專利名稱：花生耐漬澇的非共生血紅蛋白基因AhGLB及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及農業生物技術領域，特別涉及一種花生耐澇基因AhGLB，本發明還涉及所述花生耐澇基因的用途以及不同基因型花生受到不同脅迫處理時該基因的特異表達情況，揭示該基因的功能。
背景技術：
花生是我國主要的油料作物和經濟作物，是我國最具競爭力的出口創匯農產品。水分是影響植物的生長、發育、代謝和生態地理分布的重要的生態因子之一。由水分造成的脅迫一般分為兩種，干旱脅迫和潰澇缺氧脅迫，兩者對植物生理生態造成的危害非常大。其中濕澇對世界花生產量影響頗深，在亞洲(尤其是東南亞)、南美洲花生產區濕澇與干旱往往交替發生，雨季明顯，是世界花生濕澇危害的重災區。由于國內外對花生的研究普遍注重于抗旱一方面，對花生潰澇危害的認識不夠充分，花生潰澇研究無體系、不深入，整體上仍處于初始階段，而我國花生產區常分布于濕潤、半濕潤氣候區，旱澇往往交替發生，特別是南方產區澇害尤其明顯，其中長江中下游地區的春澇、春夏連澇；華南產區的夏秋澇；以及平原花生區和華南稻田花生區潰澇等，都是澇害十分嚴重的受災區，據預測，隨著全球氣候變暖，我國南方花生的濕澇問題將更加突出，在花生的生長發育過程中，潰澇缺氧脅迫的影響不容忽視，它將影響花生對氧分和營養的吸收，同時也會改變花生的農藝性狀等。我國作為當今世界花生生產、外貿第一大國，同時 作為潰澇嚴重受害國之一，對花生澇害防治研究亟待加強，但是，迄今為止除了對澇害或土壤過濕對花生產量的影響和化學調控研究以外，很少涉及內部機理的深入研究，因此花生濕澇機理研究亟待開展，當下應加強花生抗潰澇脅迫的研究和治理，以推進花生品種改良創新和指導生產，保證花生產業全面穩定的發展。分子育種是運用分子生物學技術的科學性與先進性，分離目的基因，構建重組分子，將目的性狀基因導入欲改良的植物細胞中，達到培育高產、優質、高抗的新品種，且綜合性狀優良的后代，育出新品種的目的。分子育種是從基因這個微觀水平予以改造和標記，再在植株上進行表達。非共生血紅蛋白近年來陸續在植物當中被發現，研究表明非共生血紅蛋白基因能在低氧脅迫時，結合NO作用生成N03_，提升N03_在植物體當中的濃度，滿足植物在潰澇缺氧脅迫下對N03_的需求，同時降低NO對植物造成的傷害，從而減輕潰澇低氧脅迫對植物體的傷害。
發明內容
本發明針對現有技術的不足提供以下的技術方案:花生耐潰澇的非共生血紅蛋白基因AhGLB，其全序列為序列表SEQ ID NO:5所示。花生耐潰澇的非共生血紅蛋白基因AhGLB的應用，該基因的表達能夠提高花生抗潰澇脅迫的能力。本發明還涉及利用熒光定量PCR技術檢測花生在不同處理條件下所述基因的表達量，包括如下步驟:設計一對PCR引物:AhGLB-RT-S和AhGLB_RT_AS，提取花生幼葉總RNA，反轉錄為cDNA，以其為模板，進行PCR擴增，回收擴增產物，將PCR產物與pMD_18連接，然后轉化大腸桿菌DH5 α，經菌落PCR鑒定后，陽性克隆大量擴增，提取質粒，將取得的質粒依次稀釋得到濃度梯度；利用羅氏熒光定量PCR軟件分析并計算出相關的線性方程，作圖得標準曲線；在Roche熒光定量PCR儀進行待測樣品的熒光定量PCR，根據程序自動給出的Ct值，對照標準曲線，即可得出所測樣品的目的基因拷貝數。設計不同的處理方式:1)未處理花生不同組織中AhGLB基因的表達分析；2)不同基因型花生在氮誘導下AhGLB基因的表達分析；3)不同基因型花生在低氧脅迫下AhGLB基因的表達分析。本發明還涉及上述花生耐澇基因在構建載體、轉基因以及檢測花生耐潰澇狀況中的應用，包括如下步驟:構建AhGLB正義基因植物表達載體PRI101-AN-AhGLB，轉化農桿菌ΕΗΑ105，利用農
