一種組蛋白去乙酰化酶抑制劑誘導毛果楊不定芽再生的方法
【專利摘要】一種組蛋白去乙酰化酶抑制劑誘導毛果楊不定芽再生的方法，本發明要解決現有毛果楊組培苗作為外植體誘導不定芽成功率低、愈傷組織誘導不定芽周期長的問題，該方法是在組織培養幼苗的培養基中添加0～5μM組蛋白去乙酰化酶抑制劑溶液，誘導毛果楊根尖再生出不定芽的方法。本發明具有以下優點：（1）方法簡便有效，不需要復雜的組培體系和培養條件，只需要在普通的楊樹組培培養基中添加適當濃度的組蛋白去乙酰化酶抑制劑溶液，就能有效誘導不定芽的再生；（2）周期較短，一般經30天左右即可誘導出不定芽。
【專利說明】一種組蛋白去乙酰化酶抑制劑誘導毛果楊不定芽再生的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種用組蛋白去乙酰化酶抑制劑誘導毛果楊不定芽再生的方法。
【背景技術】
[0002]表觀遺傳調控主要包括DNA甲基化和組蛋白修飾，組蛋白修飾又包括組蛋白乙酰化、磷酸化和糖基化等。組蛋白乙酰化水平由組蛋白乙酰基轉移酶(histoneacetyl transferase, HAT)所介導的組蛋白乙酰化和組蛋白去乙酰化酶(histonedeacetylases, HDACs)所介導的組蛋白去乙酰化共同調節,缺一不可,二者共同作用保證細胞內組蛋白乙酰化水平處于動態平衡。組蛋白乙酰化影響染色質的結構，基因的轉錄，以及多種生命活動。HDAC催化組蛋白上的賴氨酸(lysine)所結合的乙酰基團的去除，乙酰基團去除后染色質結構變得緊密，不利于轉錄因子以及轉錄調節因子與DNA的結合。因此，HDAC一般與基因抑制或基因沉默有關。根據與酵母HDAC (RPD3、HDA1和SIR2)序列的同源性比較，植物HDAC可分為3個亞家族:RPD3/HDA1、HD2和SIR2。其中，RPD3/HDA1和HD2類型的組蛋白去乙酰化酶活性能夠被HDAC特異性的抑制劑如trichostatinA (TSA)或butynate(NaB)所抑制，而SIR2類型的組蛋白去乙酰化酶則不能被這些抑制劑所抑制。HDACs調節植物多種生命活動包括生長、 發育和脅迫反應等。當HDAC的酶活性被其特異的抑制劑如TSA或NaB抑制后，植物會出現多種表型上的改變。例如，擬南芥HDA18對根表皮細胞分化過程中模式形成具有重要的調節作用，TSA處理引起根毛細胞在非根毛形成部位的出現和發育。HDAC抑制劑TSA和NaB能夠抑制豌豆根表皮細胞的有絲分裂，NaB能夠抑制水稻根的生長。上述這些研究表明HDAC在植物根發育的多個過程中發揮非常重要的調控作用。
[0003]毛果楊是一種再生很困難的楊樹。目前，以毛果楊組培幼苗的葉片和莖段作為外植體，通過調節培養基成分、激素種類和濃度以及培養條件均很難誘導不定芽，仍沒有一個成熟的組培體系；而采用溫室成熟苗(4-6個月齡)的莖段能夠誘導出愈傷組織，再通過愈傷組織誘導出不定芽，但這種方法周期長(3-6個月)，涉及復雜的組織培養體系。因此，急需一種新的方法來提高毛果楊不定芽的再生率和縮短得到再生植株的時間。目前，木本植物組織培養體系的研究主要集中在培養基種類、鹽濃度、生長調節物質、碳水化合物、光照和溫度等方面，而表觀遺傳調控對木本植物再生和發育的影響很少有報道。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是為了解決目前毛果楊幼嫩葉片、莖段作為外植體不定芽誘導率低和采用愈傷組織誘導不定芽費時長的問題。而提供一種組蛋白去乙酰化酶抑制劑誘導毛果楊不定芽再生的方法。
[0005]本發明的一種組蛋白去乙酰化酶抑制劑誘導毛果楊不定芽再生的方法是按照以下步驟進行的:一、取毛果楊含腋芽的莖段在WPM培養基上誘導腋芽萌發，至長出幼苗；二、將步驟一的毛果楊幼苗在WPM培養基中培養，至長出不定根；三、將步驟二長出不定根的幼苗放入含O~5 μ M組蛋白去乙酰化酶抑制劑的水溶液，繼續培養，至不定芽誘導再生，即完成組蛋白去乙酰化酶抑制劑誘導毛果楊不定芽再生。
[0006]本發明包含以下有益效果:
[0007]目前，有關植物HDAC的研究主要涉及根的生長速率、根表皮細胞模式形成、側根形成等方面，而有關HDAC酶活性抑制后能誘導根再生出不定芽的研究結果未見報道。本發明以毛果楊組培苗的根為外植體，通過TSA處理誘導外植體直接分化出不定芽，省略了愈傷組織誘導培養過程，簡化了組織培養體系，縮短不定芽誘導周期，一般經30天左右即可完成不定芽的誘導過程，再生頻率較高(再生芽簇/根數目=37%)，是快速獲得再生植株的一個有效方法。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0008]圖1為實施例在加入5 μ MTSA處理下不定芽的誘導再生圖片；
[0009]圖2為實施例在加入I μ MTSA處理下不定芽的誘導再生圖片；
[0010]圖3為實施例在加入O μ MTSA處理下不定芽的誘導再生圖片。
【具體實施方式】
[0011]【具體實施方式】一:本實施方式的一種組蛋白去乙酰化酶抑制劑誘導毛果楊不定芽再生的方法是按照以下步驟進行的:一、取毛果楊含腋芽的莖段在WPM培養基上誘導腋芽萌發，至長出幼苗；二、將步驟一的毛果楊幼苗在WPM培養基中培養，至長出不定根；三、將步驟二長出不定根的幼苗放入含O~5 μ M組蛋白去乙酰化酶抑制劑的水溶液，繼續培養，至不定芽誘導再生，即完成組蛋白去乙酰化酶抑制劑誘導毛果楊不定芽再生。
[0012]本實施方 式包含以下有益效果:
[0013]目前，有關植物HDAC的研究主要涉及根的生長速率、根表皮細胞模式形成、側根形成等方面，而有關HDAC酶活性抑制后能誘導根再生出不定芽的研究結果未見報道。本發明以毛果楊組培苗的根為外植體，通過TSA處理誘導外植體直接分化出不定芽，省略了愈傷組織誘導培養過程，簡化了組織培養體系，縮短不定芽誘導周期，一般經30天左右即可完成不定芽的誘導過程，再生頻率較高，是快速獲得再生植株的一個有效方法。
[0014]【具體實施方式】二:本實施方式與【具體實施方式】一不同的是:步驟一中所述的誘導腋芽萌發的誘導條件為:在溫度為23~25°C、光照時間為16小時/天的條件下進行誘導至長出幼苗的苗高為2~3cm。其它與【具體實施方式】一相同。
[0015]【具體實施方式】三:本實施方式與【具體實施方式】一或二不同的是:步驟二中所述的培養條件為:在溫度為23~25°C、光照時間為16小時/天的條件下培養至長出不定根長度為0.5~1.5cm。其它與【具體實施方式】一或二相同。
[0016]【具體實施方式】四:本實施方式與【具體實施方式】一至三之一不同的是:步驟三中所述的不定芽誘導再生的條件為:在溫度為20~25°C，光照時間為16小時/天的條件下誘導出不定芽。其它與【具體實施方式】一至三之一相同。
[0017]【具體實施方式】五:本實施方式與【具體實施方式】一至四之一不同的是:步驟三中所述的WPM培養基中加入組蛋白去乙酰化酶抑制劑(TSA)水溶液，組蛋白去乙酰化酶抑制劑(TSA)的濃度為I~5μΜ。其它與【具體實施方式】一至四之一相同。[0018]【具體實施方式】六:本實施方式與【具體實施方式】一至五之一不同的是:步驟三中所述的WPM培養基中加入組蛋白去乙酰化酶抑制劑(TSA)水溶液，組蛋白去乙酰化酶抑制劑(TSA)的濃度為2~5μΜ。其它與【具體實施方式】一至五之一相同。
[0019]【具體實施方式】七:本實施方式與【具體實施方式】一至六之一不同的是:步驟三中所述的WPM培養基中加入組蛋白去乙酰化酶抑制劑(TSA)水溶液，組蛋白去乙酰化酶抑制劑(TSA)的濃度為3~5μΜ。其它與【具體實施方式】一至六之一相同。
[0020]【具體實施方式】八:本實施方式與【具體實施方式】一至七之一不同的是:步驟三中所述的WPM培養基中加入組蛋白去乙酰化酶抑制劑(TSA)水溶液，組蛋白去乙酰化酶抑制劑(TSA)的濃度為4~5μΜ。其它與【具體實施方式】一至七之一相同。
[0021]【具體實施方式】九:本實施方式與【具體實施方式】一至八之一不同的是:所述的WPM培養基均含有質量百分含量為2%的蔗糖、濃度為0.lmg/L的IBA和質量百分含量為0.6%的瓊脂；所述的WPM培養基pH=5.8。其它與【具體實施方式】一至八之一相同。
[0022]本實施方式所述的WPM培養基為市售產品。
[0023]通過以下實施例驗證本發明的有益效果:
[0024]本實施例的一種組蛋白去乙酰化酶抑制劑誘導毛果楊不定芽再生的方法是按照以下步驟進行的:一、取毛果楊組培苗去除葉片，用解剖刀切成小的莖段，每個莖段含一個腋芽，直立放在WPM培養基上，在溫度為23~25°C、光照時間為16小時/天的條件下進行誘導誘導腋芽萌發至長出幼苗的苗高為2~3cm ;二、將步驟一的毛果楊幼苗，用解剖刀將毛果楊幼苗從莖段上切下，直立放入WPM培養基中，在溫度為23~25°C、光照時間為16小時/天的條件下誘導生根，至長出Icm不定根；三、將步驟二長出不定根的幼苗分別放入含O μ M，I μ M和5 μ M組蛋白 去乙酰化酶抑制劑的水溶液，在溫度為20~25°C、光照時間為16小時/天的條件下繼續培養，至不定芽誘導再生，即完成組蛋白去乙酰化酶抑制劑誘導毛果楊不定芽再生。
[0025]本實施例所述的WPM培養基均含有質量百分含量為2%的蔗糖、濃度為0.lmg/L的IBA和質量百分含量為0.6%的瓊脂；所述的WPM培養基pH=5.8 ;所述的WPM培養基為市售
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[0026]通過對本實施例實驗結果分析，得到以下結論:
[0027]組蛋白去乙酰化酶抑制劑(TSA)濃度為5μ M時能有效誘導不定芽的再生(如圖1所示)，每個主根在加入組蛋白去乙酰化酶抑制劑(TSA)兩周后根尖重新生出幼嫩的新根，在加入組蛋白去乙酰化酶抑制劑(TSA)四周后，在舊根的根尖處再生出幼芽和發育成幼苗。不加TSA或TSA濃度為I μΜ時，均不能有效誘導芽的再生(如圖2和圖3所示)。
【權利要求】
1.一種組蛋白去乙酰化酶抑制劑誘導毛果楊不定芽再生的方法，其特征在于它是按照以下步驟進行的: 一、取毛果楊含腋芽的莖段在WPM培養基上誘導腋芽萌發，至長出幼苗；二、將步驟一的毛果楊幼苗在WPM培養基中培養，至長出不定根；三、將步驟二長出不定根的幼苗放入含O~5 μ M組蛋白去乙酰化酶抑制劑的水溶液，繼續培養，至不定芽誘導再生，即完成組蛋白去乙酰化酶抑制劑誘導毛果楊不定芽再生。
2.根據權利要求1所述的一種組蛋白去乙酰化酶抑制劑誘導毛果楊不定芽再生的方法，其特征在于步驟一中所述的誘導腋芽萌發的誘導條件為:在溫度為23~25°C、光照時間為16小時/天的條件下進行誘導至長出幼苗的苗高為2~3cm。
3.根據權利要求1所述的一種組蛋白去乙酰化酶抑制劑誘導毛果楊不定芽再生的方法，其特征在于步驟二中所述的培養條件為:在溫度為23~25°C、光照時間為16小時/天的條件下培養至長出不定根長度為0.5~1.5cm。
4.根據權利要求1所述的一種組蛋白去乙酰化酶抑制劑誘導毛果楊不定芽再生的方法，其特征在于步驟三中所述的不定芽誘導再生的條件為:在溫度為20~25°C，光照時間為16小時/天的條件下誘導出不定芽。
5.根據權利要求1所述的一種組蛋白去乙酰化酶抑制劑誘導毛果楊不定芽再生的方法，其特征在于步驟三中所述的WPM培養基中加入組蛋白去乙酰化酶抑制劑水溶液，組蛋白去乙酰化酶抑制劑的濃度為I~5 μ M。
6.根據權利要求1 所述的一種組蛋白去乙酰化酶抑制劑誘導毛果楊不定芽再生的方法，其特征在于步驟三中所述的WPM培養基中加入組蛋白去乙酰化酶抑制劑水溶液，組蛋白去乙酰化酶抑制劑的濃度為2~5 μ Μ。
7.根據權利要求1所述的一種組蛋白去乙酰化酶抑制劑誘導毛果楊不定芽再生的方法，其特征在于步驟三中所述的WPM培養基中加入組蛋白去乙酰化酶抑制劑水溶液，組蛋白去乙酰化酶抑制劑的濃度為3~5 μ Μ。
8.根據權利要求1所述的一種組蛋白去乙酰化酶抑制劑誘導毛果楊不定芽再生的方法，其特征在于步驟三中所述的WPM培養基中加入組蛋白去乙酰化酶抑制劑水溶液，組蛋白去乙酰化酶抑制劑的濃度為4~5 μ Μ。
9.根據權利要求1所述的一種組蛋白去乙酰化酶抑制劑誘導毛果楊不定芽再生的方法，其特征在于所述的WPM培養基均含有質量百分含量為2%的蔗糖、濃度為0.lmg/L的IBA和質量百分含量為0.6%的瓊脂；所述的WPM培養基pH=5.8。
【文檔編號】A01H4/00GK103461123SQ201310416635
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年9月13日 優先權日:2013年9月13日
【發明者】馬旭俊, 李淑娟, 楊傳平 申請人:東北林業大學