一種防治根結線蟲的復合微生物菌劑及制備方法
【專利摘要】本發明屬于生物防治領域，涉及一種可防止土壤中的有害生物線蟲的生物菌劑，具體為一種防治根結線蟲的復合微生物菌劑及制備方法。該復合微生物菌劑包括淡紫擬青霉(Penicilliumlilacinum)發酵液和短小芽孢桿菌（Bacilluspumilus）發酵液。每毫升復合微生物菌劑中淡紫擬青霉的孢子個數為1.0×108-1.0×1010個，短小芽孢桿菌的孢子個數為1.0×108-1.0×1010個。將淡紫擬青霉菌劑和短小芽孢桿菌菌劑復配在一起后，相比于單獨的淡紫擬青霉菌劑或短小芽孢桿菌菌劑，二者呈現出非常顯著的協同增效的防治根結線蟲功效，對于根結線蟲的防效有了顯著改善。
【專利說明】一種防治根結線蟲的復合微生物菌劑及制備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物防治領域，涉及一種可防止土壤中的有害生物線蟲的生物菌劑，具體為一種防治根結線蟲的復合微生物菌劑及制備方法。
【背景技術】
[0002]根結線蟲主要為害各種蔬菜的根部，表現為側根和須根較正常增多，并在幼根的須根上形成球形或圓錐形大小不等的白色根瘤，有的呈念珠狀。被害株地上部生長矮小、緩慢、葉色異常，結果少，產量低，甚至造成植株提早死亡。目前已知為害蔬菜的線蟲主要有高弓根結線蟲、花生根結線蟲、北方根結線蟲及南方根結線蟲。線蟲寄主范圍廣泛，常為害瓜類、茄果類、豆類及蘿卜、葫蘿卜、萵苣、白菜等30多種蔬菜，還能傳播一些真菌和細菌性病害。
[0003]目前對線蟲的防治主要以化學藥劑為主，化學藥劑具有速效性好的優點。但是，長期使用化學農藥不，僅對害蟲有殺傷毒害作用，同時對害蟲的“天敵”及傳粉昆蟲等益蟲益鳥也有殺傷作用，因而破壞了自然界的生態平衡。大量使用化學農藥，使農藥在環境中逐漸積累，尤其是在土壤中，產生了農藥污染環境問題。防止農藥污染已成為當前世界上很多國家關切的環境問題。農藥的使用與農業、林業、牧業等關系密切，因而，農藥對土壤的污染是重要的環境問題之一。
【發明內容】
[0004]本發明針對以上技術問題，提供一種可以克服現有的生防制劑在防治根結線蟲所存在的菌種和生防機理單一、對環境的適應性差、效果不穩定的問題的一種防治根結線蟲的復合微生物菌劑。
[0005]本發明的第二個目的 是提供一種防治根結線蟲的復合微生物菌劑的制備方法。
[0006]本發明的具體技術方案如下:
[0007]—種防治根結線蟲的復合微生物菌劑，該復合微生物菌劑包括淡紫擬青霉(Penicillium Iilacinum)發酵液和短小芽抱桿菌(Bacillus pumilus)發酵液。其中每毫升復合微生物菌劑中淡紫擬青霉的孢子個數為1.0XlO8-L OX IOltl個，短小芽孢桿菌的孢子個數為 1.0XlO8-L OXlO10 個。
[0008]作為優選，每毫升復合微生物菌劑中淡紫擬青霉的孢子個數為1.0X IO9個，短小芽孢桿菌的孢子個數為1.0X IO9個。
[0009]可以將復合微生物菌劑制備成液體生防制劑或固體生防制劑。所述的生防制劑包括顆粒制劑、粉劑或液體制劑。
[0010]該復合微生物菌劑應用于防治根結線蟲。效果較好的可用于防止根結線蟲中的花生根結線蟲。
[0011]本發明通過大量的實驗發現，將淡紫擬青霉和短小芽孢桿菌組合在一起得到的復合微生物菌劑，相比于單獨的淡紫擬青霉菌劑或短小芽孢桿菌菌劑，復合微生物菌劑具有不同的作用機理，對于根結線蟲的防治呈現出顯著的協同增效作用。
[0012]淡紫擬青霉(Penicillium Iilacinum),是南方根結線蟲與白色胞囊線蟲卵的有效寄生菌，對南方根結線蟲的卵寄生率高達60%~70 %。對多種線蟲都有防治效果，是防治根結線蟲最有前途的生防制劑。
[0013]短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)呈桿狀，圓末端，單個或呈短鏈排列，1.2~
