一種麻瘋樹基因、重組質粒及在提高植物抗鹽、耐旱性中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明屬于植物基因工程領域，提供了一種從麻瘋樹克隆得到的基因JcSnRK2、含所述基因的真核重組質粒及植物轉化體，實驗表明：JcSnRK2基因的表達能夠促進擬南芥SnRK2.8缺失型植株根系的生長，明顯提高其耐高鹽及抗干旱能力，降低葉片的失水率，能夠激發響應滲透脅迫的下游基因的表達。因此，本發明所述JcSnRK2基因和真核重組質粒可在提高植物抗鹽、耐旱性中應用。
【專利說明】一種麻瘋樹基因、重組質粒及在提高植物抗鹽、耐旱性中的應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于植物基因工程領域，特別涉及一種從麻瘋樹克隆得到的基因、含所述基因的真核重組質粒及其應用。
【背景技術】
[0002]在植物的生長和發育過程中，經常會遭遇到各種環境壓力，譬如干旱、鹽堿、高溫或寒冷、氧化、營養缺乏、病原體侵入等等，特別是全球水資源緊張以及近一半農業灌溉土地受到高鹽脅迫的影響，造成農作物產量下降甚至引起植物死亡。近年來，通過基因工程手段進行人工育種已經成為賦予植物逆境耐受能力的主要生物手段。
[0003]SnRK2 (鹿糖非酵解型蛋白激酶 2，sucrose non-fermentingl-related proteinkinase2)與植物的逆境脅迫應答關系密切，目前認識相對全面的是擬南芥和水稻，均各有 10 個家族成員，前者命名為 SnRK2.1 -SnRK2.10 (Hrabak EM, et al.,2003, TheArabidopsis CDPK - SnRK superfamily of protein kinases, Plant Physiology,132,666 - 680)，后者命名為 SAPKl -SAPK10 (Kobayashi Y, et al.,2004, Differentialactivation of the rice sucrose nonfermentingl-related protein kinase2familyby hyperosmotic stress and abscisic acid, The Plant Cell,16(5):1163-1177)。最近也有關于小麥TaSnRK2.4和玉米ZmSAPK8基因功能的分析，其在擬南芥中的過量表達均能提高轉基因植株的多種抗脅迫能力(Mao XG, et al.,2010, TaSnRK2.4, an SNFl-typeserine/threonine protein kinase of wheat(Triticum aestivum L.)，confersenhanced multistress tolerance in Arabidopsis, Journal of Experimental Botany,61 (3):683 - 696 ;Ying S, et al.,2011, Cloning and characterization of a maizeSnRK2protein kinase gene conf`ers enhanced salt tolerance in transgenicArabidopsis, Plant Cell R印，30:1683 - 1699)。雖然SnRK2家族受到關注和研究，但在木本植物中卻鮮有研究，在麻瘋樹(Jatropha curcas L.)的研究中也尚未見報道。通過克隆技術篩選出更多的SnRK2基因，對于提高植物抗性，培育出能夠在高鹽、干旱條件下仍能正常生長的植物具有重要作用。
【發明內容】
[0004]本發明的目的之一是提供一種從麻瘋樹克隆得到的基因、含所述基因的真核重組質粒及植物轉化體，本發明的目的之二是將所述基因和真核重組質粒在提高植物抗鹽、耐旱性中應用，以培育出具有高鹽、干旱抗性的植株。
[0005]本發明的技術方案如下:
[0006]利用現有草本植物SnRK2基因的保守序列設計擴增中間片段的簡并引物，根據所得中間片段序列進行5' Race和3' Race分別獲得上、下游序列，然后根據拼接序列設計特異引物，以麻瘋樹葉片總RNA為模板進行RT-PCR擴增得到基因全長，命名為JcSnRK2。序列分析顯示，所述JcSnRK2基因的mRNA包含1017個堿基的開放閱讀框，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID No:1所示,其基因組DNA核苷酸序列如序列表中SEQ ID No:2所示,所述JcSnRK2基因編碼的多肽的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No:3所示。生物信息學分析和基因表達模式分析顯示，JcSnRK2基因屬于SnRK2家族成員。
[0007]本發明所述真核重組質粒，由序列表中SEQ ID No:1所示的核苷酸序列與真核表達載體構成，序列表中SEQ ID No:1所示核苷酸序列正向插入真核表達載體的Xba I和BamH I雙酶切位點，所述真核表達載體為pBI121、pBI221或pBin438。
[0008]本發明所述植物轉化體，是將上述真核重組質粒通過農桿菌侵染花序法導入擬南芥SnRK2.8缺失型植株形成，經過卡那霉素抗性篩選、⑶S染色及PCR鑒定，得到JcSnRK2基因穩定表達的轉基因擬南芥種子。實驗表明:JcSnRK2基因的表達能夠促進擬南芥SnRK2.8缺失型植株根系生長，明顯提高其耐高鹽及抗干旱能力，降低葉片的失水率，能夠激發響應滲透脅迫的下游基因的表達。因此，本發明所述JcSnRK2基因和真核重組質粒可在提高植物抗鹽、耐旱性中應用。
[0009]本發明具有以下有益效果: [0010]1、本發明通過Race法克隆了一個新的麻瘋樹基因JcSnRK2，將該基因與真核表達載體構建真核重組質粒，為提高植物抗鹽、耐旱性提供了一種新的真核重組質粒。
[0011]2、本發明通過實驗證明所述真核重組質粒能夠提高植物耐高鹽及抗干旱的能力，能夠降低葉片的失水率，能夠激發響應滲透脅迫的下游基因的表達，因而可將所述重組質粒在人工抗性育種中應用，以培育出具有高鹽、干旱抗性的植株。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0012]圖1為實施例1中麻瘋樹葉片總RNA的瓊脂糖凝膠電泳圖，圖中，M泳道:分子量標記(AL2000DNAMarker，購自艾德萊公司)，I泳道:麻瘋樹葉片總RNA。
[0013]圖2為實施例1中JcSnRK2中間片段的PCR擴增電泳圖，圖中，M泳道:分子量標記(AL2000DNAMarker)，I泳道:JcSnRK2中間片段的擴增結果。
[0014]圖3為實施例1中3’ Race擴增JcSnRK2基因的下游片段電泳圖，圖中，M泳道:分子量標記(AL2000DNAMarker)，I泳道:JcSnRK2下游片段的PCR擴增結果。
[0015]圖4為實施例1中5’ Race擴增JcSnRK2基因的上游片段電泳圖，圖中，M泳道:分子量標記(AL2000DNAMarker)，I泳道:JcSnRK2上游片段的PCR擴增結果。
[0016]圖5為實施例1中JcSnRK2基因ORF的PCR擴增結果電泳圖，圖中，M泳道:分子量標記(AL2000DNAMarker)，1、2泳道:JcSnRK2基因ORF的PCR擴增結果。
[0017]圖6為實施例1中JcSnRK2基因ORF的菌落PCR結果電泳圖，圖中，M泳道:分子量標記(AL2000DNAMarker)，1-10泳道:10個轉化子的PCR擴增結果。
[0018]圖7為實施例1中JcSnRK2基因組DNA的PCR擴增結果電泳圖，圖中，M泳道:分子量標記(AL15000DNAMarker，購自艾德萊公司)，泳道1、2為JcSnRK2基因組DNA的PCR擴增結果。
[0019]圖8為實施例1中JcSnRK2基因組DNA的序列結構分析圖。
