一種快速誘導川貝母鱗莖產生的方法
【專利摘要】本發明公開了一種快速誘導川貝母鱗莖產生的方法，屬于生物【技術領域】。本發明方法選用組培鱗莖，接入MS+KT1～3mg·L-1+NAA0.1～1mg·L-1培養基中，在培養溫度為12～18℃和無光照條件下培養30～40天后，獲得由組培鱗莖產生的川貝母肉質化幼葉，然后將川貝母肉質化幼葉接入誘導鱗莖產生的培養基中培養，從而實現了從川貝母肉質幼葉上直接再生川貝母鱗莖，為川貝母藥用部位的快速大量地產生提供了一條新途徑。該方法步驟簡單，可操作性強，具有投入少、成本低、效率高的特點，并對有效地解決川貝母藥材短缺問題具有重要現實意義。
【專利說明】一種快速誘導川貝母鱗莖產生的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物【技術領域】，具體地涉及一種快速誘導川貝母鱗莖產生的方法。
【背景技術】
[0002]川貝母(Fritillaria cirrhosa D.Don)是百合科多年生草本植物，以鱗莖入藥，為名貴的川產道地藥材，堪稱藥中之寶。川貝母植株對生長環境要求苛刻，它喜冷陰氣候條件，具有耐寒、喜濕、喜蔭蔽、怕高溫的特性。氣溫達到30°C或地溫超過25°C，植株就會枯萎，在海拔低、氣溫高的地區不能生存，所以川貝母在海拔3500m~4500m的高度才能正常生長。川貝母是重要的治療咳嗽的良藥，用于肺熱燥咳，干咳少痰，陰虛勞嗽，咯痰帶血等癥狀。由于川貝母價格昂貴，加之近年來無計劃盲目的采挖，自然資源日趨枯竭，預計在近幾十年內也難以緩解。組織培養技術生長周期短，繁殖率高，擺脫了大自然中四季、晝夜的變化以及災害性氣候的不利影響，且條件均一，對植物生長極為有利，便于穩定地進行周年培養生產，因此應用組織培養的方法進行川貝母快速繁殖是解決川貝母藥材資源短缺問題的有效方法之一。現有采用川貝母植株葉為外植體誘導鱗莖的產生都要經過愈傷組織培養階段再產生獲得鱗莖。眾所周知，組織培養材料在經過愈傷組織階段時細胞較易產生的染色體變異，從而不利于確保培養鱗莖藥材的遺傳穩定性。
【發明內容】
[0003]本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種快速誘導川貝母鱗莖產生的方法，該方法步驟簡單，可操作性強，工藝穩定，適用于在工業化大生產中的廣泛應用。
[0004]本發明的目的是通過以下技術方案來實現的:
一種快速誘導川貝母鱗莖產生的方法，它包括以下步驟:
51:選取誘導產生的直徑在0.5~2cm的組培鱗莖，接入MS+KT I~3mg.L^+NAA0.1~1 mg.L-1培養基中培養，培養條件為:培養溫度為12~18°C和無光照條件下培養30~40天，即獲得由組培鱗莖產生的川貝母肉質化幼葉；
52:選取幼葉上端為白色或黃白色的肉質化幼葉，將其從葉鞘基部切下后，以平放的方式接入誘導鱗莖產生的培養基MS+6-BA I~3mg.I/1+TDZ 0.1~0.5mg.L_1+IAA 0.1~Img.L4+Ad 10~25mg.L-1中進行培養,培養條件為:將培養材料放在為4~8°C且無光照的培養條件下培養5~10天；
53:將S2步驟處理后的培養材料放在培養溫度為15~28°C，每天光照4~8h，光照強度為200~6001x的培養條件下培養20~40天。
[0005]優選地，SI步驟中所述的組培鱗莖直接為1.2cm，接入MS+KT 2mg.L^+NAA0.5mg.L—1的培養基中。
