一種誘導川貝母胚狀體產生的方法
【專利摘要】本發明公開了一種誘導川貝母胚狀體產生的方法，屬于生物【技術領域】。該方法選取川貝母植株的幼嫩葉鞘為外植體，通過消毒后進行愈傷組織誘導，將愈傷組織接入MS+頭孢噻肟鈉培養基中培養50天后愈傷組織表面產生有胚狀體，再將胚狀體以1～3個為1組切下，接入其快速生長培養基MS+6-BA0.1～1mg·L-1+頭孢噻肟鈉100～450mg·L-1中，在培養溫度為15～25℃、每天光照6～20h、光照強度為800～2500lx的培養條件下培養60天后，胚狀體可生長為綠色的川貝母小植株。本發明成功地利用了一定濃度的抗生素類化學因子誘導出川貝母胚狀體，為川貝母胚狀體的繁殖提供了一條新途徑。
【專利說明】一種誘導川貝母胚狀體產生的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物【技術領域】，具體地涉及一種誘導川貝母胚狀體產生的方法。
【背景技術】
[0002]川貝母(Fritillaria cirrhosa D.Don)是百合科多年生草本植物，以鱗莖入藥，生長在海拔3500nT4500m的高度，主產于四川、西藏、云南等省區。川貝母喜冷涼氣候條件，具有耐寒、喜濕、怕高溫、喜蔭蔽的特性。川貝母是重要的治療咳嗽的良藥，用于肺熱燥咳，干咳少痰，陰虛勞嗽，咯痰帶血等癥狀。川貝母植物生長在海拔2800-4700m的高山灌叢或草地中，主要依靠種子進行有性繁殖，但因其種子存在形態和生理后熟的特性，因此存在川貝母種苗培育難度大、栽種時間長和繁殖系數低等問題。
[0003]組織培養技術是一項重要的生物技術。當前川貝母組培技術都是通過利用川貝母的組織器官，選擇在不同生長素和細胞分裂素配比的情況下，經過誘導愈傷組織、芽分化、芽增殖和生根等多個環節獲得再生植株。如劉帆等人的《提高卷葉貝母植株再生率的研究》和高燕等人的《貝母愈傷組織的誘導及植株再生》研究。這種培養方法不僅存在誘導培養周期長、花費成本高的問題，而且也存在培養材料在長時間的培養過程中易發生細胞的變異，從而難以確保原物種的穩定性。而利用組織培養技術培育的胚狀體具有與植物受精卵形成合子胚相似的結構，不僅能快速、大量地獲得川貝母的再生植株，而且由于胚狀體一般都是起源于單個細胞，因此，培育出的川貝母胚狀體都具有遺傳背景上的一致性，對于開展川貝母植物的細胞分化和形態建成過程中各種生理生化的變化，結構變化以及基因表達等有關問題的研究具有重要的意義。當前還未見有通過采用培育川貝母胚狀體的方式獲得再生植株的報道。
【發明內容】
[0004]本發明的目的在于克 服現有技術的不足，提供一種誘導川貝母胚狀體產生的方法，該方法步驟簡單，可操作性 強，工藝穩定，適用于在工業化大生產中的廣泛應用。
[0005]本發明的目的是通過以下技術方案來實現的:
一種誘導川貝母胚狀體產生的方法，它包括以下步驟:
51:選取川貝母植株的幼嫩葉鞘為外植體，用流水沖洗干凈后，用濃度為70%~75%的酒精消毒30~60s,然后用濃度為0.1%~0.15%的升萊消毒4~1Omin,最后用無菌水震蕩洗3~6次，洗后用已滅菌的濾紙吸干材料表面的水分，將經過處理的葉鞘接種于培養基MS+6-BA 0.5 ~2.0mg.L:+2,4-D I ~2mg.L:+IAA 0.1 ~Img.L 1 + 鹿糖 20 ~60g.L 1+瓊脂5.0~7.0 g.L—1中進行培養，所采用的培養溫度16~20°C、每天光照6~14h、光照強度為1000~20001x的條件下誘導愈傷組織；