1.5X2.0~4.0微米。能運動，革蘭氏陽性，芽孢1.0~1.2X 1.5~2.0微米，橢圓形，中生或次端生。短小芽孢桿菌被廣泛應用于防治各種植物病害。近年來，國內外對應用短小芽孢桿菌防治植物根結線蟲進行了大量的研究，并取得了重要進展，認為短小芽孢桿菌是用于植物根結線蟲病生物防治的一種有希望的研究對象。
[0014]本發明通過進一步的實驗發現，將淡紫擬青霉發酵液和厚短小芽孢桿菌發酵液按照不同的孢子濃度組合得到的不同的復合微生物菌劑，它們之間對于根結線蟲的防效也存在較為顯著的差異；其中，按孢子數計，當每毫升(或每克)菌劑中含有1.0X IO8-L OX 101°個的淡紫擬青霉孢子以及1.0X IO8-L OX IOltl個的短小芽孢桿菌孢子，相比于其它孢子濃度的組合，該復合微生物菌劑對于根結線蟲的防效有了進一步的顯著改善；更進一步的實驗發現，每毫升(或每克菌劑)產品中含有1.0X IO9個的淡紫擬青霉孢子和1.0X IO9個的短小芽孢桿菌孢子時，該復合微生物菌劑不僅防效最高且防效也更加穩定。
[0015]本發明所用到的淡紫擬青霉菌種或短小芽孢桿菌菌種均可通過商業途徑購買得到；本領域技術人員可按照本領域的常規方法，例如，采用二級培養方法，分別制備得到淡紫擬青霉菌發酵液或短小芽孢桿菌發酵液，將兩種發酵液混合在一起后，按生防菌劑的常規制備方法制備成液體生防制劑(原菌劑)或固體生防菌劑；例如，可向混合后的發酵液中加入載體(如硅藻土、草炭、輕質碳酸鈣、高嶺土等)，制備得到相應的微生物固體制劑，可以是顆粒劑、粉劑等。
[0016]施用方法:作為參考，對于液體生防制劑，可以將液體原菌劑用清水稀釋10-100倍后與花生種子混合基質施用，可在花生移栽時或對發病花生進行穴施或灌根。
[0017]利用微生物或其代謝產物來防治危害農作物的病、蟲、草、鼠害及促進作物生長，它包括以菌治蟲、以菌治菌、以菌除草等。微生物制劑具有選擇性強，對人、畜、農作物和自然環境安全，不傷害天敵，不易產生抗性等特點。隨著人們對環境保護越來越高的要求，微生物制劑無疑是今后農藥的發展方向之一。
[0018]本發明的積極效果為:田間防治根結線蟲試驗結果表明，將淡紫擬青霉和短小芽孢桿菌復配在一起后，二者呈現出顯著的協同增效的生防功效，相比于單獨的淡紫擬青霉或短小芽孢桿菌，復合微生物菌劑對于花生根結線蟲的防效有非常顯著的改善，并且從總體效果來看，復合微生物菌劑對于花生根結線蟲的防效也更加穩定。
【具體實施方式】
[0019]下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護范圍內。
[0020]淡紫擬青霉(Paecilomyces.1ilacinus)菌株購自中國農業微生物菌種保藏管理中心，菌種商業購買編號為:accc32001。
[0021]短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)菌株購自中國農業微生物菌種保藏管理中心，菌種商業購買編號為:acccll083。
[0022]預備實施例1短小芽孢桿菌發酵液的制備
[0023]1、將短小芽孢桿菌菌種活化后，進行搖瓶種子培養；
[0024]搖瓶種子培養培養基的組成(按重量百分比計):
[0025]可溶性淀粉1-3%
[0026]葡萄糖1-3%
[0027]黃豆粉1.5-2.5%
[0028]磷酸氫二鉀0.05-0.1 %
[0029]碳酸鈣0.05-0.1 %
[0030]水92.3%-95.4%
[0031]液體發酵條件:500ml三角瓶中裝入種子培養基200ml，高壓滅菌后接種孢子懸浮液，接種量為3-5%，置于24-28°C搖床110-150r/min培養36_72h。
[0032]2、液體發酵培養: [0033]液體發酵培養基的組成(按重量百分比計):
[0034]高粱浸汁10_20 %
[0035]磷酸二氫鉀0.2-5%
[0036]碳酸鈣0.2-0.3%
[0037]硫酸銨0.01-0.03%
[0038]蔗糖5-7%
[0039]水66-85%
[0040]將上述液體培養基高壓滅菌后備用；
