專利名稱：千層金再生體系建立的方法
技術領域：
本發明所屬的技術領域為生物技術領域，進一步，本發明涉及一種千層金再生體系的建立方法。
背景技術：
千層金(Melaleuca bracteata),桃金娘科白千層屬常綠喬木。其主干直立,嫩枝紅色，枝條密集且細長柔軟，金黃或鵝黃色葉片密集分布于錐形樹冠，樹形十分優美，且分枝性能好，耐修剪，生長速度快，廣泛用于庭院景觀、小區綠化、道路美化等。千層金除極富觀賞價值外，還有極高的經濟價值，枝葉均為插花的上好材料，葉片芳香宜人，其芳香油是最珍貴的天然化妝品香料之一，同時也是一種優良的天然抗菌劑，廣泛用于醫藥、化妝品、日用化工等行業。千層金是目前世界上最流行且視覺效果最好的彩葉芳香喬木新品種，其市場前景十分廣闊。目前千層金多采用扦插或嫁接等傳統無性繁殖的方法生產種苗，且國內外關于千層金的報道較少，迄今尚未見到關于建立千層金離體葉片再生體系及轉基因技術相關研究報道。
發明內容
本發明提供了一種千層金再生體系建立的方法，為通過千層金離體葉片建立千層金高效遺傳轉化體系奠定基礎，同時也為今后選育千層金優良品種提供技術參考。一種千層金再生體系建立的方法，包括下列步驟:(I)將外植體千層金無菌苗幼嫩葉片從葉柄處切下，接種到含有激素的MS愈傷組織誘導培養基中，培養12-15 天；(2)再在含有激素的MS愈傷組織繼代培養基中培養25-30天；(3)將愈傷組織接種至含有激素的MS分化培養基上進行分化培養；(4)待不定芽長至2_3cm時，將其切下，接種至MS基礎培養基里進行壯苗培養；(5)待不定芽長至4-5cm時，將其接種至含有激素的MS生根培養基上進行生根培養;(6)待不定牙根系長出后,將其煉苗移栽。所述愈傷組織誘導培養基中的激素為0.01 0.03mg/L的噻重氮苯基脲、0.05
0.lmg/L的萘乙酸，或者0.5 1.5mg/L的6-芐氨基嘌呤；所述愈傷組織繼代培養基中的激素為0.01 0.03mg/L的噻重氮苯基脲、0.05
0.lmg/L的萘乙酸，或者0.5 1.5mg/L的6-芐氨基嘌呤、0.05 0.lmg/L的萘乙酸；所述分化培養基中的激素為0.01 0.03mg/L的噻重氮苯基脲、0.05 0.lmg/L的萘乙酸，或者0.5 1.5mg/L的6-芐氨基嘌呤、0.05 0.lmg/L的萘乙酸；所述生根培養基中的激素為0.1 1.0mg/L的吲哚丁酸。其中ILMS培養基的組成為:硝酸鉀(KNO3) 1900mg,硝酸銨(NH4NO3) 1650mg,氯化鈣(CaCl2.2H20)440mg,硫酸鎂(MgSO4.7H20)370mg,磷酸二氫鉀(KH2PO4) 170mg,硫酸錳(MnSO4.4H20) 22.3mg，硫酸鋅(ZnSO4.7H20) 8.6mg，硼酸(H2BO3) 6.2mg，碘化鉀(ΚΙ) 0.83mg，鑰酸鈉(Na2MoO4.2H20) 0.25mg,乙二胺四乙酸二鈉(Na2-EDTA.2H20) 37.25mg,硫酸亞鐵(FeSO4.7H20) 27.8mg,硫酸銅(CuSO4.5H20) 0.025mg,氯化鈷(COCl2.6H20) 0.025mg,肌醇IOOmg,煙酸0.5mg,鹽酸硫胺素(維BI) 0.1mg,鹽酸卩比卩多素(維B6) 0.5mg,甘氨酸2mg, pH值5.80。優選:所述愈傷組織誘導培養基中的激素為0.0 lmg/L的噻重氮苯基脲、0.lmg/L的萘乙酸；所述愈傷組織繼代培養基中的激素為0.0 lmg/L的噻重氮苯基脲、0.lmg/L的萘乙酸；所述分化培養基中的激素為0.02mg/L的噻重氮苯基脲、0.2mg/L的萘乙酸；所述生根培養基中的激素為0.2mg/L的吲哚丁酸。所述外植體在進行愈傷組織誘導之前，劃出橫向或縱向深至表皮的傷口。所述不定芽的煉苗時間為3 5天，移栽所用基質為營養土。