以誘導獨一味種子萌發幼苗為外植體的組織培養試管苗獲得方法
【專利摘要】本發明公開了一種以誘導獨一味種子萌發幼苗為外植體的組織培養試管苗獲得方法,該方法是先將獨一味種子經不同濃度GA3誘導培養，再經多菌靈噴施，經外植體消毒，接種于MS+6-BA0.5mg·L-1+NAA?1.0mg·L-1+蔗糖30g·L-1+瓊脂7.0g·L-1中進行初代愈傷組織誘導培養，培養30d后，外植體表面即長出白色或黃白色的質地緊密的愈傷組織。經愈傷組織經芽誘導培養和根誘導培養后，形成組織培養試管苗。該方法很好的解決了，以獨一味成株為外植體時，污染率大，不易產生無菌苗的問題；同時建立了在低海拔地區獨一味有性生殖受阻，采用組織培養獲得試管種苗的方法。
【專利說明】以誘導獨一味種子萌發幼苗為外植體的組織培養試管苗獲得方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種獨一味組織培養獲得試管苗的方法，特別是涉及一種以獨一味種子誘導苗為外植體的組織培養試管苗獲得方法。
【背景技術】
[0002]獨一味Lamiophlomis rotata (Benth.)Kudo,為唇形科,獨一味屬植物，該屬僅有獨一味一個種。主產西藏，青海，甘肅，四川西部及云南西北部；生于高原或高山上強度風化的碎石灘中或石質高山草甸、河灘地，海拔2700-4500米。具有典型高山植物特征，如植物矮，莖短，根系發達，葉片較大，貼地展開。這些特征與其生長環境為高寒缺氧、干旱風大、輻射強及晝夜溫差大等有關。
[0003]獨一味屬于傳統藏藥，民間用全草入藥，治跌打損傷、筋骨疼痛、氣滯閃腰、浮腫后流黃水、關節積黃水、骨松質發炎。此外據青海對大白鼠股動脈、肱動脈、頸動脈橫切斷止血試驗，認為本種有較好的止血效果。隨著野生獨一味的存儲量逐步降低，對獨一味的研究也越來越受到重視。對將獨一味引種到低海拔地區的研究工作也有部分開展。如金蘭等通過將獨一味根莖芽從海拔4300m的野生地移栽到海拔2366m和3100m的實驗基地后，對移栽地獨一味的花粉活力，花粉萌發及自然結束率進行了統計，結果發現獨一味移栽到較低海拔后花粉活力低，柱頭上無花粉萌發，自然結實率為O。因此，在低海拔地區對獨一味的種苗獲得，以植物組織培養方式更為可行。然后，獨一味成株莖短，約1cm，葉片大，具皺，密布絨毛。這些特征使采用獨一味成株為外植體時，滅菌獲得無菌苗難度很大。
【發明內容】
[0004]本發明的目的在于提供一種以誘導獨一味種子萌發幼苗為外植體的獨一味組織
培養試管苗獲得方法。
[0005]為達到上述目的，本發明采用的解決方法包括下列步驟:
[0006](I)選取當年收獲健康飽滿，具有活力的獨一味種子，播種于浸有GA3 50mg .l-1的濾紙上進行催芽，待幼苗長至約Icm后，，噴施一次800倍液的多菌靈進行植株的表面消毒殺菌預處理，然后收集幼苗。
[0007](2)先將作為外植體的獨一味幼苗用800倍多菌靈溶液侵泡30min，再用自來水沖洗Ih左右，，放入超凈工作臺內用濃度為75%的酒精消毒10s，無菌水沖洗3次，接著用濃度為0.1%的升萊消毒5min,最后用無菌水震蕩洗4~6次,用無菌濾紙吸干幼苗表面的水分備用;
[0008](3)在無菌條件下用手術刀在獨一味幼苗上劃出傷口，接種于愈傷組織誘導培養基:MS+6-BA 0.5mg.L-1+NAA 1.0mg.I/1+ 鹿糖 30g.I71+ 瓊脂 4.8g.L-1 中進行愈傷組織誘導，所采用的PH值為6.0，培養溫度20°C、光照時數10h/d、光照強度為1000~1500Lx，培養時間30d ；[0009](4)30d后，選取顏色黃綠、有瘤狀突起質地良好的愈傷組織作為外植體，接入叢生芽誘導培養基:MS+6_BA 1.0 -3.0mg.+NAA 0.1 -3mg *L:+ 鹿糖 30g *L:+ 瓊脂 4.8g *L 1中進行叢生芽的誘導，所采用的培養基pH值為6.0，培養溫度為20°C、光照時數12h/d、光照強度為1200-1800Lx，培養35d后，愈傷組織誘導分化出大量叢生芽。
[0010](5)根的誘導培養，待叢生芽長至2cm時，將叢生芽分成單芽，轉接到生根培養基:1/2MS+IBA 0.5mg ?T'+NAA 0.1mg.171+ 蔗糖 15g.171+ 瓊脂 4.8g.171，中誘導生根 20d 后，待不定根長至2-3cm時，即可移至高海拔地區溫室大棚內進行煉苗移栽。
[0011]采用上述方案，本發明以種子萌發苗為外植體，可以有效的降低外植體接種后的污染率，快速在低海拔地區獲得獨一味組織胚芽試管苗。