52:選取經過SI步驟處理的顏色為白色和淡黃色的愈傷組織，切成大小為0.5~
2.5cm2，然后接入MS+頭孢噻肟鈉200~600mg.11培養基中培養40~60天得到愈傷組織胚狀體；S3:將愈傷組織胚狀體以I~3個為I組切下，接入其快速生長培養基MS+6-BA 0.1~Img-1+頭孢噻肟鈉100~450mg -1中，所采用的培養溫度為15~25°C、每天光照6~20小時、光照強度為800~25001x的培養條件下培養50~60天后，得到川貝母小植株。
[0006]優選地，SI步驟中所述的外植體是位于莖基部端的幼嫩葉鞘。
[0007]優選地，SI步驟中所述的培養基為 MS+6-BA 0.58mg.L_1+2,4-D 1.5mg.L_1+IAA
0.5 mg.L-1 + 鹿糖 40g.L-1 + 瓊脂 6.0g.L'
[0008]優選地，SI步驟中所述的培養溫度為20°C、每天光照10h、光照強度為15001x。
[0009]優選地，S2步驟中所述的培養基為MS+頭孢噻肟鈉200~600mg.培養條件為溫度15~22°C、每天光照8~16h、光照強度為1500~25001x。
[0010]優選地，S2步驟中所述的培養基為MS+頭孢噻肟鈉400mg.L_\培養條件為溫度18°C、每天光照12h、光照強度為18001x的條件下培養50天。
[0011]優選地，S3步驟中所述的胚狀體按2個為I組切下，接入胚狀體快速生長培養基MS+6-BA 0.5mg.L-1+頭孢噻肟鈉300mg.L-1中，所采用培養溫度為22°C、每天光照16小時、光照強度為20001的培養條件下培養60天。
[0012]優選地，在完成S3步驟 培養后，打開培養瓶蓋在室內煉苗2~4天后，將川貝母小植株從培養瓶中取出，洗去植株上的培養基后，再將其移栽至松軟的土壤中生長。
[0013]本發明的有益效果在于:
本發明利用了一定濃度的抗生素類化學因子誘導出川貝母胚狀體，為當今利用生物技術培育植物胚狀體又提供了一條新途徑。該技術可操作性強，具有投入少、成本低、效率高的的優點，并對有效地解決川貝母種苗短缺問題具有重要現實意義。
【具體實施方式】
[0014]下面結合實施例對本發明做進一步的描述，本發明的保護范圍不局限于以下所述:
實施例1:一種誘導川貝母胚狀體產生的方法，它包括以下步驟:
51:選取川貝母植株的幼嫩葉鞘為外植體，用流水沖洗干凈后，用濃度為70%~75%的酒精消毒30~60s,然后用濃度為0.1%~0.15%的升萊消毒4~IOmin,最后用無菌水震蕩洗3~6次，洗后用已滅菌的濾紙吸干材料表面的水分，將經過處理的葉鞘接種于培養基MS+6-BA 0.5 ~2.0mg.L:+2,4-D I ~2mg.L:+IAA 0.1 ~Img.L 1 + 鹿糖 20 ~60g.L 1+瓊脂5.0~7.0 g.L—1中進行培養，所采用的培養溫度16~20°C、每天光照6~14h、光照強度為1000~2000 Ix的條件下誘導愈傷組織；
52:選取經過SI步驟處理的顏色為白色和淡黃色的愈傷組織，切成大小為0.5~
2.5cm2，然后接入MS+頭孢噻肟鈉200~600mg.1培養基中培養40~60天得到愈傷組織胚狀體；
53:將愈傷組織胚狀體以I~3個為I組切下，接入其快速生長培養基MS+6-BA0.1~Img.1+頭孢噻肟鈉100~450mg -1中，所采用的培養溫度為15~25°C、每天光照6~20小時、光照強度為800~25001x的培養條件下培養50~60天后，得到川貝母小植株。