[0041]液體發酵條件:發酵溫度為從開始到第48小時為30_35°C，48到第72小時為30-330C，第72小時到第5天為20-25°C。
[0042]預備實施例2
[0043]淡紫擬青霉(P.1ilacinus)發酵液的制備
[0044]1、將淡紫擬青霉菌種活化后，進行搖瓶種子培養；
[0045]搖瓶種子培養培養基的組成(按重量百分比計):
[0046]葡萄糖1.5-2%
[0047]硝酸鈉0.4-0.6%
[0048]硫酸銨0.2-0.3%
[0049]可溶性淀粉0.2-0.3 %
[0050]磷酸氫二鉀0.1-0.2%
[0051]硫酸鎂0.1-0.2%
[0052]水96.4%-97.5%
[0053]液體發酵條件:500ml三角瓶中裝入種子培養基200ml，高壓滅菌后接種孢子懸浮液，接種量為 1.5-3%，置于 26-29°C搖床 150_190r/min 培養 18_36h。
[0054]2、液體發酵培養:[0055]液體發酵培養基的組成(按重量百分比計):
[0056]高粱浸汁10-20%
[0057]硝酸鉀1-2%
[0058]磷酸二氫鉀0.2-5%
[0059]硫酸鎂0.2-0.3%
[0060]三氯化鎂0.01-0.03%
[0061]蔗糖5-7%
[0062]水65-84%
[0063]將上述液體培養基高壓滅菌后備用；
[0064]液體發酵條件:發酵溫度為從開始到第48小時為28_30°C，48到第72小時為28-300C，第96小時到第7天為22-25°C。
[0065]實施例1:
[0066]復合微生物菌劑的制備(供試菌劑I)
[0067]將預備實施例1所制備的短小芽孢桿菌發酵液與預備實施例2所制備的淡紫擬青霉發酵液混合在一起，得到混合菌劑；其中，混合菌劑中兩種菌劑的孢子濃度分別控制為:短小芽孢桿菌孢子個數為1.0X107個/ml，淡紫擬青霉的孢子個數為1.0X107個/ml。
[0068]實施例2:
[0069]復合微生物菌劑的制備(供試菌劑2)
[0070]將預備實施例1所制備的短小芽孢桿菌發酵液與預備實施例2所制備的淡紫擬青霉發酵液混合在一起，得到混合菌劑；其中，混合菌劑中兩種菌劑的孢子濃度分別控制為:短小芽孢桿菌孢子個數為1.0X107個/ml，淡紫擬青霉的孢子個數為1.0X109個/ml。
[0071]實施例3:
[0072]復合微生物菌劑的制備(供試菌劑3)
[0073]將預備實施例1所制備的短小芽孢桿菌發酵液與預備實施例2所制備的淡紫擬青霉發酵液混合在一起，得到混合菌劑；其中，混合菌劑中兩種菌劑的孢子濃度分別控制為:短小芽孢桿菌孢子個數為1.0X108個/ml，淡紫擬青霉的孢子個數為1.0X109個/ml。
[0074]實施例4:
[0075]復合微生物菌劑的制備(供試菌劑4)
[0076]將預備實施例1所制備的短小芽孢桿菌發酵液與預備實施例2所制備的淡紫擬青霉發酵液混合在一起，得到混合菌劑；其中，混合菌劑中兩種菌劑的孢子濃度分別控制為:短小芽孢桿菌孢子個數為1.0X108個/ml，淡紫擬青霉的孢子個數為1.0X107個/ml。
[0077]實施例5:
[0078]復合微生物菌劑的制備(供試菌劑5)
[0079]將預備實施例1所制備的短小芽孢桿菌發酵液與預備實施例2所制備的淡紫擬青霉發酵液混合在一起，得到混合菌劑；其中，混合菌劑中兩種菌劑的孢子濃度分別控制為:短小芽孢桿菌孢子個數為1.0X108個/ml，淡紫擬青霉的孢子個數為1.0X108個/ml。
[0080]實施例6:
[0081]復合微生物菌劑的制備(供試菌劑6)
[0082]將預備實施例1所制備的短小芽孢桿菌發酵液與預備實施例2所制備的淡紫擬青霉發酵液混合在一起，得到混合菌劑；其中，混合菌劑中兩種菌劑的孢子濃度分別控制為:短小芽孢桿菌孢子個數為1.0X107個/ml，淡紫擬青霉的孢子個數為1.0X108個/ml。
[0083]實施例7:
[0084]復合微生物菌劑的制備(供試菌劑7)
[0085]將預備實施例1所制備的短小芽孢桿菌發酵液與預備實施例2所制備的淡紫擬青霉發酵液混合在一起，得到混合菌劑；其中，混合菌劑中兩種菌劑的孢子濃度分別控制為:短小芽孢桿菌孢子個數為1.0X109個/ml，淡紫擬青霉的孢子個數為1.0X109個/ml。
