector 為模板,用下述引物 Afe 1-cat-Fl 5' -TCTGAGCGCTATGGAGAMAAAATCACTGG-3' Pac 1-cat Rl 5' -GCTTAATTAATTACGCCCCGCCCTG-3' PCR擴增氯霉素乙酰轉移酶基因cat基因。所述正反向引物5'端分別添加了 Afe I和PacI酶切位點和多個保護堿基，且所述正向引物是3'末端為序列2 5'端第1-20寡核苷酸序列，所述反向引物是3'末端為序列2 3/端第1-15堿基反向互補的寡核苷酸序列，將擴增產物與pMD19-T載體連接，轉化感受態大腸桿菌DH5 a，菌落PCR檢測，得到重組質粒；③將上述步驟①和步驟②所得重組質粒用Afe I / Pae I雙酶切，切膠回收3600bp和660bp片段，用T4 DNA Ligase連接，轉化感受態大腸桿菌DH5 a，菌落PCR檢測，得到重組質粒，即含抗生素篩選基因表達盒的條斑紫菜質體表達載體；
[0017](3)構建條斑紫菜質體基因組定點整合表達的載體。利用同源重組片段與質體基因組之間的同源重組將外源基因定點整合到受體細胞的質體基因組中，利用條斑紫菜psbA基因的啟動子psbA5'和終止子psbA3'調控外源基因轉錄，構建含有篩選標記基因cat的條斑紫菜質體基因組定點整合表達載體。用ClaI / HindIII雙酶切步驟(2)中所得的含抗生素篩選基因表達盒的條斑紫菜質體表達載體，回收cat基因表達盒，再用T4DNA Polymerase補平,插入到經過AvrII單酶切、末端平化、去磷酸化的步驟(1)所得的含rrsB-trnl-trnA-rrsL同源重組片段的骨架載體中，最終構建成含篩選標記基因cat表達盒、用于條斑紫菜質體基因組定點整合表達的載體PYVC ；
[0018]進一步優選,所述同源重組片段為rrsB-trnl-trnA-rrsL序列如SEQ ID N0:1所示。
[0019]進一步優選，所述抗生素篩選基因為氯霉素乙酰轉移酶基因cat基因如SEQ IDNO:2所示。
[0020]進一步優選,所述調控cat基因轉錄和表達的啟動子為條斑紫菜psbA啟動子如SEQ ID NO:3 所示。
[0021]進一步優選，所述調控cat基因轉錄和表達的3'非轉錄區為條斑紫菜psbA基因3'非轉錄區如SEQ ID N0:4所示。
[0022]與現有技術相比，本發明的有益效果:本發明采用質體遺傳轉化的思路，有效克服了核遺傳轉化和瞬時表達的缺陷和弊端，可以成功解決外源基因表達效率低的缺陷。由于質體是母系遺傳，只能通過母本代代傳播，安全性好，且后代純系穩定。來自原核的基因無需修飾改造，就直接可以在質體中表達。本發明為質體遺傳轉化提供載體基礎，以期實現質體遺傳轉化外源基因表達效率高、來自原核的基因無需修飾改造、安全性好、易保持純系、后代不分離的優勢。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0023]圖1是構建載體 結構示意圖。
【具體實施方式】
[0024]下面結合附圖和具體實施例進一步說明本發明的技術方案。
[0025]一種條斑紫菜質體遺傳轉化載體的構建方法，包括以下步驟::
[0026](I)構建含rrsB-trnl-trnA-rrsL同源重組片段的骨架載體。①質體同源重組片段的克隆。分析條斑紫菜質體基因組全序列(GenBank Accession N0.KC517072.1)選定rrsB和trnl-trnA-rrsL基因間隔區作為外源基因的插入位點。由上海英濰捷基生物公司合成如下引物，每個引物的5'端分別添加了特定的酶切位點和保護堿基。
[0027]Xho1-PyT-Fl 5' -CCGCTCGAGGAATCACTGGGCGTAAA-3'
[0028]Sac1-PyT-Rl 5' -CGAGCTCTTCGCTAATGCTTCAAACTA-3'