[0015]實施例2:—種誘導川貝母胚狀體產生的方法，它包括以下步驟:
S1:選取川貝母植株的幼嫩葉鞘為外植體，用流水沖洗干凈后，用濃度為70%的酒精消毒30s，然后用濃度為0.1%的升汞消毒4min，最后用無菌水震蕩洗3次,洗后用已滅菌的濾紙吸干材料表面的水分，將經過處理的葉鞘接種于培養基MS+6-BA 0.5mg.L^+2,4-DImg.U1HAA 0.1mg.L-1 +蔗糖20g.L-1 +瓊脂5.0g.L-1中進行培養，所采用的培養溫度16°C、每天光照6h、光照強度為1000Ιχ的條件下誘導愈傷組織；
S2:選取經過SI步驟處理的顏色為白色和淡黃色的愈傷組織，切成大小為0.5~2.5cm2，然后接入MS+頭孢噻肟鈉200mg.L-1培養基中培養40天得到愈傷組織胚狀體；
S3:將愈傷組織胚狀體以2個為I組切下，接入其快速生長培養基MS+6-BA 0.1mg .L-1+頭孢噻肟鈉IOOmg .L-1中，所采用的培養溫度為15°C、每天光照6h、光照強度為SOOlx的培養條件下培養50天后，得到川貝母小植株。
[0016]實施例3:—種誘導川貝母胚狀體產生的方法，它包括以下步驟:
S1:選取川貝母植株的幼嫩葉鞘為外植體，用流水沖洗干凈后，用濃度為75%的酒精消毒60s，然后用濃度為0.15%的升汞消毒lOmin，最后用無菌水震蕩洗6次,洗后用已滅菌的濾紙吸干材料表面的水分，將經過處理的葉鞘接種于培養基MS+6-BA 2.0 mg.L^+2,4-D2mg.L_1+IAA Img.L—1 +鹿糖60g.L—1 +瓊脂7.0g.L—1中進行培養,所采用的培養溫度20°C、每天光照14h、光照強度為20001x的條件下誘導愈傷組織；
S2:選取經過SI步驟處理的顏色為白色和淡黃色的愈傷組織，切成大小為2.5cm2，然后接入MS+頭孢噻肟鈉600mg.L-1培養基中培養60天得到愈傷組織胚狀體；
S3:將愈傷組織胚狀體以3個為I組切下，接入其快速生長培養基MS+6-BA Img.L-1+頭孢噻肟鈉450mg .L-1中，所采用的培養溫度為25°C、每天光照20h、光照強度為25001x的培養條件下培養60天后，得到川貝母小植株。
[0017]實施例4:一種誘導川貝母胚狀體產生的方法，它包括以下步驟:
51:選取川貝母植株的幼嫩葉鞘為外植體，用流水沖洗干凈后，用濃度為70%~75%的酒精消毒30~60s，然后用濃度為0.1%~0.15%的升汞消毒6min，最后用無菌水震蕩洗5次，洗后用已滅菌的濾紙吸干材料表面的水分，將經過處理的葉鞘接種于培養基MS+6-BA0.58 mg.L_1+2,4-D 1.5mg.L_1+IAA 0.5mg.L-1 + 鹿糖 40g.L-1 + 瓊脂 6.0g.L-1 中進行培養，所采用的培養溫度20°C、每天光照10h、光照強度為15001x的條件下誘導愈傷組織；
52:選取經過SI步驟處理的顏色為白色和淡黃色的愈傷組織，切成大小為1.5cm2，然后接入MS+頭孢噻肟鈉400mg.L-1培養基中培養50天得到愈傷組織胚狀體，培養條件為18°C、每天光照12h、光照強度為20001x ；
53:將愈傷組織胚狀體以2個為I組切下，接入其快速生長培養基MS+6-BA 0.5mg .L-1+頭孢噻肟鈉350mg噸4中，所采用的培養溫度為22°C、每天光照16小時、光照強度為20001x的培養條件下培養60天后，得到川貝母小植株。
[0018]在完成S3步驟培養后，打開培養瓶蓋在室內煉苗2~4天后，將川貝母小植株從培養瓶中取出，洗去植株上的培養基后，再將其移栽至松軟的土壤中生長。