所述植物組織培養各個階段，培養條件均為光照強度為20001χ，每日光照16小時，培養溫度(26 ± 2) °C。本發明采用幼嫩葉片作為外植體，在合適的生長素及細胞分裂素濃度下，采用MS培養基培養，其傷口處皮層可分化形成芽原始體并直接再生不定芽并通過分生細胞器官直接發生途徑進行不定芽誘導，誘導情況見“圖1 ”，具有誘導率高，穩定性高，變異低，移栽成活率高的優點。本發明采用千層金無菌苗幼嫩葉片為外植體，間接誘導不定芽發生，完善了千層金不定芽誘導再生體系。通過上述研究，建立了高效的千層金離體葉片再生體系，為建立千層金高效遺傳轉化體系奠定基礎，同時也為今后選育千層金優良品種提供技術參考。
圖1.千層金愈傷組織誘導，“a圖 ”為誘導10天左右的愈傷組織，“b圖”為誘導30天左右的愈傷組織，圖2.通過分生細胞器官直接發生途徑對千層金愈傷組織進行不定芽誘導情況，“a圖”為出現分化的愈傷組織，“b圖”為分化出的不定芽，圖3.千層金不定芽的壯芽及生根培養，“a圖”為不定芽壯芽培養，“b圖”為不定芽生根培養，圖4.不定芽移栽。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步的詳細說明。培養基及培養條件:愈傷組織誘導培養基中含有0.0 lmg/L的噻重氮苯基脲、0.lmg/L的萘乙酸，及30g/L的蔗糖，7g/L的瓊脂；
繼代培養基里含有0.0 lmg/L的噻重氮苯基脲、0.lmg/L的萘乙酸,及30g/L的鹿糖，7g/L的瓊脂；分化培養基中含有0.02mg/L的噻重氮苯基脲、0.05mg/L的萘乙酸，及30g/L的蔗糖，7g/L的瓊脂；生根培養基中含有0.2mg/L的吲哚丁酸，及30g/L的蔗糖，6g/L的瓊脂。實驗中培養基均為MS培養基。培養的各個階段，培養條件均為光照強度為20001χ，每日光照16小時，培養溫度(26±2)°C。其中ILMS培養基的組成為:硝酸鉀(KNO3) 1900mg，硝酸銨(NH4NO3) 1650mg，氯化鈣(CaCl2.2H20)440mg，硫酸鎂(MgSO4.7H20) 370mg，磷酸二氫鉀(KH2PO4) 170mg，硫酸錳(MnSO4.4H20) 22.3mg，硫酸鋅(ZnSO4.7H20) 8.6mg，硼酸(H2BO3) 6.2mg，碘化鉀(ΚΙ) 0.83mg，鑰酸鈉(Na2MoO4.2H20) 0.25mg,乙二胺四乙酸二鈉(Na2-EDTA.2H20) 37.25mg,硫酸亞鐵(FeSO4.7H20) 27.8mg,硫酸銅(CuSO4.5H20) 0.025mg,氯化鈷(COCl2.6H20) 0.025mg,肌醇IOOmg,煙酸0.5mg,鹽酸硫胺素(維BI) 0.1mg,鹽酸卩比卩多素(維B6) 0.5mg,甘氨酸2mg, pH值
5.80。I千層金再生體系的建立1.1外植體的獲得:取千層金無菌苗，從葉柄處切下幼嫩葉片，橫向或縱向劃出深至表皮的傷口。1.2愈傷組織誘導:將128個外植體接種至含有0.0lmg/L的噻重氮苯基脲、
0.lmg/L的萘乙酸的MS培養基內，進行愈傷組織誘導。見圖11.3愈傷組織繼代培養:培養15天以后，將愈傷組織接種至含有0.0lmg/L的噻重氮苯基脲、0.lmg/L的萘乙酸的MS培養基中進行繼代培養。繼代培養15天后統計愈傷組織誘導情況，共有96個外植體誘導出愈傷組織，愈傷組織誘導率為75.0%，其中愈傷組織誘導率=愈傷組織個數/接種外植體數X 100%。1.4分化培養:將78個長勢良好的愈傷組織接種至含有0.02mg/L的噻重氮苯基脲、0.05mg/L的萘乙酸的分化培養基中進行分化培養，40天后統計愈傷組織分化情況，共有45個愈傷組織分化出不定芽，分化率為57.7%，其中分化率=分化愈傷組織數/接種愈傷組織數X 100%。見圖2。1.5不定芽壯芽及生根培養:將長至3cm左右的不定芽切下，共50個，接種至MS基礎培養基上進行壯芽生長；待其長至5cm左右時接種至含有0.2mg/L的吲哚丁酸的生根培養基中進行生根培養，30天后統計生根情況，共有33個生根，生根率為66.0%，其中生根率=生根不定芽數/接種不定芽數X 100%。見圖3。1.6不定芽煉苗及移栽:將33個長出根系的植株開蓋煉苗3 5天后移栽，28天后統計成活率可達75.7%，其中成活率=成活植株數/移栽總數X 100%。見圖4。