[0029]以條斑紫菜質體DNA為模板,用Taq DNA polymerase擴增。PCR體系(20ul體系):mixl0ul ;正向引物 0.6ul ;反向引物 0.6ul ;模板 Iul ；Taq DNA聚合酶0.2ul ；BSAlul ；ddH206.6ul。PCR 程序:94°C預變性 IOmin ;94°C變性 Imin ；55.5°C退火 Imin ;72°C延伸 2:30min，循環35次，72°C延伸lOmin。聚合酶鏈式反應擴增產物經質量濃度為I %的瓊脂糖凝膠電泳后回收片段。將回收的聚合酶鏈式反應產物與PMD19-T載體連接。連接條件為:PMD19-T載體0.5 iil，聚合酶鏈式反應回收產物4.5 iil，solusion I5ul (所用為TaKaRapMD?19 -T Vector試劑盒)16°C反應14個小時后轉化感受態的DH5 a細胞，并涂布于含有IOOii g / ml的氨芐青霉素的LB平板中。挑取菌落接種到含有IOOiig / ml的氨芐青霉素的LB培養液中，14~16小時后，菌落PCR鑒定獲得陽性克隆。將所獲得的陽性克隆命名為PYA ;②將同源重組片段插入pBluescript SK載體，即:將同源重組片段從pYA載體上經XhoI / SacI雙酶切回收后連入同樣經XhoI / SacI雙酶切的pBluescript SK載體中。用XhoI / SacI雙酶切pBluescript SK載體和含同源重組片段的載體pYA，，經2%瓊脂糖凝膠電泳切膠回收2890bp和2500bp片段。用T4DNA Ligase連接，連接條件是:12 yl酶切純化片段，2 u I 10XT4DNA連接酶緩沖液，5 U I酶切載體，I U I T4DNA連接酶，16°C反應14個小時。連接產物采用同樣的方法轉化、菌落PCR鑒定獲得陽性克隆，命名為pYD，SP含rrsB-trnl-trnA-rrsL同源重組片段的骨架載體。[0030](2)構建含抗生素篩選基因表達盒的條斑紫菜質體表達載體。①質體psbA基因(包含5'啟動子，編碼區，3'終止子)的克隆。分析條斑紫菜質體基因組全序列(GenBankAccession N0.KC517072.1)選定長度為1.9kb的psbA序列。設計并由上海英濰捷基生物公司合成如下引物，每個引物的5'端分別添加了特定的酶切位點和保護堿基。
[0031]Cla1-PypsbA-Fl 5' -CCATCGATGCAAAAGTTTGTACGAGT-3'
[0032]HindII1-PypsbA-Rl 5' -CCCAAGCTTCTACCTTATGCTGATTAT3'
[0033]以條斑紫菜質體DNA為模板,用Taq DNA polymerase擴增。PCR體系(20ul體系):mix IOul ;正向引物Iul ;反向引物Iul ;模板Iul ;Taq DNA聚合酶0.2ul ;BSAlul ;ddH205.8ul。PCR 程序:94 °C 預變性 IOmin ;94°C 變性 Imin ;54.8°C 退火 Imin ;72°C 延伸2min，循環35次，72°C延伸lOmin。聚合酶鏈式反應擴增產物經質量濃度為I %的瓊脂糖凝膠電泳后回收片段。將回收的聚合酶鏈式反應產物與PMD19-T載體連接。連接條件為:PMD19-T載體0.5 iil，聚合酶鏈式反應回收產物4.5 iil，solusion I5ul (所用為TaKaRapMD?19 -TVector試劑盒)16°C反應14個小時后轉化感受態的DH5 a細胞，并涂布于含有IOOu g / ml的氨芐青霉素的LB平板中。挑取菌落接種到含有IOOii g / ml的氨芐青霉素的LB培養液中，14~16小時后，菌落PCR鑒定獲得陽性克隆。將所獲得的陽性克隆命名為pYB。②氯霉素抗性基因cat的克隆。根據cat基因序列設計并由上海英濰捷基生物公司合成如下引物，每個引物的5'端分別添加了特定的酶切位點和保護堿基。
[0034]Afe 1-cat-Fl 5' -TCTGAGCGCTATGGAGAAAAAAATCACTGG-3'
[0035]Pac 1-cat-Rl 5' -GCTTAATTAATTACGCCCCGCCCTG-3'
