一種水稻種子特異性啟動子Posseed及其應用的制作方法

本發明涉及生物技術和植物基因工程技術領域，特別涉及水稻種子特異性表達啟動子及其應用。

背景技術：

啟動子是一段位于基因上游區的dna序列，在基因工程中，啟動子是重要的組成部分。植物基因工程中常用的啟動子按照其作用方式及其功能可分成三類：組成型啟動子，其驅動外源基因在植物各個發育階段和各個組織內持續恒定的表達，不會因時間與空間的不同而造成表達量的差異；組織特異性啟動子，其調控的基因的表達常常只發生在某些特定的器官或組織部位，能使目的基因的表達產物在一定空間積累；誘導性啟動子，一般不啟動轉錄或轉錄活性很低，但在某些特定的物理或化學信號的刺激下，轉錄活性能夠顯著地提高。目前組成型啟動子應用較為廣泛，但在應用中逐漸暴露出一些問題，比如它使外源基因在整個植株中表達，產生大量的外源蛋白質或代謝產物，打破了植物原有的代謝平衡，加重了植株的負擔，影響了植物的形態和正常的生長發育，甚至會導致植株死亡，造成資源不必要的浪費。在組織特異性啟動子調控下，基因的表達常常只發生在某些特定的器官或組織部位，可避免植物營養的不必要浪費。利用組織特異性啟動子按照人們的意愿改進代謝途徑，提高組織中營養物質含量，更加便利地獲得工業新產品和醫藥新化合物等。因此，組織特異性啟動子已成為轉基因研究中最具有發展前景的外源基因的啟動元件。

水稻是世界上最重要的糧食作物之一。種子是水稻最主要的營養貯藏器官，具有重要的經濟價值。目前已克隆的種子特異性啟動子主要是來自于糧食作物及油料作物種子種的蛋白、氨基酸、淀粉、脂類等合成代謝途徑中相關的酶基因的啟動子，如水稻的谷蛋白、醇溶蛋白基因啟動子；水稻的adp-葡萄糖焦磷酸化酶的啟動子等。在植物基因工程中應用較多的是glub-1啟動子。它主要應用于驅動一些大豆基因在水稻中表達改良水稻的品質。水稻谷粒中含有的鐵蛋白多積累在糊粉層，在谷粒加工中容易失去，因此，利用胚乳特異性的谷蛋白基因啟動子驅動大豆鐵蛋白基因在水稻中表達，可以使鐵蛋白在轉基因水稻的胚乳中積累，不易丟失，從而使稻米的含鐵量增加。xue等利用了glub-1基因啟動子，大量合成纖維素酶，因此種子特異啟動子也可應用于生物反應器研究中。目前能用于水稻轉基因的種子特異性啟動子的數量仍然較少，因此獲得一種新的水稻種子特異性啟動子，對水稻新品種的研究開發及植物基因工程發展具有推動作用。

技術實現要素：

本發明的目的是提供一種驅動外源基因在水稻種子中特異性表達的啟動子、獲得含有該啟動子序列的轉化子以及該啟動子的應用。

為了實現上述目的，一方面，本發明提供一種水稻種子特異性啟動子，所述水稻種子特異性啟動子包含序列表中seqidno:1所示的dna序列。序列表中seqidno:1所示的dna序列為來源于日本晴水稻(oryzasativalcv.nipponbare)的水稻種子特異性表達啟動子，本文中稱為posseed或啟動子posseed。

另一方面，本發明提供一種水稻種子特異性啟動子，其dna序列與seqidno:1所示的dna序列有至少80％同源性；或者，所述水稻種子特異性啟動子為在seqidno:1所示的dna序列中添加、取代、插入或缺失一個或一個以上核苷酸生成的突變體或等位基因或衍生物；或者所述水稻種子特異性啟動子具有與seqidno:1所示的dna序列雜交的產物。這些水稻種子特異性啟動子序列與seqidno:1所示的dna序列具有相同功能，即驅動目標基因在植物中特異性表達。

另一方面，本發明還提供一種包含上述水稻種子特異性啟動子的表達盒、重組表達載體和宿主菌。

再一方面，本發明提供上述水稻種子特異性啟動子在培育轉基因植物中的應用。所述應用包括將本發明提供的上述水稻種子特異性啟動子連接于載體的待表達的基因序列上游(例如，將所述啟動子序列置于目標基因之前)，從而構建重組表達載體，將所述重組表達載體轉化到植物細胞、組織或器官中進行培育。