[0019]實施例5:—種誘導川貝母胚狀體產生的方法，它包括以下步驟:
S1:選取川貝母植株位于莖基部端的幼嫩葉鞘為外植體，用流水沖洗干凈后，用濃度為72%的酒精消毒40s，然后用濃度為0.12%~0.15%的升汞消毒5 min，最后用無菌水震蕩洗4次，洗后用已滅菌的濾紙吸干材料表面的水分，將經過處理的葉鞘接種于培養基MS+6-BA0.8 mg.L_1+2,4-D 1.2mg.L_1+IAA 0.6mg.L-1 + 鹿糖 30g.L-1 + 瓊脂 5.5g.L-1 中進行培養，所采用的培養溫度18°C、每天光照8h、光照強度為12001x的條件下誘導愈傷組織；
52:選取經過SI步驟處理的顏色為白色和淡黃色的愈傷組織，切成大小為0.5~
1.0cm2，然后接入MS+頭孢噻肟鈉300mg. 1培養基中培養45天得到愈傷組織胚狀體；
53:將愈傷組織胚狀體以2個為I組切下，接入其快速生長培養基MS+6-BA 0.6mg - 1+頭孢噻肟鈉250mg噸4中，所采用的培養溫度為18°C、每天光照10小時、光照強度為12001x的培養條件下培養55天后，得到川貝母小植株。
[0020]在完成S3步驟培養后，打開培養瓶蓋在室內煉苗3天后，將川貝母小植株從培養瓶中取出，洗去植株上的培養基后，再將其移栽至松軟的土壤中生長。
[0021]實施例6:—種誘導川貝母胚狀體產生的方法，它包括以下步驟:
S1:選取川貝母植株位于莖基部端的幼嫩葉鞘為外植體，用流水沖洗干凈后，用濃度為70%~75%的酒精消毒30~60s，然后用濃度為0.1%~0.15%的升汞消毒4~lOmin，最后用無菌水震蕩洗3~6次，洗后用已滅菌的濾紙吸干材料表面的水分，將經過處理的葉鞘接種于培養基 MS+6-BA 0.5 ~2.0mg.L:+2,4-D I ~2mg.L:+IAA 0.1 ~Img.L 1 + 鹿糖20~60g. 1 +瓊脂5.0~7.0g. 1中進行培養，所采用的培養溫度16~18°C、每天光照10~12h、光照強度為1500~18001x的條件下誘導愈傷組織；
52:選取經過SI步 驟處理的顏色為白色和淡黃色的愈傷組織，切成大小為1.0~
2.0cm2,然后接入MS+頭孢噻肟鈉300~400mg.L—1培養基中培養45~50天得到愈傷組織胚狀體；
53:將愈傷組織胚狀體以3個為I組切下，接入其快速生長培養基MS+6-BA 0.5~Img - 1+頭孢噻肟鈉300~400mg - 1中，所采用的培養溫度為18~20°C、每天光照10~15小時、光照強度為1500~20001x的培養條件下培養50~55天后，得到川貝母小植株。
[0022]在完成S3步驟培養后，打開培養瓶蓋在室內煉苗2~4天后，將川貝母小植株從培養瓶中取出，洗去植株上的培養基后，再將其移栽至松軟的土壤中生長。
[0023]實施例7:—種誘導川貝母胚狀體產生的方法，它包括以下步驟:
51:選取川貝母植株的幼嫩葉鞘為外植體，用流水沖洗干凈后，用濃度為70%~75%的酒精消毒50~60s,然后用濃度為0.1%~0.15%的升萊消毒6~8min,最后用無菌水震蕩洗5次，洗后用已滅菌的濾紙吸干材料表面的水分，將經過處理的葉鞘接種于培養基MS+6-BA 2.0 mg.L-1+2,4_D 2mg.L_1+IAA Img.L-1 + 鹿糖 50g.L-1 + 瓊脂 6.0g.L-1 中進行培養，所采用的培養溫度16~18°C、每天光照10~12h、光照強度為1800~2000 Ix的條件下誘導愈傷組織；