[0036]以pCAT?3_Control Vector 為模板，用 Taq DNA polymerase擴增。PCR體系(20ul體系):mix IOul ;正向引物0.5ul ;反向引物0.5ul ;模板Iul ;Taq DNA聚合酶0.2ul;ddH207.8ul。PCR 程序:94°C預變性 5min ;94°C變性 45s ；64.2°C退火 45s ;72°C延伸 lmin,循環30次，72°C延伸lOmin。聚合酶鏈式反應擴增產物經質量濃度為I %的瓊脂糖凝膠電泳后回收片段。將回收的聚合酶鏈式反應產物與PMD19-T載體連接。連接條件為:pMD19-T載體0.5 iil，聚合酶鏈式反應回收產物4.5 iil，solusion I5ul (所用為TaKaRa pMD?19-TVector試劑盒)16°C反應14個小時后轉化感受態的DH5 a細胞，并涂布于含有100 ii g /ml的氨芐青霉素的LB平板中。挑取菌落接種到含有100 ii g / ml的氨芐青霉素的LB培養液中，14~16小時后，菌落PCR鑒定獲得陽性克隆。將所獲得的陽性克隆命名為pYC。③將cat基因片段從pYC載體上經Afe I / Pac I雙酶切回收后連入同樣經Afe I / Pac I雙酶切的含PsbA基因5'和3'非轉錄片段的pYB載體中。將含psbA基因的載體pYB與含氯霉素抗性基因cat的載體pYC用Afe I / Pac I雙酶切，經I %瓊脂糖凝膠電泳切膠回收3600bp和660bp片段。用T4 DNA Ligase連接，連接條件是:12 酶切純化片段，2 yl10父140嫩連接酶緩沖液，5111酶切載體，1111 T4DNA連接酶，16°C反應14個小時。連接產物采用同樣的方法轉化、菌落PCR鑒定獲得陽性克隆，命名為pYE，即含抗生素篩選基因表達盒的條斑紫菜質體表達載體。
[0037](3)構建條斑紫菜質體基因組定點整合表達的載體。利用同源重組片段與質體基因組之間的同源重組將外源基因定點整合到受體細胞的質體基因組中，利用條斑紫菜psbA基因的啟動子psbA5'和終止子psbA3'調控外源基因轉錄，構建含有篩選標記基因cat的條斑紫菜質體基因組定點整合表達載體。用ClaI / HindIII雙酶切含cat基因表達盒的重組質粒pYE,回收cat基因表達盒,再用T4DNA Polymerase補平(補平反應用TaKaRa DNA Blunting Kit), D N A純化后(用TIANGEN普通DNA產物純化試劑盒)插入到經過AvrII單酶切、末端平化(方法同上)、去磷酸化的pYD中，去磷酸化的條件是:5ul10XNEB Buffer3，lul CIP，23ul DNA，21ul ddH20 ;連接反應條件為:4 ul 酶切純化片段，2 ul IOX T4DNA 連 接酶緩沖液，6ul 酶切載體，1ul T4 DNA 連接酶，2 ul 50 % PEG 5u lddH20，16°C反應14個小時。連接產物采用同樣的方法轉化、菌落PCR鑒定獲得陽性克隆，命名為pYVC，即最終構建的含篩選標記基因cat表達盒、用于條斑紫菜質體基因組定點整合表達的載體。
[0038]以上所述，僅為本發明最佳實施方式，本發明同樣適用于壇紫菜等相關物種，任何熟悉本【技術領域】的技術人員在本發明披露的技術范圍內，可顯而易見地得到的技術方案的簡單變化或等效替換均落入本發明的保護范圍內。
【權利要求】
1.一種條斑紫菜質體遺傳轉化載體的構建方法，包括以下步驟: (1)構建含rrsB-trnl-trnA-rrsL同源重組片段的骨架載體，①質體同源重組片段的克隆，以條斑紫菜質體基因組為模板，用下述正向和反向引物Xho1-PyT-Fl 5' -CCGCTCGAGGAATCACTGGGCGTAAA-3' Sac1-PyT-Rl 5' -CGAGCTCTTCGCTAATGCTTCAAACTA-3'進行 PGR擴增，所述正反向引物5'端分別添加了 XhoI和SacI酶切位點和幾個保護堿基，且所述正向引物是3'末端為序列I 