[0086]實施例8:
[0087]復合微生物菌劑的制備(供試菌劑8)
[0088]將預備實施例1所制備的短小芽孢桿菌發酵液與預備實施例2所制備的淡紫擬青霉發酵液混合在一起，得到混合菌劑；其中，混合菌劑中兩種菌劑的孢子濃度分別控制為:短小芽孢桿菌孢子個數為1.0X109個/ml，淡紫擬青霉的孢子個數為1.0X108個/ml。
[0089]實施例9:
[0090]復合微生物菌劑的制備(供試菌劑9)
[0091]將預備實施例1所制備的短小芽孢桿菌發酵液與預備實施例2所制備的淡紫擬青霉發酵液混合在一起，得到混合菌劑；其中，混合菌劑中兩種菌劑的孢子濃度分別控制為:短小芽孢桿菌孢子個數為1.0X101(I個/ml，淡紫擬青霉的孢子個數為LOXIOici個/ml。
[0092]實施例10:
[0093]復合微生物菌劑的制備(供試菌劑10)
[0094]將預備實施例1所制備的短小芽孢桿菌發酵液與預備實施例2所制備的淡紫擬青霉發酵液混合在一起，得到混合菌劑；其中，混合菌劑中兩種菌劑的孢子濃度分別控制為:短小芽孢桿菌孢子個數為1.0X1011個/ml，淡紫擬青霉的孢子個數為1.0X109個/ml。
[0095]實施例11:
[0096]復合微生物菌劑的制備(供試菌劑11)
[0097]將預備實施例1所制備的短小芽孢桿菌發酵液與預備實施例2所制備的淡紫擬青霉發酵液混合在一起，得到混合菌劑；其中，混合菌劑中兩種菌劑的孢子濃度分別控制為:短小芽孢桿菌孢子個數為1.0X109個/ml，淡紫擬青霉的孢子個數為LOXIOici個/ml。
[0098]實施例12:
[0099]復合微生物菌劑的制備(供試菌劑12)
[0100]將預備實施例1所制備的短小芽孢桿菌發酵液與預備實施例2所制備的淡紫擬青霉發酵液混合在一起，得到混合菌劑；其中，混合菌劑中兩種菌劑的孢子濃度分別控制為:短小芽孢桿菌孢子個數為1.0X109個/ml，淡紫擬青霉的孢子個數為1.0X106個/ml。
[0101]實施例13:
[0102]復合微生物菌劑的制備(供試菌劑13 )
[0103]將預備實施例1所制備的短小芽孢桿菌發酵液與預備實施例2所制備的淡紫擬青霉發酵液混合在一起，得到混合菌劑；其中，混合菌劑中兩種菌劑的孢子濃度分別控制為:短小芽孢桿菌孢子個數為1.0X107個/ml，淡紫擬青霉的孢子個數為LOXIOici個/ml。
[0104]實施例14:
[0105]復合微生物菌劑的制備(供試菌劑14)[0106]將預備實施例1所制備的短小芽孢桿菌發酵液與預備實施例2所制備的淡紫擬青霉發酵液混合在一起，得到混合菌劑；其中，混合菌劑中兩種菌劑的孢子濃度分別控制為:短小芽孢桿菌孢子個數為1.0X108個/ml，淡紫擬青霉的孢子個數為LOXIOici個/ml。
[0107]實施例15:
[0108]復合微生物菌劑的制備(供試菌劑15)
[0109]將預備實施例1所制備的短小芽孢桿菌發酵液與預備實施例2所制備的淡紫擬青霉發酵液混合在一起，得到混合菌劑；其中，混合菌劑中兩種菌劑的孢子濃度分別控制為:短小芽孢桿菌孢子個數為1.0X101(I個/ml，淡紫擬青霉的孢子個數為1.0X109個/ml。
[0110]實施例16:
[0111]復合微生物菌劑的制備(供試菌劑16)
[0112]將預備實施例1所制備的短小芽孢桿菌發酵液與預備實施例2所制備的淡紫擬青霉發酵液混合在一起，得到混合菌劑；其中，混合菌劑中兩種菌劑的孢子濃度分別控制為:短小芽孢桿菌孢子個數為1.0X101(I個/ml，淡紫擬青霉的孢子個數為1.0X107個/ml。
[0113]實施例17:
[0114]復合微生物菌劑的制備(供試菌劑17)
[0115]將預備實施例1所制備的短小芽孢桿菌發酵液與預備實施例2所制備的淡紫擬青霉發酵液混合在一起，得到混合菌劑；其中，混合菌劑中兩種菌劑的孢子濃度分別控制為:短小芽孢桿菌孢子個數為1.0X 106個/ml，淡紫擬青霉的孢子個數為1.0X106個/ml。
[0116]實施例18:
[0117]復合微生物菌劑的制備(供試菌劑18)
[0118]將預備實施例1所制備的短小芽孢桿菌發酵液與預備實施例2所制備的淡紫擬青霉發酵液混合在一起，得到混合菌劑；其中，混合菌劑中兩種菌劑的孢子濃度分別控制為:短小芽孢桿菌孢子個數為1.0X105個/ml，淡紫擬青霉的孢子個數為1.0X105個/ml。
[0119]實施例19:
[0120]復合微生物菌劑的制備(供試菌劑19)
[0121]將預備實施例1所制備的短小芽孢桿菌發酵液與預備實施例2所制備的淡紫擬青霉發酵液混合在一起，得到混合菌劑；其中，混合菌劑中兩種菌劑的孢子濃度分別控制為:短小芽孢桿菌孢子個數為1.0X106個/ml，淡紫擬青霉的孢子個數為1.0X107個/ml。
[0122]實施例20:
[0123]復合微生物菌劑的制備(供試菌劑20)
[0124]將預備實施例1所制備的短小芽孢桿菌發酵液與預備實施例2所制備的淡紫擬青霉發酵液混合在一起，得到混合菌劑；其中，混合菌劑中兩種菌劑的孢子濃度分別控制為:短小芽孢桿菌孢子個數為1.0X105個/ml，淡紫擬青霉的孢子個數為1.0X109個/ml。
[0125]實施例21:
[0126]復合微生物菌劑的制備(供試菌劑21)
[0127]將預備實施例1所制備的短小芽孢桿菌發酵液與預備實施例2所制備的淡紫擬青霉發酵液混合在一起，得到混合菌劑；其中，混合菌劑中兩種菌劑的孢子濃度分別控制為:短小芽孢桿菌孢子個數為1.0X106個/ml，淡紫擬青霉的孢子個數為LOXIOici個/ml。
[0128]實施例22:[0129]復合微生物菌劑的制備(供試菌劑22)
[0130]將預備實施例1所制備的短小芽孢桿菌發酵液與預備實施例2所制備的淡紫擬青霉發酵液混合在一起，得到混合菌劑；其中，混合菌劑中兩種菌劑的孢子濃度分別控制為:短小芽孢桿菌孢子個數為1.0X106個/ml，淡紫擬青霉的孢子個數為1.0X1011個/ml。
[0131]實施例23:
[0132]復合微生物菌劑的制備(供試菌劑23)
[0133]將預備實施例1所制備的短小芽孢桿菌發酵液與預備實施例2所制備的淡紫擬青霉發酵液混合在一起，得到混合菌劑；其中，混合菌劑中兩種菌劑的孢子濃度分別控制為:短小芽孢桿菌孢子個數為1.0X105個/ml，淡紫擬青霉的孢子個數為1.0X107個/ml。
[0134]實施例24:
[0135]復合微生物菌劑的制備(供試菌劑24)
[0136]將預備實施例1所制備的短小芽孢桿菌發酵液與預備實施例2所制備的淡紫擬青霉發酵液混合在一起，得到混合菌劑；其中，混合菌劑中兩種菌劑的孢子濃度分別控制為:短小芽孢桿菌孢子個數為1.0X105個/ml，淡紫擬青霉的孢子個數為1.0X108個/ml。
[0137]實施例25:
[0138]復合微生物菌劑的 制備(供試菌劑25)
[0139]將預備實施例1所制備的短小芽孢桿菌發酵液與預備實施例2所制備的淡紫擬青霉發酵液混合在一起，得到混合菌劑；其中，混合菌劑中兩種菌劑的孢子濃度分別控制為:短小芽孢桿菌孢子個數為1.0X105個/ml，淡紫擬青霉的孢子個數為LOXIOici個/ml。
[0140]實施例26:
[0141]復合微生物菌劑的制備(供試菌劑26)
[0142]將預備實施例1所制備的短小芽孢桿菌發酵液與預備實施例2所制備的淡紫擬青霉發酵液混合在一起，得到混合菌劑；其中，混合菌劑中兩種菌劑的孢子濃度分別控制為:短小芽孢桿菌孢子個數為1.0X105個/ml，淡紫擬青霉的孢子個數為1.0X1011個/ml。
[0143]實施例27:
[0144]復合微生物菌劑的制備(供試菌劑27)
[0145]將預備實施例1所制備的短小芽孢桿菌發酵液與預備實施例2所制備的淡紫擬青霉發酵液混合在一起，得到混合菌劑；其中，混合菌劑中兩種菌劑的孢子濃度分別控制為:短小芽孢桿菌孢子個數為1.0X105個/ml，淡紫擬青霉的孢子個數為1.0X1012個/ml。
[0146]實施例28:
[0147]復合微生物菌劑的制備(供試菌劑28)