52:選取經過SI步驟處理的顏色為白色和淡黃色的愈傷組織，切成大小為0.5~
1.5cm2，然后接入MS+頭孢噻肟鈉400~500mg. 1培養基中培養40天得到愈傷組織胚狀體；
53:將愈傷組織胚狀體以3個為 I組切下，接入其快速生長培養基MS+6-BA 0.5~Img - 1+頭孢噻肟鈉400~450mg - 1中，所采用的培養溫度為20~25°C、每天光照15~20h、光照強度為2000~25001x的培養條件下培養50天后，得到川貝母小植株。
[0024]在完成S3步驟培養后，打開培養瓶蓋在室內煉苗2~4天后，將川貝母小植株從培養瓶中取出，洗去植株上的培養基后，再將其移栽至松軟的土壤中生長。
[0025]實施例8:一種誘導川貝母胚狀體產生的方法，它包括以下步驟:S1:選取川貝母植株位于莖基部端的幼嫩葉鞘為外植體，用流水沖洗干凈后，用濃度為70%~75%的酒精消毒30~60s，然后用濃度為0.1%~0.15%的升汞消毒4~lOmin，最后用無菌水震蕩洗3~6次，洗后用已滅菌的濾紙吸干材料表面的水分，將經過處理的葉鞘接種于培養基 MS+6-BA 0.58mg.L_1+2,4-D 1.5mg.L_1+IAA 0.5mg. 1 + 蔗糖 40g. 1 + 瓊脂6.0g.L-1中進行培養，所采用的培養溫度為20°C、每天光照10h、光照強度為15001x的條件下誘導愈傷組織；
52:選取經過SI步驟處理的顏色為白色和淡黃色的愈傷組織，切成大小為0.5~
2.5cm2,然后接入MS+頭孢噻肟鈉，400mg. 1培養基中培養，培養條件為溫度18°C、每天光照12h、光照強度為18001X的條件下培養50天，得到愈傷組織胚狀體；
53:將愈傷組織胚狀體以I~3個為I組切下，接入其快速生長培養基MS+6-BA 0.1~Img. 1+頭孢噻肟鈉100~450mg. 1中，所采用的培養溫度為18°C、每天光照12小時、光照強度為18001x的培養條件下培養50天后，得到川貝母小植株。
[0026]在完成S3步驟培養后，打開培養瓶蓋在室內煉苗3天后，將川貝母小植株從培養瓶中取出，洗去植株上的培養基后，再將其移栽至松軟的土壤中生長。
[0027]實施例9:一種誘導川貝母胚狀體產生的方法，它包括以下步驟:
51:選取川貝母植株的幼嫩葉鞘為外植體，用流水沖洗干凈后，用濃度為70%~75%的酒精消毒40~50s,然后用濃度為0.1%~0.15%的升萊消毒6~8 min,最后用無菌水震蕩洗5次，洗后用已滅菌的濾紙吸干材料表面的水分，將經過處理的葉鞘接種于培養基MS+6-BA 0.5 ~2.0mg.L:+2,4-D I ~2mg.L:+IAA 0.1 ~Img.L 1 + 鹿糖 20 ~60g.L 1+瓊脂5.0~7.0 g.L—1中進行培養，所采用的培養溫度16~20°C、每天光照6~14h、光照強度為1000~2000 Ix的條件下誘導愈傷組織；
52:選取經過SI步驟處理的顏色為白色和淡黃色的愈傷組織，切成大小為0.5~
2.5cm2，然后接入MS+頭孢噻肟鈉200~600mg. 1培養基中培養，培養條件為溫度18°C、每天光照12h、光照強度為18001X的條件下培養50天，得到愈傷組織胚狀體；
53:將愈傷組織胚狀體以I~3個為I組切下，接入其快速生長培養基MS+6-BA 0.1~Img- 1+頭孢噻肟鈉100~450mg -T1中，所采用的培養溫度為15~25°C、每天光照6~20小時、光照強度為800~25001x的培養條件下培養50~60天后，得到川貝母小植株。