并且優選地，所述應用可以用于培育理想水稻品種和生物反應器應用中。具體而言，因為水稻胚乳中蛋白含量達到80％以上，因此可以將水稻種子作為生物反應器，在水稻種子大量表達特異蛋白。如利用該啟動子驅動一些鐵蛋白等基因，用于提高種子種的鐵蛋白含量等，也可用于驅動纖維素基因、免疫蛋白等在水稻胚乳中大量表達，然后從水稻胚乳中分離提純這些成分。

具體實施中，本發明的發明人從日本晴水稻(oryzasativalcv.nipponbare)中分離克隆得到結構包括轉錄起始位點上游的2034bp的dna序列，并將其命名為posseed(序列表中的seqidno:1)。將該序列經酶切后連接到植物雙元表達載體pcambia1381上，獲得相應的重組質粒(即重組表達載體)，用于驅動gus基因的表達。利用該重組質粒轉化根癌農桿菌菌株eha105，然后用農桿菌介導的方法進行水稻的轉化，得到轉基因水稻植株。對獲得的轉基因水稻進行組織化學檢測發現，轉基因植株的種子中有明顯的gus染色，而在其他組織中沒有染色，從而證明該2034bp的序列具有驅動基因在種子中表達的活性。

技術效果

本發明所克隆的水稻啟動子posseed能夠調控靶標基因在種子中特異性表達，而在其他植株的其他組織中不表達，在實際應用中具有顯著價值。通過該啟動子對農作物品種進行基因改造，如通過該啟動子代替35s等組成型啟動子，調控目標基因在植株中表達，從而培育出理想的轉基因水稻品種，如提高種子的發育速度，改變水稻中的蛋白和淀粉含量，或用于生物反應器中，大規模表達生產蛋白質等。

附圖說明

以下，結合附圖來詳細說明本發明的實施方案，其中：

圖1為將posseed啟動子構建于pcambia1381載體質粒中的示意圖，其中a為pcambia1381示意圖，b為pcambia1381-posseed示意圖；

圖2為對本發明的啟動子進行酶切驗證的結果示意圖。

圖3為posseed::gus轉基因水稻植株組織染色圖。經24小時gus染色后，根(a)、莖(b)、葉(c)、葉鞘(d)和花(e)均無gus活性，而在種子的胚和胚乳(f)中均有gus強烈表達(標尺＝2.5mm)。

圖4為實施例2中的啟動子驅動gus基因的染色結果圖。gus基因在轉基因水稻非成熟的種子的胚和胚乳部位顯現出可明顯觀測到藍色(f)，在其它各器官根(a)、莖(b)、葉(c)、葉鞘(d)、花(e)和成熟種子中，均沒有檢測到gus基因的表達。

具體實施方式

以下參照具體的實施例來說明本發明。本領域技術人員能夠理解，這些實施例僅用于說明本發明，其不以任何方式限制本發明的范圍。

下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的藥材原料、試劑材料等，如無特殊說明，均為市售購買產品。

步驟1、野生型水稻日本晴基因組dna提取

按照天根試劑盒提供的方法提取野生型日本晴基因組dna。

步驟2、啟動子posseed的獲得和植物表達載體的構建

根據ncbi中提供的水稻品種日本晴(oryzasativalcv.nipponbare)全基因組序列，依據水稻posseed啟動子的序列設計擴增引物，并根據選用的載體及靶標基因的特點，設計引物的酶切位點。具體設計的引物為：正向引物(seqidno:2)5’端帶hindiii，酶切位點(aagctt)，反向引物(seqidno:3)5’端帶sali，酶切位點(gtcgac)，引物由深圳華大基因公司合成，序列如下：

正向引物：aagcttagtaccgtaccactctttctcghindiii

反向引物：gtcgaccgatcggtccctagtacgcactsali

以水稻品種日本晴dna為模板，利用正向引物、反向引物擴增啟動子posseed，按常規pcr體系，采用如下擴增程序：

95℃預變性5min；95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min30s，35個循環；最后72℃延伸10min。

回收pcr擴增的目的片段，目的片段長度2034bp，將其連接到pgem-t-easy載體(購自promega公司，按載體說明書中的比例混合)上，按照熱激法轉化大腸桿菌xl-blue感受態細胞后，經菌落pcr篩選獲得陽性克隆，挑取單克隆搖菌液提質粒，用hindiii和sali進行雙酶切驗證，如圖2所示。將經過鑒定的陽性克隆送交invitrogen公司測序。驗證正確的克隆即為所要獲得的啟動子posseed，其核酸序列如seqidno:1所示。