[0020]圖9為實施例2中麻瘋樹與6種其它植物的SnRK2基因的系統進化樹分析圖。
[0021]圖10為實施例2中麻瘋樹JcSnRK2與擬南芥SnRK2蛋白家族的系統進化樹分析圖。
[0022]圖11為實施例2中JcSnRK2基因編碼的多肽的氨基酸序列分析。
[0023]圖12為實施例2中JcSnRK2基因的組織特異性表達分析圖。
[0024]圖13為實施例2中JcSnRK2基因在ABA處理下的表達情況分析圖。
[0025]圖14為實施例2中JcSnRK2基因在鹽脅迫下的表達情況分析圖。
[0026]圖15為實施例2中JcSnRK2基因在干旱脅迫下的表達情況分析圖。
[0027]圖16為實施例2中JcSnRK2基因在冷脅迫下的表達情況分析圖。
[0028]圖17為本發明所述真核重組質粒的一種示意圖。
[0029]圖18為實施例3中雙酶切電泳圖，圖中，M泳道:分子量標記(AL2000DNAMarker)，I泳道:pBI121質粒XbaI和BamHI雙酶切產物，2泳道:pBI121質粒；3泳道:pET-JcSnRK2質粒；4泳道:PET-JcSnRK2質粒的XbaI和BamHI雙酶切產物。
[0030]圖19為實施例3中轉pBI121-JcSnRK2農桿菌菌落PCR電泳圖，圖中，M泳道:分子量標記(AL2000DNAMarker)，1-7泳道-J個轉化子的擴增結果。
[0031]圖20為實施例3中轉JcSnRK2基因擬南芥⑶S染色圖，其中，圖A、B、C分別為幼苗、角果和花的GUS染色圖。
[0032]圖21為實施例3中轉JcSnRK2基因擬南芥PCR驗證電泳圖，圖中，圖(A)為轉JcSnRK2基因擬南芥基因組PCR鑒定結果，圖(B)為RNA的RT-PCR鑒定結果；1-6泳道:轉基因擬南芥的PCR結果；7泳道:非轉基因擬南芥的PCR結果。
[0033]圖22是實施例3中snf2.8和JK2根生長情況分析圖，其中，圖㈧為snf2.8和JK2于MS培養基生長I周后幼苗的根長情況圖，圖(B)為snf2.8和JK2于MS培養基生長I周后幼苗的根長情況統計圖，圖(C)為snf2.8和JK2在土中培養45天的幼苗根系生長情況圖。
[0034]圖23是實施例3中snf2.8和JK2發芽率統計圖。
[0035]圖24是實施例3中snf2.8和JK2在鹽脅迫下的生長狀況圖，其中，上排和下排分別為snf2.8和JK2在含有不同濃度NaCl的MS培養基上生長I個月后的狀況圖。
[0036]圖25是實施例3中snf2.8和JK2植株抗鹽性分析圖，其中，圖A為生長30天的幼苗被450Mm NaCl溶液脅迫2周和I個月后的生長狀況圖，圖B為生長45天的幼苗被450MmNaCl溶液脅迫2周和I個月后的生長狀況圖。
[0037]圖26是實施例3中snf2.8和JK2在干旱脅迫下的生長狀況圖，其中，圖A為snf2.8和JK2在含不同濃度甘露醇的MS培養基上生長I個月后的概況，圖B為snf2.8和JK2在含不同濃度甘露醇的MS培養基上生長I個月后的具體表型。
[0038]圖27是實施例3中snf2.8和JK2植株抗旱性分析圖，其中，上排和下排分別為生長30天、45天的snf2.8和JK2幼苗停止供水I個月后的生長狀況圖。
[0039]圖28是實施例3中離體葉片失水率檢測結果圖。
[0040]圖29是實施例3中JcSnRK2及其下游基因AREBl、LEA、RD29A、RD29B在干旱脅迫下的表達水平檢測結果圖。
【具體實施方式】
[0041]以下結合實施例對本發明作進一步說明。下述實施例中，凡未注明具體實驗條件的，均為按照本領域技術人員熟知的常規條件，例如Sambrook等著的分子克隆:實驗室手冊(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989),實驗動物常規手冊(國家實驗動物規范中心，2004年11月):基本技術指南第五版(John ffiley&Sons, Inc, 2005)中所述的條件及實驗步驟，或按照制造廠商所建議的條件及實驗步驟。