[0028]在完成S3步驟培養后，打開培養瓶蓋在室內煉苗2~4天后，將川貝母小植株從培養瓶中取出，洗去植株上的培養基后，再將其移栽至松軟的土壤中生長。
[0029]實施例10:—種誘導川貝母胚狀體產生的方法，它包括以下步驟:
S1:選取川貝母植株位于莖基部端的幼嫩葉鞘為外植體，用流水沖洗干凈后，用濃度為70%~75%的酒精消毒30~60s，然后用濃度為0.1%~0.15%的升汞消毒4~lOmin，最后用無菌水震蕩洗3~6次，洗后用已滅菌的濾`紙吸干材料表面的水分，將經過處理的葉鞘接種于培養基 MS+6-BA 0.58mg.L_1+2,4-D 1.5mg.L_1+IAA 0.5mg. 1 + 蔗糖 40g. 1 + 瓊脂6.0g.L-1中進行培養，所采用的培養溫度為20°C、每天光照10h、光照強度為15001x的條件下誘導愈傷組織；
S2:選取經過SI步驟處理的顏色為白色和淡黃色的愈傷組織，切成大小為0.5~
2.5cm2,然后接入MS+頭孢噻肟鈉400mg.?Λ培養條件為溫度18°C、每天光照12h、光照強度為18001X的條件下培養50天，得到愈傷組織胚狀體；S3:將愈傷組織胚狀體以3個為I組切下，接入其快速生長培養基MS+頭孢噻肟鈉400mg.L_\培養條件為溫度22°C、每天光照16h、光照強度為20001x的條件下培養60天，得到川貝母小植株。
[0030]在完成S3步驟培養后，打開培養瓶蓋在室內煉苗2~4天后，將川貝母小植株從培養瓶中取出，洗去植株上的培養基后，再將其移栽至松軟的土壤中生長。
[0031]實施例11:一種誘導川貝母胚狀體產生的方法，它包括以下步驟:
S1:選取川貝母植株莖基部端的幼嫩葉鞘為外植體，用流水沖洗干凈后，放在超凈臺上用濃度為70%的酒精消毒40s，接著用濃度為0.1%的升汞消毒8min，最后用無菌水震蕩洗5次，洗后用已滅菌的濾紙吸干材料表面的水分，接種于MS+6-BA 0.8mg.^+2,4-D1.5mg.r+IAA 0.5mg.L-1 + 蔗糖 40g.L-1+ 瓊脂 6.0g.L-1 中，在培養溫度 20°C、每天光照10h、光照強度為15001x的條件下誘導愈傷組織；
52:選取顏色為白色和淡黃色、質地較緊密和生長速度快的愈傷組織，切成大小為2cm2的大小接入MS+頭孢噻肟鈉400mg. 1培養基中，在培養條件為溫度18°C、每天光照12h、光照強度為18001x的條件下培養50天后，可見在愈傷組織的表面有3~6個左右白色或黃白色、體積較大的園球形胚狀體產生；
53:將胚狀體按2個為I組切下，接入胚狀體快速生長培養基MS+6-BA 0.5mg. 1+頭孢噻肟鈉300mg - 1中，在培養溫度為22°C、每天光照16h、光照強度為20001x的培養條件下培養60天后，可見胚狀體快 速生長為健壯的川貝母綠色小植株。
[0032]選取生長在2cm以上的川貝母小植株，打開瓶蓋在室內煉苗3天后，將川貝母小植株從培養瓶中取出，并將川貝母小植株分割為單株后，洗去植株上的培養基，再將其移栽至松軟的土壤中生長。
[0033]下面通過實驗進一步說明本發明的效果:
實驗一:本發明川貝母胚狀體產生實驗
S1:選取川貝母植株莖基部端的幼嫩葉鞘為外植體，用流水沖洗干凈后，放在超凈臺上用濃度為70%的酒精消毒40s，接著用濃度為0.1%的升汞消毒8min，最后用無菌水震蕩洗5次，洗后用已滅菌的濾紙吸干材料表面的水分，接種于MS+6-BA 0.8mg.^+2,4-D1.5mg.r+IAA 0.5mg.L-1 + 蔗糖 40g.L-1+ 瓊脂 6.0g.L-1 中，在培養溫度 20°C、每天光照10h、光照強度為15001x的條件下誘導愈傷組織；