[0006]優選地，SI步驟中所述的培養溫度為15°C。
[0007]優選地，SI步驟中所述的培養條件為無光照條件下培養35天。
[0008]優選地，S2步驟中所述的誘導鱗莖產生的培養基為MS+6-BA 2mg.P+TDZ0.3mg.P+IAA 0.5mg.L_1+Ad 18mg.L—1。
[0009]優選地，S2步驟中所述的培養溫度為:6°C，且無光照的培養條件下培養7天。
[0010]優選地，S3步驟中所述的培養溫度為:20°C，每天光照時間為6h，光照強度為400 Ix的培養條件下培養30天。
[0011]本發明的有益效果在于:
本發明實現了從川貝母肉質幼葉上直接再生川貝母鱗莖，為川貝母藥用部位的快速批量產生提供了一條新途徑。該方法能顯著提高鱗莖的抽芽率，明顯縮短種植周期提高川貝母的產量。該方法步驟簡單，可操作性強，工藝穩定，適用于在工業化大生產中的廣泛應用。
【具體實施方式】
[0012]下面結合實施例對本發明做進一步的描述，本發明的保護范圍不局限于以下所述:
實施例1:一種快速誘導川貝母鱗莖產生的方法，它包括以下步驟:
S1:選取誘導產生的直徑在0.5~2cm的組培鱗莖，接入MS+KT I~3mg.L'+ΝΑΑ0.1~Img.L1培養基中培養，培養條件為:培養溫度為12~18°C和無光照條件下培養30~40天，即獲得由組培鱗莖產生的川貝母肉質化幼葉；
S2:選取幼葉上端為白色或黃白色的肉質化幼葉，將其從葉鞘基部切下后，以平放的方式接入誘導鱗莖產生的培養基MS+6-BA I~3mg.I/1+TDZ 0.1~0.5mg.L_1+IAA 0.1~Img.L4+Ad 10~25mg.L-1中進行培養,培養條件為:將培養材料放在為4~8°C且無光照的培養條件下培養5~10天；
S3:將S2步驟處理后的培養材料放在培養溫度為15~28°C，每天光照4~8h，光照強度為200~6001x的培養條件下培養20~40天。
[0013]實施例2: —種快速誘導川貝母鱗莖產生的方法，它包括以下步驟:
51:選取誘導產生的直徑在1.2cm的組培鱗莖，接入MS+KT 2mg -L^+NAA 0.5mg -T1培養基中培養，培養條件為:培養溫度為15°C和無光照條件下培養35天，即獲得由組培鱗莖產生的川貝母肉質化幼葉；
52:選取幼葉上端為白色或黃白色的肉質化幼葉，將其從葉鞘基部切下后，以平放的方式接入誘導鱗莖產生的培養基MS+6-BA 2mg.L_1+TDZ 0.3mg.L_1+IAA 0.5mg.L^+Ad18mg.L—1中進行培養，培養條件為:將培養材料放在為6°C且無光照的培養條件下培養7天;
53:將S2步驟處理后的培養材料放在培養溫度為20°C，每天光照6h，光照強度為400 Ix的培養條件下培養30天。
[0014]實施例3: —種快速誘導川貝母鱗莖產生的方法，它包括以下步驟:
51:選取誘導產生的直徑在0.5cm的組培鱗莖，接入MS+KT Img -L^+NAA 0.1mg -T1培養基中培養，培養條件為:培養溫度為12°C和無光照條件下培養30天，即獲得由組培鱗莖產生的川貝母肉質化幼葉；
52:選取幼葉上端為白色或黃白色的肉質化幼葉，將其從葉鞘基部切下后，以平放的方式接入誘導鱗莖產生的培養基MS+6-BA Img.L_1+TDZ 0.1mg.L_1+IAA 0.1mg.L^+AdIOmg.L-1中進行培養，培養條件為:將培養材料放在為4°C且無光照的培養條件下培養5天;