5'端第1-18寡核苷酸序列，所述反向引物是3'末端為序列I3'端第1-20堿基反向互補的寡核苷酸序列，將擴增產物與pMD19-T載體連接，轉化感受態大腸桿菌DH5 a，菌落PCR檢測，得到重組質粒；②用XhoI / SacI雙酶切pBluescript SK載體和步驟①中所得重組質粒，切膠回收2890bp和2500bp片段，用T4 DNA Ligase連接，轉化感受態大腸桿菌DH5 a，菌落PCR檢測,得到重組質粒，即含rrsB-trnl-trnA-rrsL同源重組片段的骨架載體； (2)構建含抗生素篩選基因表達盒的條斑紫菜質體表達載體，①以條斑紫菜質體基因組為模板，用下述正向和反向引物 Cla1-PypsbA-Fl 5' -CCATCGATGCAAAAGTTTGTACGAGT3'HindII1-PypsbA-Rl 5' -CCCAAGCTTCTACCTTATGCTGATTAT-3'對 psbA 序列進行 PCR 擴增，所述正反向引物5'端分別添加了 ClaI和HindIII酶切位點和幾個保護堿基，且所述正向引物是3'末端為序列4 3/端第1-18堿基反向互補的寡核苷酸序列，所述反向引物是3'末端為序列3 5/端第1-18寡核苷酸序列，將擴增產物與pMD18-T載體連接，轉化感受態大腸桿菌DH5ci，菌落PCR檢測，得到重組質粒；②抗生素篩選基因的克隆，以pCAT?3-Control Vector為模板，用下述引物Afe 1-cat-Fl 5' -TCTGAGCGCTATGGAGAAAAAAATCACTGG-3' Pac 1-cat-Rl 5' -GCTTAATTAATTACGCCCCGCCCTG-3' PCR 擴增氯霉素乙酰轉移酶基因cat基因，所述正反向引物5'端分別添加了 Afe I和Pac I酶切位點和多個保護堿基，且所述正向引物是3'末端為序列2 5'端第1-20寡核苷酸序列，所述反向引物是3'末端為序列2 3/端第1-15堿基反向互補的寡核苷酸序列，將擴增產物與pMD19-T載體連接，轉化感受態大腸桿菌DH5ci，菌落PCR檢測，得到重組質粒；③將上述步驟①和步驟②所得重組質粒用Afe I / Pac I雙酶切，切膠回收3600bp和660bp片段，用T4DNA Ligase連接，轉化感受態大腸桿菌DH5 a，菌落PCR檢測，得到重組質粒，即含抗生素篩選基因表達盒的條斑紫菜質體表達載體；` (3)構建條斑紫菜質體基因組定點整合表達的載體，用ClaI/ HindIII雙酶切步驟(2)中所得的含抗生素篩選基因表達盒的條斑紫菜質體表達載體，回收cat基因表達盒，再用T4DNA Polymerase補平,插入到經過AvrII單酶切、末端平化、去磷酸化的步驟(1)所得的含rrsB-trnl-trnA-rrsL同源重組片段的骨架載體中，最終構建成含篩選標記基因cat表達盒、用于條斑紫菜質體基因組定點整合表達的載體pYVC。
2.根據權利要求1所述的條斑紫菜質體遺傳轉化載體的構建方法，其特征在于，所述同源重組片段為rrsB-trnl-trnA-rrsL序列如SEQ ID NO:1所示。
3.根據權利要求1所述的條斑紫菜質體遺傳轉化載體的構建方法，其特征在于，所述抗生素篩選基因為氯霉素乙酰轉移酶基因cat基因如SEQ ID N0:2所示。
4.根據權利要求1所述的條斑紫菜質體遺傳轉化載體的構建方法，其特征在于，所述調控cat基因轉錄和表達的啟動子為條斑紫菜psbA啟動子如SEQ ID N0:3所示。
5.根據權利要求1所述的條斑紫菜質體遺傳轉化載體的構建方法，其特征在于，所述.調控cat基因轉錄和表達的3'非轉錄區為條斑紫菜psbA基因3'非轉錄區如SEQ ID NO:4所示。
【文檔編號】C12N15/82GK103667328SQ201310632575
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月3日 優先權日:2013年12月3日
【發明者】孔凡娜, 劉偉勛, 茅云翔, 曹敏 申請人:中國海洋大學