52:選取顏色為白色和淡黃色、質地較緊密和生長速度快的愈傷組織，切成大小為2cm2的大小接入MS+頭孢噻肟鈉400mg. 1培養基中，在培養條件為溫度18°C、每天光照12h、光照強度為18001x的條件下培養50天后，可見在愈傷組織的表面有3~6個左右白色或黃白色、體積較大的園球形胚狀體產生；
53:將胚狀體按2個為I組切下，接入胚狀體快速生長培養基MS+6-BA 0.5mg. 1+頭孢噻肟鈉300mg - 1中，在培養溫度為22°C、每天光照16h、光照強度為20001x的培養條件下培養60天后，可見胚狀體快速生長為健壯的川貝母綠色小植株。
[0034]選取生長 在 2cm以上的川貝母小植株，打開瓶蓋在室內煉苗3天后，將川貝母小植株從培養瓶中取出，并將川貝母小植株分割為單株后，洗去植株上的培養基，再將其移栽至松軟的土壤中生長。
[0035]實驗二:在實驗一 S2步驟中將誘導胚狀體產生的培養基改為MS+頭孢噻肟鈉200mg噸―1，其它步驟同實驗一；經50天培養后，在愈傷組織的表面上產生胚狀體數量較少，只有I~3個。
[0036]實驗三:在實驗一 S2步驟中將誘導胚狀體產生的培養基改為MS+頭孢噻肟鈉600mg噸―1，其它步驟同實驗一；經50天培養后，在愈傷組織的表面上產生胚狀體數量較多，有6~10個左右。但產生胚狀體的質量不佳，形狀均為細長的圓錐形，顏色也多為黃色，并伴有少量的褐化現象。
[0037]實驗四:在實驗一 S3步驟中，將胚狀體再生川貝母小植株的培養條件改為:培養溫度為15°C、每天光照6小時和光照強度為SOOlx的培養條件下培養，其它步驟同實驗一；經60天培養后，胚狀體再生川貝母小植株為綠黃色、較矮小。[0038]實驗五:在實驗一 S2步驟中改選為黃色、質地疏松的愈傷組織為外植體誘導胚狀體產生，其它步驟同實驗一；經50天培養后，可見在疏松愈傷組織的表面有形狀為細長錐形的胚狀體產生，但產生的胚狀體質量不佳，并伴有明顯的玻璃化現象，使得后期培養的川貝母小植株不能健康生長。
[0039]實驗六:將實驗一 S2步驟中，誘導胚狀體的培養基改為只選擇基本培養基MS0，而未加任何濃度的抗生素，其它步驟同實施例1 ;經50天培養后，發現愈傷組織只產生了少量的增殖，但未見有胚狀體產生。
[0040]實驗七:在實驗一 S3步驟中，胚狀體再生川貝母小植株的培養基改為MS+6-BA2mg.L-1+頭孢噻肟鈉600mg.L-1中，其它步驟同實施例1 ;經60天培養后，再生的川貝母小植株生長緩慢，形態矮小，并有部分出現褐化狀況。
[0041]實驗八:在實驗一 S3步驟中胚狀體再生川貝母小植株的培養條件改為在每天在無光照的條件下培養，其它步驟同實施例1 ;經60天培養后，胚狀體表現為自身體積明顯增大，但生長出的川貝母植株為矮小的黃化苗。
[0042]實驗九:在實驗一 S3步驟中，胚狀體再生川貝母小植株的培養條件改為，在培養溫度為26°C、每天光照24小時以上和光照強度為30001x的培養條件下培養60天后，盡管胚狀體抽苗較快，但抽出的川貝母植株多為細高狀，顏色也多為黃綠色、還伴有明顯的玻璃化現象產生。