[0042]下述實施例中，麻瘋樹成熟種子和麻瘋樹花采自海南省三亞市鳳凰鎮水蚊村，麻瘋樹根、莖、葉取自用麻瘋樹成熟種子培育的麻瘋樹幼苗，培育操作:將麻瘋樹成熟種子播種于花盆中，在溫室(30~35°C)、24h全光照條件下培養一至兩個月。
[0043]實施例1:麻瘋樹JcSnRK2基因的分子克隆
[0044]1、麻瘋樹葉片總RNA的提取
[0045]麻瘋樹葉片總RNA的提取使用Plant RNeasy Kit (Qiagen),具體步驟如下:
[0046]I)取麻瘋樹葉片≤0.lg，液氮充分研磨，加入450 μ I RLC (預先加入β -巰基乙醇)，劇烈振蕩；
[0047]2)將液體移入紫色濾柱中，置于2ml收集管，室溫，14，OOOrpm離心2min，濾液入
1.5mlEP管，小心勿吸入沉淀；
[0048]3)加入相當于濾液1/2體積的無水乙醇，抽打混勻；
[0049]4)將樣品，包括沉淀移入粉色濾柱，室溫，10，OOOrpm離心15s，棄濾液；
[0050]5)加入 700μ1 RWlbuffer,室溫，10，OOOrpm 離心 15s,清洗過柱;
[0051]6)加入500μ1 RPE，室溫，10，OOOrpm離心15s，清洗過柱，重復該操作一次；
[0052]7)室溫，14, OOOrpm 離心 Imin,棄濾液；
[0053]8)將濾柱放入1.5ml收集管中，加入30~50 μ I RNase-free水，室溫，10, OOOrpm離心Imin即得麻瘋樹葉片總RNA。
[0054]其瓊脂糖凝膠電泳圖如圖1所示。
[0055]2、JcSnRK2基因中間片段的獲得
[0056]2.1Reverse Transcriptase M-MLV 合成 cDNA 第一鏈
[0057]按照反轉錄酶M-MLV (TaKaRa)的操作說明進行，以步驟I所得麻瘋樹葉片總RNA為模板，Olig0(ClT)18S引物。
[0058]在RNase-free 的 0.2ml PCR 管中加入
[0059]麻瘋樹葉片總RNA3 μ I (約500ng)
[0060]01igo(dT)18 (50 μ Μ) I μ I
[0061]用RNase-free ddH20 將體積補充至 6 μ I。
[0062]混勻后，70°C保溫IOmin后迅速在冰上急冷2min以上，然后短暫離心使管中溶液集于EP管底部。在冰上依次加入以下試劑:5XM-MLV Buffer2 μ I ；dNTP (10 μ Μ) 0.5 μ I ；RNaseInhibitor0.3 μ I ；RTase M-MLV0.5 μ I ；RNase-free ddH200.7 μ I。混合均勻后再次放入PCR儀42°C反應lh，70°C反應lOmin，存于_20°C備用。
[0063]弓丨物Oligo(ClT)18 序列為:5 ' -GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTG(T)18-3/
[0064]2.2PCR
[0065]于冰上在一個0.2ml的EP管中加入以下組分:
[0066]
【權利要求】
1.一種從麻瘋樹克隆得到的基因，其特征在于該基因的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNo:1所示。
2.一種真核重組質粒，其特征在于該重組質粒由序列表中SEQ ID No:1所示的核苷酸序列與真核表達載體構成。
3.根據權利要求2所述真核重組質粒，其特征在于所述真核表達載體為PBI121、PBI221 或pBin438。
4.一種植物轉化體，其特征在于該轉化體是將權利要求2或3所述真核重組質粒導入擬南芥中形成。
5.權利要求2 或3所述真核重組質粒在提高植物抗鹽、耐旱性中的應用。
【文檔編號】A01H5/00GK103451215SQ201310398768
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年9月4日 優先權日:2013年9月4日
【發明者】淳俊, 王勝華, 陳放 申請人:四川大學