S3:將S2步驟處理后的培養材料放在培養溫度為15°C，每天光照4h，光照強度為200 Ix的培養條件下培養20天。
[0015]實施例4:一種快速誘導川貝母鱗莖產生的方法，它包括以下步驟:
S1:選取誘導產生的直徑在2cm的組培鱗莖，接入MS+KT 3mg.L^+NAA Img.1培養基中培養，培養條件為:培養溫度為18°C和無光照條件下培養40天，即獲得由組培鱗莖產生的川貝母肉質化幼葉；
S2:選取幼葉上端為白色或黃白色的肉質化幼葉，將其從葉鞘基部切下后，以平放的方式接入誘導鱗莖產生的培養基MS+6-BA 3mg.P+TDZ 0.5mg.P+IAA Img.L^+Ad25mg.1中進行培養，培養條件為:將培養材料放在為8°C且無光照的培養條件下培養10天;
S3:將S2步驟處理后的培養材料放在培養溫度為28°C，每天光照8h，光照強度為600 Ix的培養條件下培養40天。
[0016]實施例5: —種快速誘導川貝母鱗莖產生的方法，它包括以下步驟:
51:選取誘導產生的直徑在Icm的組培鱗莖，接入MS+KT 2mg.L^+NAA Img.1培養基中培養，培養條件為:培養溫度為15°C和無光照條件下培養35天，即獲得由組培鱗莖產生的川貝母肉質化幼葉；
52:選取幼葉上端為白色或黃白色的肉質化幼葉，將其從葉鞘基部切下后，以平放的方式接入誘導鱗莖產生的培養基MS+6-BA 2mg.L_1+TDZ 0.3mg.L_1+IAA 0.5mg.L^+Ad18mg.L—1中進行培養，培養條件為:將培養材料放在為6°C且無光照的培養條件下培養7天;
53:將S2步驟處理后的培養材料放在培養溫度為18 °C，每天光照6h，光照強度為4001x的培養條件下培養35天。
[0017]實施例6: —種快速誘導川貝母鱗莖產生的方法，它包括以下步驟:
51:選取誘導產生的直徑在0.6cm的組培鱗莖，接入MS+KT 1.5mg.L^+NAA 0.6mg.1培養基中培養，培養條件為:培養溫度為15°C和無光照條件下培養30天，即獲得由組培鱗莖產生的川貝母肉質化幼葉；
52:選取幼葉上端為白色或黃白色的肉質化幼葉，將其從葉鞘基部切下后，以平放的方式接入誘導鱗莖產生的培養基 MS+6-BA 1.5mg.L-1+TDZ 0.5mg.L_1+IAA 0.6mg.L^+Ad18mg.L—1中進行培養，培養條件為:將培養材料放在為7°C且無光照的培養條件下培養8天;
53:將S2步驟處理后的培養材料放在培養溫度為18 °C，每天光照8h，光照強度為300 Ix的培養條件下培養20天。
[0018]實施例7: —種快速誘導川貝母鱗莖產生的方法，它包括以下步驟:
51:選取誘導產生的直徑在1.5cm的組培鱗莖，接入MS+KT 2mg.'+ΝΑΑ 0.5 mg.1培養基中培養，培養條件為:培養溫度為16°C和無光照條件下培養35天，即獲得由組培鱗莖產生的川貝母肉質化幼葉；
52:選取幼葉上端為白色`或黃白色的肉質化幼葉，將其從葉鞘基部切下后，以平放的方式接入誘導鱗莖產生的培養基MS+6-BA 2mg.L_1+TDZ 0.3mg.L_1+IAA 0.5mg.L^+Ad18mg.L—1中進行培養，培養條件為:將培養材料放在為6°C且無光照的培養條件下培養7天;
S3:將S2步驟處理后的培養材料放在培養溫度為20°C，每天光照6h，光照強度為001X的培養條件下培養20~40天。
[0019]實施例8:一種快速誘導川貝母鱗莖產生的方法，它包括以下步驟:
S1:選取誘導產生的直徑在2cm的組培鱗莖，接入MS+KT 2mg.L-1+ΝΑΑΟ.5 mg.L-1培養基中培養，培養條件為:培養溫度為16°C和無光照條件下培養35天，即獲得由組培鱗莖產生的川貝母肉質化幼葉；
S2:選取幼葉上端為白色或黃白色的肉質化幼葉，將其從葉鞘基部切下后，以平放的方式接入誘導鱗莖產生的培養基MS+6-BA 2mg.L_1+TDZ 0.3mg.L_1+1AA 0.5mg.L^+Ad20mg.L-1中進行培養，培養條件為:將培養材料放在為6°C且無光照的培養條件下培養8天;
S3:將S2步驟處理后的培養材料放在培養溫度為25 °C，每天光照7h，光照強度為500 Ix的培養條件下培養40天。
[0020]實施例9:一種快速誘導川貝母鱗莖產生的方法，它包括以下步驟:
S1:選取誘導產生的直徑在0.5~2cm的組培鱗莖，接入MS+KT I~3mg.L^+NAA0.1~1 mg.L-1培養基中培養，培養條件為:培養溫度為15°C和無光照條件下培養35天，即獲得由組培鱗莖產生的川貝母肉質化幼葉；
S2:選取幼葉上端為白色或黃白色的肉質化幼葉，將其從葉鞘基部切下后，以平放的方式接入誘導鱗莖產生的培養基MS+6-BA I~3mg.L/1+TDZ 0.1~0.5mg.L_1+IAA 0.1~Img.L4+Ad 10~25mg.L-1中進行培養，培養條件為:將培養材料放在為6°C且無光照的培養條件下培養7天；
S3:將S2步驟處理后的培養材料放在培養溫度為20°C，每天光照6h，光照強度為4001X的培養條件下培養20~40天。
[0021]下面通過實驗進一步說明本發明的效果:
實驗一:本發明方法對鱗莖發生的影響
SI步驟:選取誘導產生的直徑在1.2 Cm的組培鱗莖，接入MS+KT 2mg.L-1'+ΝΑΑ0.5mg.L-1培養基中，在培養溫度為15°C和無光照條件下培養35天后，獲得由組培鱗莖產生的川貝母肉質化幼葉。S2步驟:選取幼葉上端為白色的肉質化幼葉，將其從葉鞘基部切下后，以平放的方式接入誘導鱗莖產生的培養基MS+6-BA 2mg.L-1+TDZ 0.3mg.L-1+ΙΑΑ0.5mg.L^+Ad 18mg.L-1中進行培養，培養條件為:將培養材料放在為6°C且無光照的培養條件下培養7天。S3步驟:將S2步驟處理后的培養材料放在培養溫度為22°C，每天光照6h，光照強度為4001x的培養條件下培養30天。川貝母肉質化幼葉100%的產生鱗莖，平均每個幼葉外植體產生的鱗莖數目為15~30個。
[0022]實驗二:在實驗一 S2步驟中將誘導組培鱗莖快速抽芽的培養基改為MS+6-BA
0.5mg.L-1+頭孢噻肟鈉IOOmg.L-1培養基中，其它步驟同實驗一；經45天培養后，組培鱗莖的抽芽率為58.62%。
[0023]實驗三:在實驗一 S2步驟中將誘導組培鱗莖快速抽芽的培養條件改為在培養溫度為28°C、每天光照24小時、光照強度為25001x的培養條件下培養45天后，組培鱗莖的抽芽率為89.18%。
[0024]實驗四:在實驗一 S3步驟中將誘導胚狀體產生的培養基改為MS+頭孢噻肟鈉500mg.L_\其它步驟同實驗一；經50天培養后，其胚狀體的誘導率為58.81%，且產生的胚狀體形狀多為細長的圓錐形。
[0025]實驗五:在實驗一 S2步驟中將組培鱗莖快速抽芽培養基改為MSO基本培養基，即未加任何植物激素和抗生素，其它步驟同實驗一；經45天培養后，組培鱗莖的抽芽率僅為13.17%。