桿菌侵染法轉化花生，經篩選鑒定，獲得轉基因植株；設計潰澇缺氧脅迫處理，利用熒光定量PCR技術檢測轉基因花生及對照根中AhGLB基因的表達量。本發明從分子生物學角 度，以花生為材料，從基因庫中挑選許多植物中的非共生血紅蛋白基因序列，設計簡并引物，獲得中間片段，再利用RACE技術擴增出全長cDNA片段，從花生中分離克隆得到AhGLB基因，通過BLAST分析得知該序列與其他植物中的非共生血紅蛋白序列相似性極高，并從熒光定量的水平研究了 AhGLB基因在花生不同部位、不同時間氮誘導、不同時間低氧脅迫下的表達量變化情況，以及潰澇缺氧脅迫下AhGLB基因在轉基因花生植株根中的表達情況，研究了花生非共生血紅蛋白基因在植物應對潰澇缺氧脅迫下的作用。試驗中證明分離克隆得到的AhGLB基因，與花生抗潰澇缺氧脅迫存在相關性，并且獲得了潰澇低氧脅迫下各防御酶的生理特性變化情況，獲得了轉AhGLB基因花生抗潰澇植株，為最終完成花生抗潰澇缺氧脅迫的轉基因研究和抗潰澇缺氧脅迫新品種的培育奠定基礎。花生在受到潰澇缺氧脅迫時最主要的表現為氧分的供應不足，也就是低氧脅迫，因此，花生中非共生血紅蛋白基因AhGLB與花生抗潰澇脅迫相關，推測其表達可以提高花生抗潰澇脅迫的能力。
圖1:花生AhGLB基因的標準曲線；圖2:花生AhGLB基因在不同組織中的相對表達量；圖3:花生AhGLB基因在低氧脅迫下的相對表達量(ZH8:中花8號，YH15:豫花15，XH2008:湘花 2008 ；G:根，Y =Bf )；圖4:花生AhGLB基因在氮誘導下根中的相對表達量，A圖為中花8號及對照，B圖為豫花15及對照，C圖為湘花2008及對照；圖5:花生AhGLB基因在氮誘導下葉中的相對表達量，A圖為中花8號及對照，B圖為豫花15及對照，C圖為湘花2008及對照；圖6:轉基因植株及對照在潰澇缺氧脅迫下根中AhGLB基因的表達量(T:轉基因花生植株；ck:非轉基因植株)；
具體實施方式
:實施例1:花生耐潰澇基因AhGLB的獲得1、花生組織總RNA的提取實驗準備:所用器皿都需經過特殊處理。耐高溫儀器用具150°C烘烤3小時，其他器皿用0.1 %的DEPC浸泡12小時，然后高壓滅菌去除DEPC。溶液試劑用0.1 %的DEPC處理(37°C放置12小時后高壓消毒)，不耐高溫的試劑直接用DEPC-H2O配制。總RNA提取按TIANGEN的Trizol Reagent的操作要求，具體步驟如下:I)取花生幼嫩葉片在液氮中研磨成粉末后，每50mg組織加入I毫升Trizol液研磨，注意樣品總體積不能超過所用Trizol體積的10%。2) 12000g，4°C離心10分鐘，將上清液轉移入一干凈離心管中，研磨液室溫放置5分鐘，上清液15-30°C靜置5分鐘。3)以用勻漿的Trizol試劑計，每ImL加入0.2mL的氯仿，蓋緊離心管蓋，劇烈搖晃15秒，15-30°C靜置2-3分鐘，使得核酸蛋白復合物完全分離。4) 12000g，4°C離心15分鐘，此時樣品分為三層。上層水相約為用以勻漿的Trizol試劑體積的60%，將上層水相移入一干凈離心管。按每毫升Trizol液加0.5mL異丙醇的比例加入異丙醇，室溫放置10分鐘，12000g，4 °C離心10分鐘。5)棄去上清液，以用勻衆Trizol試劑計,每ImL加入至少ImL的75%乙醇,洗漆沉淀。渦旋混合，不超過5000g，4°C離心3分鐘。6)小心棄去上清液，然后室溫或真空干燥2-3分鐘，注意不要干燥過分，否則會降低RNA的溶解度，甚至RNA不溶。加入少量無RNase水(約40 μ L)充分溶解。7)電泳檢測總RNA的純度和亮度。整個操作過程始終戴口罩與手套操作,并頻繁更換手套,盡量避免RNase污染。2.單鏈cDNA合成,具體參照Takara逆轉錄試劑盒MML-V方法First strand cDNA合成試驗操作方法:Microtube 管中(表 I):表I
權利要求
1.花生耐潰澇的非共生血紅蛋白基因AhGLB，其全序列為序列表SEQID NO :5所示。
2.花生耐潰澇的非共生血紅蛋白基因AhGLB的應用，該基因的表達能夠提高花生抗潰 勞脅迫的能力。
全文摘要
本發明公開了一種花生耐漬澇的非共生血紅蛋白基因AhGLB及其應用，其全序列為序列表SEQ ID NO5所示。該基因在花生受到長期陰雨或洪澇引起的漬澇缺氧脅迫時，能與NO結合生成NO3-，減輕漬澇危害，從而在花生遭受漬澇危害時發揮重要作用。此外，本發明還公開了不同基因型花生受到不同脅迫處理時該基因特異表達情況，以及轉基因花生受到漬澇缺氧脅迫處理時該基因的表達情況，用于揭示該基因的功能。
文檔編號A01H5/00GK103255147SQ20131008892
公開日2013年8月21日 申請日期2013年3月20日 優先權日2013年3月20日
發明者單世華, 李林, 張廷婷, 李春娟, 徐娟, 閆彩霞, 周西 申請人:山東省花生研究所