權利要求
1.一種千層金再生體系建立的方法，包括下列步驟: (1)將外植體千層金無菌苗幼嫩葉片從葉柄處切下，接種到含有激素的MS愈傷組織誘導培養基中，培養12-15天； (2)再在含有激素的MS愈傷組織繼代培養基中培養25-30天； (3)將愈傷組織接種至含有激素的MS分化培養基上進行分化培養； (4)待不定芽長至2-3cm時，將其切下，接種至MS培養基里進行壯苗培養； (5)待不定芽長至4-5cm時，將其接種至含有激素的MS生根培養基上進行生根培養； (6)待不定牙根系長出后，將其煉苗移栽。
所述愈傷組織誘導培養基中的激素為0.01 0.03mg/L的噻重氮苯基脲和0.05 0.lmg/L的萘乙酸，或者0.5 1.5mg/L的6-芐氨基嘌呤和0.05 0.lmg/L的萘乙酸； 所述愈傷組織繼代培養基中的激素為0.01 0.03mg/L的噻重氮苯基脲和0.05 0.lmg/L的萘乙酸，或者0.5 1.5mg/L的6-芐氨基嘌呤和0.05 0.lmg/L的萘乙酸； 所述分化培養基中的 激素為0.01 0.03mg/L的噻重氮苯基脲和0.05 0.lmg/L的萘乙酸，或者0.5 1.5mg/L的6-芐氨基嘌呤和0.05 0.lmg/L的萘乙酸； 所述生根培養基中的激素為0.1 1.0mg/L的吲哚丁酸。
2.根據權利要求1所述的方法，其中ILMS培養基中包含:硝酸鉀1900mg，硝酸銨1650mg,氯化|丐440mg,硫酸鎂370mg,磷酸二氫鉀170mg,硫酸猛22.3mg,硫酸鋅8.6mg,硼酸6.2mg,碘化鉀0.83mg,鑰酸鈉0.25mg,乙二胺四乙酸二鈉37.25mg,硫酸亞鐵27.8mg,硫酸銅0.025mg,氯化鈷0.025mg,肌醇IOOmg,煙酸0.5mg,鹽酸硫胺素0.1mg,鹽酸卩比卩多素0.5mg,甘氨酸 2mg, pH 值 5.80。
3.根據權利要求1所述的方法，所述愈傷組織誘導培養基中的激素為0.0 lmg/L的噻重氮苯基脲和0.lmg/L的萘乙酸；所述愈傷組織繼代培養基中的激素為0.0 lmg/L的噻重氮苯基脲和0.lmg/L的萘乙酸；所述分化培養基中的激素為0.02mg/L的噻重氮苯基脲和0.2mg/L的萘乙酸；所述生根培養基中的激素為0.2mg/L的吲哚丁酸。
4.根據權利要求1所述的方法，所述外植體在進行愈傷組織誘導之前，劃出橫向或縱向深至表皮的傷口。
5.根據權利要求1所述的方法，所述不定芽的煉苗時間為3 5天，移栽所用基質為營養土。
6.根據權利要求1所述的方法，所述培養的條件均為光照強度為20001x，每日光照16小時，培養溫度24 — 28°C。
全文摘要
本發明涉及“千層金再生體系建立的方法”，屬于生物技術領域。本發明采用幼嫩葉片作為外植體，在合適的生長素及細胞分裂素濃度下，采用MS培養基培養，其傷口處皮層可分化形原始體并直接再生不定芽，并經過壯苗，生根培養，最后煉苗，移栽，得到再生植株。本發明采用千層金無菌苗幼嫩葉片為外植體，間接誘導不定芽發生，完善了千層金不定芽誘導再生體系。通過上述研究，建立了高效的千層金離體葉片再生體系，為建立千層金高效遺傳轉化體系奠定基礎，同時也為今后選育千層金優良品種提供技術參考。
文檔編號A01H4/00GK103222426SQ20131016249
公開日2013年7月31日 申請日期2013年5月3日 優先權日2013年5月3日
發明者趙德剛, 蘭麗 申請人:貴州大學