[0026]實驗六:將實驗一 S2步驟中，將組培鱗莖快速抽芽的培養條件改為在培養溫度為15°C、無光照的條件下培養45天后，其它步驟同實驗一；組培鱗莖的抽芽率為11.85%。
[0027]實驗七:在實驗一 S3步驟中，采取不切去幼葉上部的黃綠色葉片部分，其它步驟同實驗一，經50天培養后，其胚狀體的誘導率為38.71%。
[0028]實驗八:在實驗一 S3步驟中，將幼葉基部的白色葉鞘以正接方式(以葉鞘外植體的形態學下端)直接插入培養基中，其它步驟同實驗一，經50天培養后，其胚狀體的誘導率為 28.56%ο
[0029]實驗九:在實驗一 S3步驟中，將幼葉基部的白色葉鞘以反接方式(以葉鞘外植體的形態學上端)直接插入培養基中，其它步驟同實實驗一，經50天培養后，其胚狀體的誘導率為 39.16%。
[0030]通過實驗表明，本發明方法實現了從川貝母肉質幼葉上直接再生川貝母鱗莖，為川貝母藥用部位的快速批量產生提供了一條新途徑。該方法能顯著提高鱗莖的抽芽率，明顯縮短種植周期，進而提高川貝母的產量。`
【權利要求】
1.一種快速誘導川貝母鱗莖產生的方法，其特征在于:它包括以下步驟: S1:選取誘導產生的直徑在0.5~2cm的組培鱗莖，接入MS+KT I~3mg.L^+NAA.0.1~I mg.L1培養基中培養，培養條件為:培養溫度為12~18°C和無光照條件下培養.30~40天，即獲得由組培鱗莖產生的川貝母肉質化幼葉； S2:選取幼葉上端為白色或黃白色的肉質化幼葉，將其從葉鞘基部切下后，以平放的方式接入誘導鱗莖產生的培養基MS+6-BA I~3mg.I/1+TDZ 0.1~0.5mg.L_1+IAA 0.1~Img.L4+Ad 10~25mg.L-1中進行培養,培養條件為:將培養材料放在為4~8°C且無光照的培養條件下培養5~10天； S3:將S2步驟處理后的培養材料放在培養溫度為15~28°C，每天光照4~8h，光照強度為200~6001x的培養條件下培養20~40天。
2.根據權利要求1所述的一種快速誘導川貝母鱗莖產生的方法，其特征在于:S1步驟中所述的組培鱗莖直徑為1.2cm，接入MS+KT 2mg.L^+NAA 0.5mg.L1的培養基中。
3.根據權利要求1所述的一種快速誘導川貝母鱗莖產生的方法，其特征在于:S1步驟中所述的培養溫度為15°C。
4.根據權利要求1所述的一種快速誘導川貝母鱗莖產生的方法，其特征在于:S1步驟中所述的培養條件為無光照條件下培養35天。
5.根據權利要求1所述的一種快速誘導川貝母鱗莖產生的方法，其特征在于:S2步驟中所述的誘導鱗莖產生的培養基為MS+6-BA 2mg.L_1+TDZ 0.3mg.L_1+IAA 0.5mg.L^+Ad18mg.L、
6.根據權利要求1所述的一種快速誘導川貝母鱗莖產生的方法，其特征在于:S2步驟中所述的培養溫度為:6°C，且無光照的培養條件下培養7天。
7.根據權利要求1所述的一種快速誘導川貝母鱗莖產生的方法，其特征在于:S3步驟中所述的培養溫度為:20°C，每天光照時間為6h，光照強度為4001x的培養條件下培養30天。
【文檔編號】A01H4/00GK103493733SQ201310437399
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2013年9月24日 優先權日:2013年9月24日
【發明者】薛剛, 王躍華, 余強, 王曉蓉 申請人:薛剛