[0148]將預備實施例1所制備的短小芽孢桿菌發酵液與預備實施例2所制備的淡紫擬青霉發酵液混合在一起，得到混合菌劑；其中，混合菌劑中兩種菌劑的孢子濃度分別控制為:短小芽孢桿菌孢子個數為1.0X107個/ml，淡紫擬青霉的孢子個數為1.0X105個/ml。
[0149]實施例29:
[0150]復合微生物菌劑的制備(供試菌劑29)
[0151]將預備實施例1所制備的短小芽孢桿菌發酵液與預備實施例2所制備的淡紫擬青霉發酵液混合在一起，得到混合菌劑；其中，混合菌劑中兩種菌劑的孢子濃度分別控制為:短小芽孢桿菌孢子個數為1.0X108個/ml，淡紫擬青霉的孢子個數為1.0X105個/ml。[0152]實施例30:
[0153]復合微生物菌劑的制備(供試菌劑30)
[0154]將預備實施例1所制備的短小芽孢桿菌發酵液與預備實施例2所制備的淡紫擬青霉發酵液混合在一起，得到混合菌劑；其中，混合菌劑中兩種菌劑的孢子濃度分別控制為:短小芽孢桿菌孢子個數為1.0X109個/ml，淡紫擬青霉的孢子個數為1.0X105個/ml。
[0155]實施例31:
[0156]復合微生物菌劑的制備(供試菌劑31)
[0157]將預備實施例1所制備的短小芽孢桿菌發酵液與預備實施例2所制備的淡紫擬青霉發酵液混合在一起，得到混合菌劑；其中，混合菌劑中兩種菌劑的孢子濃度分別控制為:短小芽孢桿菌孢子個數為1.0X101(I個/ml，淡紫擬青霉的孢子個數為1.0X105個/ml。
[0158]實施例32:
[0159]復合微生物菌劑的制備(供試菌劑32)
[0160]將預備實施例1所制備的短小芽孢桿菌發酵液與預備實施例2所制備的淡紫擬青霉發酵液混合在一起，得到混合菌劑；其中，混合菌劑中兩種菌劑的孢子濃度分別控制為:短小芽孢桿菌孢子個數為1.0X1011個/ml，淡紫擬青霉的孢子個數為1.0X105個/ml。
[0161]實施例33:
[0162]復合微生物菌劑的 制備(供試菌劑33)
[0163]將預備實施例1所制備的短小芽孢桿菌發酵液與預備實施例2所制備的淡紫擬青霉發酵液混合在一起，得到混合菌劑；其中，混合菌劑中兩種菌劑的孢子濃度分別控制為:短小芽孢桿菌孢子個數為1.0X107個/ml，淡紫擬青霉的孢子個數為1.0X106個/ml。
[0164]實施例34:
[0165]復合微生物菌劑的制備(供試菌劑34)
[0166]將預備實施例1所制備的短小芽孢桿菌發酵液與預備實施例2所制備的淡紫擬青霉發酵液混合在一起，得到混合菌劑；其中，混合菌劑中兩種菌劑的孢子濃度分別控制為:短小芽孢桿菌孢子個數為1.0X108個/ml，淡紫擬青霉的孢子個數為1.0X106個/ml。
[0167]實施例35:
[0168]復合微生物菌劑的制備(供試菌劑35)
[0169]將預備實施例1所制備的短小芽孢桿菌發酵液與預備實施例2所制備的淡紫擬青霉發酵液混合在一起，得到混合菌劑；其中，混合菌劑中兩種菌劑的孢子濃度分別控制為:短小芽孢桿菌孢子個數為1.0X109個/ml，淡紫擬青霉的孢子個數為1.0X107個/ml。
[0170]實施例36:
[0171]復合微生物菌劑的制備(供試菌劑36)
[0172]將預備實施例1所制備的短小芽孢桿菌發酵液與預備實施例2所制備的淡紫擬青霉發酵液混合在一起，得到混合菌劑；其中，混合菌劑中兩種菌劑的孢子濃度分別控制為:短小芽孢桿菌孢子個數為1.0X101(I個/ml，淡紫擬青霉的孢子個數為1.0X106個/ml。
[0173]實施例37:
[0174]復合微生物菌劑的制備(供試菌劑37)
[0175]將預備實施例1所制備的短小芽孢桿菌發酵液與預備實施例2所制備的淡紫擬青霉發酵液混合在一起，得到混合菌劑；其中，混合菌劑中兩種菌劑的孢子濃度分別控制為:短小芽孢桿菌孢子個數為1.0X1011個/ml，淡紫擬青霉的孢子個數為1.0X106個/ml。
[0176]實施例38:
[0177]復合微生物菌劑的制備(供試菌劑38)
[0178]將預備實施例1所制備的短小芽孢桿菌發酵液與預備實施例2所制備的淡紫擬青霉發酵液混合在一起，得到混合菌劑；其中，混合菌劑中兩種菌劑的孢子濃度分別控制為:短小芽孢桿菌孢子個數為0.5X IO8個/ml，淡紫擬青霉的孢子個數為0.5X IO8個/ml。