[0043]本發明采用組織培養技術，以川貝母植株幼嫩葉鞘誘導的愈傷組織為培養材料，建立了由抗生素類化學因子誘導出川貝母胚狀體的快速繁殖技術，該研究為川貝母優良品種的培育和大量快速繁殖提供了新途徑。另外實施本發明方法，只需有簡單的植物組織培養設備即可進行，因此實用性強，培養成本降，可行性高，同時也為利用組織培養技術培育植物胚狀體又提供了一條新途徑。
【權利要求】
1.一種誘導川貝母胚狀體產生的方法，其特征在于:它包括以下步驟: S1:選取川貝母植株的幼嫩葉鞘為外植體，用流水沖洗干凈后，用濃度為70%~75%的酒精消毒30~60s,然后用濃度為0.1%~0.15%的升萊消毒4~IOmin,最后用無菌水震蕩洗3~6次，洗后用已滅菌的濾紙吸干材料表面的水分，將經過處理的葉鞘接種于培養基MS+6-BA 0.5 ~2.0mg *L:+2,4-D I ~2mg *L:+IAA 0.I ~Img *L 1 + 鹿糖 20 ~60g.L1+瓊脂5.0~7.0g.1中進行培養，所采用的培養溫度16~20°C、每天光照6~14h、光照強度為1000~20001x的條件下誘導愈傷組織； S2:選取經過SI步驟處理的顏色為白色和淡黃色的愈傷組織，切成大小為0.5~2.5cm2，然后接入MS+頭孢噻肟鈉200~600mg.1培養基中培養40~60天得到愈傷組織胚狀體； S3:將愈傷組織胚狀體以I~3個為I組切下，接入其快速生長培養基MS+6-BA 0.1~Img-1+頭孢噻肟鈉100~450mg -T1中，所采用的培養溫度為15~25°C、每天光照6~20小時、光照強度為800~25001x的培養條件下培養50~60天后，得到川貝母小植株。
2.根據權利要求1所述的一種誘導川貝母胚狀體產生的方法，其特征在于:S1步驟中所述的外植體是位于莖基部端的幼嫩葉鞘。
3.根據權利要求1所述的一種誘導川貝母胚狀體產生的方法，其特征在于:S1步驟中所述的培養基為 MS+6-BA 0.58mg.L:+2,4-D 1.5mg.L:+IAA 0.5mg.L 1 + 鹿糖 40g.L 1+ 瓊脂 6.0g.L'
4.根據權利要求1所述的一種誘導川貝母胚狀體產生的方法，其特征在于:S1步驟中所述的培養溫度為20°C、每天光照10h、光照強度為15001x。
5.根據權利要求1所述的一種誘導川貝母胚狀體產生的方法，其特征在于:S2步驟中所述的培養基為MS+頭孢噻肟鈉200~600mg.L—1，培養條件為溫度15~22°C、每天光照8~16h、光照強度為1500~25001x。
6.根據權利要求1所述的一種誘導川貝母胚狀體產生的方法，其特征在于:S2步驟中所述的培養基為MS+頭孢噻肟鈉400mg.L_\培養條件為溫度18°C、每天光照12h、光照強度為18001x的條件下培養50天。
7.根據權利要求1所述的一種誘導川貝母胚狀體產生的方法，其特征在于:S3步驟中所述的胚狀體按2個為I組切下，接入胚狀體快速生長培養基MS+6-BA 0.5mg -1+頭孢噻肟鈉300 mg.1中，所采用培養溫度為22°C、每天光照16小時、光照強度為20001x的培養條件下培養60天。
8.根據權利要求1所述的一種誘導川貝母胚狀體產生的方法，其特征在于:在完成S3步驟培養后，打開培養瓶蓋在室內煉苗2~4天后，將川貝母小植株從培養瓶中取出，洗去植株上的培養基后，再將其移栽至松軟的土壤中生長。
【文檔編號】A01H4/00GK103461137SQ201310436775
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年9月24日 優先權日:2013年9月24日
【發明者】薛剛, 王躍華, 余強, 王曉蓉 申請人:薛剛