回收啟動子posseed片段，同時利用hindiii和sali對進行線性化處理和回收pcambia1381載體片段，將上述的posseed片段和pcambia1391片段用t4連接酶(購于takara公司)進行連接，得到啟動子posseed與gus基因融合的植物表達載體pcambia1381-posseed(圖1)，利用凍融法將植物表達載體轉入根癌農桿菌(agrobacteriumtumefaciens)eha105(安徽省農業科學院農業部轉基因生物產品成分監督檢驗測試中心水稻組保存)，經菌落pcr篩選獲得陽性克隆，獲得含有pcambia1381-posseed的農桿菌。

步驟3、陽性轉基因植株獲得

成熟種子去掉穎殼后，用70％酒精浸泡種子1min，倒掉酒精。用含有1滴tween20的50％次氯酸鈉(原液有效氯濃度大于4％)溶液浸泡種子40min(150r/min)。倒掉次氯酸鈉，無菌水洗5遍至溶液澄清，無次氯酸鈉味道。無菌水浸泡種子過夜。用解剖刀種子的沿糊粉層將胚剝下，將胚接種于愈傷誘導培養基上。30℃下暗培養11天后將愈傷與胚乳及胚芽分離，將去芽的狀態良好、分裂旺盛的初級愈傷組織進行預培養3～5天后用于農桿菌轉化。

采用上述步驟2中轉入了重組表達載體的根癌農桿菌進行農桿菌介導的遺傳轉化，該遺傳轉化、轉化子篩選及轉基因植株再生等參照yongboduan(yongboduan，chenguangzhai，etal.anefficientandhigh-throughputprotocolforagrobacteriummediatedtransformationbasedonphosphomannoseisomerasepositiveselectioninjaponicarice(oryzasatival.)[j].plantcellreport，2012.doi10.1007/s00299-012-1275-3.)等提出的方法，共獲得24株pcambia1381-posseed陽性植株。

步驟4、水稻種子特異性啟動子的活性鑒定

將posseed::gus轉基因植株的組織器官，即根、莖、葉、葉鞘、花和種子分別進行gus染色。參照jefferson(jeffersonra等人.gusfusion：β-glucuronidaseasasensitiveandversatilegenefusionmarkerinhigherplant[j].emboj.，1987，6:3901-3907)等提出的方法，將需要染色的組織抽真空，然后浸入染色液中，37℃染色24小時。75％乙醇脫色，將組織中的葉綠素脫掉。然后在解剖顯微鏡下觀察并記錄gus染色的結果。結果如圖3所示，gus基因在轉基因水稻成熟的種子的胚和胚乳(圖3f)部位顯現出可明顯觀測到藍色，在其它各器官根(a)、莖(b)、葉(c)、葉鞘(d)和花(e)中，均沒有檢測到gus基因的表達。

實施例2

在本實施例中，本申請的發明人發現并驗證了另一個種子啟動子，并且發現，該啟動子具有特定的表達時期。

該啟動子的序列為：

參照上述實施例1中的步驟(1)-(4)本申請的發明人對該啟動子也進行了類似驗證。

即，步驟1、野生型水稻日本晴基因組dna提取；

步驟2、啟動子的獲得和植物表達載體的構建；

步驟3、陽性轉基因植株獲得；

步驟4、水稻種子特異性啟動子的活性鑒定。

本實施例gus基因檢驗的結果如圖4所示。本實施例中進行驗證實驗所進行的實驗方法與實施例1完全相同只是改變了被驗證的啟動子序列。

申請人發現其可以成功地在水稻的發育期，尤其是灌漿期驅動gus基因特異性表達，而一旦水稻種子進入成熟期，則其表達特異性消失。

以上實施例僅為介紹本發明的優選案例，對于本領域技術人員來說，在不背離本發明精神的范圍內所進行的任何顯而易見的變化和改進，都應被視為本發明的一部分。

序列表

<110>安徽省農業科學院水稻研究所

<120>一種水稻種子特異性啟動子posseed及其應用

<130>hci20170105

<160>3

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>2034

<212>dna

<213>水稻種子特異性啟動子

<400>1:

agtaccgtaccactctttctcgttctttccttgaccggttcaaatgtactgtgccggtac60

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gttcatcactcactcaactcagctcagtagtcagtgcgtactagggaccgatcg2034

<210>2

<211>28

<212>dna

<213>正向引物

<400>2:

aagcttagtaccgtaccactctttctcg28

<210>3

<211>28

<212>dna

<213>反向引物

<400>3:

gtcgaccgatcggtccctagtacgcact28