[0179]實施例39:
[0180]復合微生物菌劑的制備(供試菌劑39)
[0181]將預備實施例1所制備的短小芽孢桿菌發酵液與預備實施例2所制備的淡紫擬青霉發酵液混合在一起，得到混合菌劑；其中，混合菌劑中兩種菌劑的孢子濃度分別控制為:短小芽孢桿菌孢子個數為1.0X1012個/ml，淡紫擬青霉的孢子個數為1.0X1012個/ml。
[0182]實施例40:
[0183]復合微生物菌劑的制備(供試菌劑40)
[0184]將預備實施例1所制備的短小芽孢桿菌發酵液與預備實施例2所制備的淡紫擬青霉發酵液混合在一起，得到混合菌劑；其中，混合菌劑中兩種菌劑的孢子濃度分別控制為:短小芽孢桿菌孢子個數為0.5X IO9個/ml，淡紫擬青霉的孢子個數為0.5X IO9個/ml。
[0185]實施例41:
[0186]復合微生物菌劑的制備(供試菌劑41)
[0187]將預備實施例1所制備的短小芽孢桿菌發酵液與預備實施例2所制備的淡紫擬青霉發酵液混合在一起，得到混合菌劑；其中，混合菌劑中兩種菌劑的孢子濃度分別控制為:短小芽孢桿菌孢子個數為0.5X 101°個/ml，淡紫擬青霉的孢子個數為0.5X 101°個/ml。
[0188]實施例42:
[0189]復合微生物菌劑的制備(供試菌劑42)
[0190]將預備實施例1所制備的短小芽孢桿菌發酵液與預備實施例2所制備的淡紫擬青霉發酵液混合在一起，得到混合菌劑；其中，混合菌劑中兩種菌劑的孢子濃度分別控制為:短小芽孢桿菌孢子個數為0.5X IO8個/ml，淡紫擬青霉的孢子個數為0.5X IO8個/ml。
[0191]實施例43:
[0192]復合微生物菌劑的制備(供試菌劑43)
[0193]將預備實施例1所制備的短小芽孢桿菌發酵液與預備實施例2所制備的淡紫擬青霉發酵液混合在一起，得到混合菌劑；其中，混合菌劑中兩種菌劑的孢子濃度分別控制為:短小芽孢桿菌孢子個數為0.5X IO9個/ml，淡紫擬青霉的孢子個數為0.5X 101°個/ml。
[0194]實施例44:
[0195]復合微生物菌劑的制備(供試菌劑44)
[0196]將預備實施例1所制備的短小芽孢桿菌發酵液與預備實施例2所制備的淡紫擬青霉發酵液混合在一起，得到混合菌劑；其中，混合菌劑中兩種菌劑的孢子濃度分別控制為:短小芽孢桿菌孢子個數為1.0X1011個/ml，淡紫擬青霉的孢子個數為1.0X1011個/ml。
[0197]1.1根結線蟲的分離和收集
[0198]2011年至2012年間，在四川省蒲江縣壽安鎮花生地采集花生土樣，使用隨機采樣法，采集長有根結的根及其周圍的病土，病土采至土壤表層5-20cm處，每個地塊隨機采5個點，混勻后放入同一個采集袋內，做好標記。將采集的標樣帶回實驗室，在溫室以單卵塊接種于易感病花生上。
[0199]雌蟲的分離和收集:單卵塊繁殖60d后，取被侵染的花生根，在體視顯微鏡下將根結表皮用鑷子或針尖輕輕撥開，剖面上乳白色的光滑球狀物即為根結線蟲的雌蟲，用解剖針輕輕撥出，放入水中待用。
[0200]二齡幼蟲的分離和收集:單卵塊繁殖60d后，采集被侵染的花生根清水洗凈，剪成3cm小段，裝入500ml三角瓶中，配制I % (v/v)次氯酸鈉溶液，在上述三角瓶中倒入200-300ml次氯酸鈉溶液，封口后猛搖3min，立即用蒸餾水沖洗數次，先后過200目和500目篩，用蒸餾水反復沖洗留在500目篩子上的卵，最后用無菌水沖洗收集于無菌的小燒杯。
[0201]將上述的卵放于26°C無菌培養箱中孵化3d，得到根結線蟲的二齡幼蟲。1.2小區試驗
[0202]1.2.1供試菌劑
[0203]試驗菌劑:實施例1-47所制備的復合微生物菌劑，按次序分別編號為供試菌劑1-47 ；
[0204]對照菌劑:
[0205]對照菌劑1:短小芽孢桿菌發酵液，孢子濃度為1.X IO8個/ml ；
[0206]對照菌劑2:短小芽孢桿菌發酵液，孢子濃度為2.0X IO7個/ml ；
[0207]對照菌劑3:短小芽孢桿菌發酵液，孢子濃度為1.0X IO9個/ml ；