【具體實施方式】
[0012]以下結合具體實 施例，對本發明進行詳細說明。
[0013]實施例1
[0014](I)選取飽滿、有生命力的獨一味種子，用清水清洗后，陰干。放入浸透50g -L-1GAS的濾紙上，20°C培養，誘導萌發直到胚根和胚芽突破種皮長出，平均萌發率31.4%。長出后第4d，開始每日用800倍多菌靈噴施到平皿，連續噴施4d后，收集幼苗，用自來水沖洗干凈，然后陰干，再在超凈臺用濃度為75%的酒精消毒15s,接著用濃度為0.1%的升萊消毒5min,最后用無菌水震蕩洗5次，洗后用已滅菌的濾紙反復吸干幼苗表面的水分；
[0015](2)將消毒處理后的幼苗用無菌手術刀在子葉與莖交接處，劃出傷口，然后創面向下，接種于 MS+6-BA 0.5mg ? L_1+NAA 1.0mg ? I71+ 鹿糖 30g ? I71+ 瓊脂 7.0g ? L-1 中進行初代培養，所采用的pH 7.0，培養溫度20°C、每天光照8h、光照強度為1200Lx。培養時間30d，外植體普遍膨脹，長出白色和淡黃色的愈傷組織，統計其愈傷組織誘導率為58.2%。
[0016](3)選取初代培養后培養出的相對致密愈傷組織，將愈傷組織切分為Icm3大小塊狀，再將其接入芽誘導培養基MS+6-BA 2.0mg ? L—'+NAA 0.5mg ? L—1+蔗糖30g ? L—1+瓊脂
7.0g ? L—1中進行培養，所采用的培養基pH 7.0,培養溫度為20°C、每天光照10h、光照強度為1500Lx，培養35d后，愈傷組織誘導分化出芽，出芽率48.6%。
[0017](4)生根培養，將誘導出芽的植物體，轉接到生根培養基，1/2 MS+6-BA
1.0mg ? P+NAA 0.5mg ? L—1+鹿糖20g ? L—1+瓊脂7.0g ? L_S誘導培養20d后開始長出不定根，試管苗成苗率36.7%。
[0018]實施例2
[0019]將實施例1步驟(I)中的種子誘導成苗改為，種子經50mg/L GA3浸泡I天后，接到清水浸泡后的濾紙上，誘導萌發，平均萌發率42.2%。其它步驟同實施例1，誘導培養90d左右獲得組織培養試管苗，成苗率為37.1%。
[0020]應當理解的是，對本領域普通技術人員來說，可以根據上述說明加以改進或變換，而所有這些改進和變換都應屬于本發明所附權利要求的保護范圍。
【權利要求】
1.一種以誘導獨一味種子萌發幼苗為外植體的組織培養試管苗獲得方法，其特征在于包括如下步驟: (1)選取當年收獲健康飽滿，具有活力的獨一味種子，播種于浸有GA350mg -r1的濾紙上進行催芽，待幼苗長至約Icm后，，噴施一次800倍液的多菌靈進行植株的表面消毒殺菌預處理，然后收集幼苗； (2)先將作為外植體的獨一味幼苗用800倍多菌靈溶液侵泡30min，再用自來水沖洗Ih左右，，放入超凈工作臺內用濃度為75%的酒精消毒10s，無菌水沖洗3次，接著用濃度為.0.1%的升萊消毒5min,最后用無菌水震蕩洗4-6次,用無菌濾紙吸干幼苗表面的水分備用； (3)在無菌條件下用手術刀在獨一味幼苗上劃出傷口，接種于愈傷組織誘導培養基:MS+6-BA 0.5mg.L-1+NAA 1.0mg ? I71+ 鹿糖 30g ? I71+ 瓊脂 4.8g ? L-1 中進行愈傷組織誘導，所采用的PH 值為6.0，培養溫度20°C、光照時數10h/d、光照強度為1000-1500Lx，培養時間30d ； (4)30d后，選取顏色黃綠、有瘤狀突起質地良好的愈傷組織作為外植體，接入叢生芽誘導培養基:MS+6_BA 1.0 -3.0mg ? +NAA 0.1 -3mg.L1+ 鹿糖 30g.L1+ 瓊脂 4.8g ? L 1 中進行叢生芽的誘導，所采用的培養基PH值為6.0，培養溫度為20°C、光照時數12h/d、光照強度為1200-1800Lx，培養35d后，愈傷組織誘導分化出大量叢生芽； (5)根的誘導培養，待叢生芽長至2cm時，將叢生芽分成單芽，轉接到生根培養基:1/2MS+IBA 0.5mg ?T'+NAA 0.1mg.171+ 蔗糖 15g.171+ 瓊脂 4.8g.171，中誘導生根 20d 后，待不定根長至2-3cm時，即可移至高海拔地區溫室大棚內進行煉苗移栽。
【文檔編號】A01H4/00GK103444551SQ201310436768
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年9月23日 優先權日:2013年9月23日
【發明者】張玨, 牟蘭, 楊軼浠, 尹歡, 何詩虹, 郭翠平, 阮利霞 申請人:成都大學