[0208]對照菌劑4:短小芽孢桿菌發酵液，孢子濃度為1.0X 101°個/ml ；
[0209]對照菌劑5:短小芽孢桿菌發酵液，孢子濃度為1.0X IO11個/ml ；
[0210]對照菌劑6:短小芽孢桿菌發酵液，孢子濃度為1.0X IO12個/ml ；
[0211]對照菌劑7:淡紫擬青霉發酵液，孢子濃度為1.0X IO8個/ml ；
[0212]對照菌劑8:淡紫擬青霉發酵液，孢子濃度為1.0X IO7個/ml ；
[0213]對照菌劑9:淡紫擬青霉發酵液，孢子濃度為1.0X IO9個/ml ；
[0214]對照菌劑10:淡紫擬青霉發酵液，孢子濃度為1.0X 101°個/ml ；
[0215]對照菌劑11:淡紫擬青霉發酵液，孢子濃度為1.0X IO11個/ml ；
[0216]對照菌劑12:淡紫擬青霉發酵液，孢子濃度為1.0X IO12個/ml ；
[0217]1.2.2試驗作物
[0218]四川省蒲江縣壽安鎮花生地種植的花生。
[0219]1.2.3試驗設計
[0220]實驗地點設在線蟲蟲量大且均勻的四川省蒲江縣壽安鎮花生種植區種植，藥前調查根結線蟲二齡幼蟲蟲口在每IOOg 土壤20-30頭。實驗分為57組，其中44組為試驗組，12組為對照組，I組為清水對照組，具體實驗設計如下:
[0221]試驗1-44組分別采用供試菌劑1-44 ；
[0222]對照1-12組分別采用對照菌劑1-12進行處理。
[0223]清水對照:采用清水進行處理(不施加任何防治線蟲的藥劑)；
[0224]每個處理3個重復(分三列，每列100株花生)，各處理隨機排列。
[0225]8月中旬至9月初進行菌劑小區試驗，在花生根部四周扒開根表面10cm厚、半徑為50cm的土層，將I毫升的原菌劑用水稀釋后采用噴霧方式將稀釋后的菌劑均勻噴灑在挖好的坑中，使菌劑分布在根圍，再使扒開土壤復位。施藥50d后調查花生樹根結指數(病情指數)和土壤中二齡幼蟲數，評價防治效果。
[0226]清水對照組用清水代理稀釋的菌劑，不作防線蟲處理。
[0227]根結指數(病情指數)計算方法:挖出每處理花生根，按照根結線蟲分級調查指標進行調查，根結嚴重度分0-10級，分級標準參照Benjamin等(Benjamin D,Grover C BJ.Comparison of compatible and incompatible response of potato toMeloidogyneincognita.Journal of Nematology，1987，19218-221)。根結指數計算公式如
下:
[0228]
【權利要求】
1.一種防治根結線蟲的復合微生物菌劑，其特征在于，該復合微生物菌劑包括淡紫擬青霉(Penicillium Iilacinum)發酵液和短小芽抱桿菌(Bacillus pumilus)發酵液。
2.根據權利要求1所述的復合微生物菌劑，其特征在于:每毫升復合微生物菌劑中淡紫擬青霉的孢子個數為Loxio8-Loxioki個，短小芽孢桿菌的孢子個數為1.0XlO8-L OX 101° 個。
3.根據權利要求1所述的復合微生物菌劑，其特征在于:每毫升復合微生物菌劑中淡紫擬青霉的孢子個數為1.0X109個，短小芽孢桿菌的孢子個數為1.0X109個。
4.按照權利要求1-3任意一項權利要求所述的復合微生物菌劑，其特征在于:將復合微生物菌劑制備成液體生防制劑或固體生防制劑。
5.按照權利要求4所述的復合微生物菌劑，其特征在于，其特征在于:所述的生防制劑包括顆粒制劑、粉劑或液體制劑。
6.權利要求1-3任何一項所述的復合微生物菌劑的應用，其特征在于:該復合微生物菌劑應用于防治根結線蟲。
7. 按照權利要求6所述的應用，其特征在于:所述的根結線蟲為花生根結線蟲。
【文檔編號】A01N63/02GK103461389SQ201310418337
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年9月13日 優先權日:2013年9月13日
【發明者】張繼甫 申請人:成都天星農業科技有限公司