一種富含氨基酸蛋白生物飼料添加劑的生產方法
【專利摘要】本發明公開了一種富含氨基酸蛋白生物飼料添加劑的生產方法，涉及動物飼料【技術領域】。以精氨酸濃菌液濕粉、豆粕、麥麩皮、米糠為發酵原料，以酵母菌、枯草芽孢桿菌為有益微生物菌群，將活化的酵母菌、枯草芽孢桿菌斜面菌種分別經過單菌落分離、一級固體種子培養和二級液體種子擴繁培養后，將兩種菌的種子液按比例混合，接種到經旋轉蒸球滅菌的發酵原料中，得到發酵料，在發酵床上進行通風有氧發酵，發酵達到終點，繼續對發酵床上發酵料進行通風、烘干、粉碎、過篩，得到生物飼料添加劑。本發明采用精氨酸濃菌液濕粉作為發酵原料之一，產品中粗蛋白、氨基酸和短鏈肽含量高，營養豐富，促進養殖動物生長效果明顯。
【專利說明】 一種富含氨基酸蛋白生物飼料添加劑的生產方法
【技術領域】
[0001 ] 本發明涉及動物飼料【技術領域】。
【背景技術】
[0002]酵母菌(Saccharomyces cerevisiae),是真菌微生物,在分類學上是真菌門、粘菌亞門、隱球酵母科，細胞形態為球形或卵球形，直徑5-10μπι。繁殖方式為無性芽殖。生態分布廣泛。能利用葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、半乳糖等生成乙醇、甘油、酯類和糖醇等物質，可以增加發酵料的風味。
[0003]枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis),是細菌微生物，在分類學上是芽孢桿菌屬的一種，單個細胞0.7?0.8X2?3微米，革蘭氏陽性菌，無莢膜，周生鞭毛，能運動。芽孢大，橢圓到柱狀，0.6?0.9X 1.0?1.5微米，位于菌體中央或稍偏，芽孢形成后菌體不膨大。菌落表面粗糙，污白色或微黃色，在液體培養時，常形成皺醭。
[0004]枯草芽孢桿菌具有繁殖速度快、耐高溫、耐酸堿、耐擠壓、穩定性能好、應用范圍廣等特點，在現代分子遺傳學的科研探索中常作為模式菌株，在現實的生產實踐中廣泛應用于食品工業、飼料工業、水產養殖、環境保護和保健醫藥等諸多方面；在發酵料參與發酵過程中，主要分解蛋白作用成氨基酸和肽類物質。
[0005]近年來，隨著人們生活質量的不斷提高，人們對副食品的要求越來越高，要吃的好，還要吃的健康，這對飼料行業提出更高的要求:1、要解決優質蛋白源緊缺問題；2、要解決飼料中過量使用抗生素問題；人們出于防病治病、增強免疫功能、促進生長、提高飼料利用率、凈化環境目的，許多科研人員、企業家紛紛用枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌、酵母菌、乳酸菌對豆柏進行發酵，生產微生物發酵小肽。目前在全國范圍，先后成立20多家發酵豆柏生產微生物小肽的生物技術企業，年產量達到數十萬噸以上。
[0006]國外和國內發酵豆柏，基本上都是采用芽孢桿菌、酵母菌、乳酸菌三類菌群發酵，但產品中粗蛋白、氨基酸和短鏈肽含量不高，對養殖動物生長有一定的促長效果。
【發明內容】
[0007]本發明要解決的技術問題是提供一種富含氨基酸蛋白生物飼料添加劑的生產方法，該方法將精氨酸濃菌液濕粉作為發酵原料之一，產品中粗蛋白、氨基酸和短鏈肽含量高，營養豐富，對養殖動物促進生長效果明顯。
[0008]為解決上述技術問題，本發明所采取的技術方案是:一種富含氨基酸蛋白生物飼料添加劑的生產方法，以精氨酸濃菌液濕粉、豆柏、麥麩皮、米糠為發酵原料，采用酵母菌種子液、枯草芽孢桿菌種子液對所述發酵原料進行有氧固體發酵，具體包括以下步驟:
(O精氨酸濃菌液濕粉的制備:將制取精氨酸得到的精氨酸發酵液經過陶瓷膜過濾，得到的截留液為精氨酸發酵濃縮液，向精氨酸發酵濃縮液中加入絮凝劑，并用硫酸調節PH值，反應后，壓濾，得到精氨酸濃菌液濕粉；
(2)酵母菌種子液和枯草芽孢桿菌種子液的制備:將活化的酵母菌、枯草芽孢桿菌斜面菌種分別進行單菌落分離，得到酵母菌、枯草芽孢桿菌的單菌落種子；再分別進行一級固體種子培養和二級液體種子擴繁培養，得到酵母菌種子液和枯草芽孢桿菌種子液；
(3)發酵原料的制備:按重量比，將發酵原料精氨酸濃菌液濕粉100~120份、豆柏10~20份、麥麩皮10~20份、米糠10~20份混合，經旋轉蒸球滅菌；所述發酵原料的質量含水量為精氨酸濃菌液濕粉含水量30%、豆柏含水量10%、麥麩皮含水量10%、米糠含水量10% ；
(4)有氧固體發酵:將酵母菌種子液、枯草芽孢桿菌種子液混合，接種到步驟(3)所制備的發酵原料中，得到發酵料，在發酵床上進行通風有氧發酵，發酵達到終點，繼續對發酵床上發酵料進行通風、烘干、粉碎、過篩，得到生物飼料添加劑；所述發酵原料與酵母菌種子液、枯草芽孢桿菌種子液的重量比為發酵原料100~120份、酵母菌種子液20~30份、枯草芽孢桿菌種子液20~30份。
[0009]優選的，步驟(1)中將制取精氨酸得到的精氨酸發酵液經過孔徑為30萬分子量的陶瓷膜過濾，得到的截留液為精氨酸發酵濃縮液，向精氨酸發酵濃縮液中加入絮凝劑聚丙烯酸鈉，加入量為300~500mg/kg，用質量分數35%的硫酸調節pH值到5.5~6.5后，在溫度為40°C~50°C下反應，反應時間為60~80min，而后，用3MPa的壓力，壓入到壓濾機中，壓濾時間為40~60分鐘，得到質量含水量為25~35%的精氨酸濃菌液濕粉。
[0010]進一步優選的，向精氨酸發酵濃縮液中加入絮凝劑聚丙烯酸鈉，加入量為400mg/kg，用質量分數35%的硫酸調節 pH值到6.0后，在溫度為45°C下反應，反應時間為70min，而后，用3MPa的壓力，壓入到壓濾機中，壓濾時間為50分鐘，得到質量含水量為30%的精氨酸濃菌液濕粉。
[0011]優選的，步驟(2)中酵母菌種子液的制備，包括以下步驟:
1)單菌落分離:將活化的酵母菌斜面菌種在盛有葡萄糖酵母膏酵母培養基的培養皿上涂布，培養基組成以重量百分比計為:葡萄糖3.0%、蛋白胨1.0%、酵母膏1.0%、磷酸氫二鉀
0.1%、瓊脂2.0%，余量為水；滅菌條件:0.08MPa、115°C、20min ;培養條件:在恒溫培養箱中培養，溫度30°C、時間56h，得到酵母菌單菌落種子；
2)一級固體種子培養:酵母菌單菌落種子在盛有上述葡萄糖酵母膏酵母培養基的200ml茄形扁瓶中劃線接種，所述培養基組成、滅菌條件和培養條件同上述步驟I)所述，得到酵母菌一級固體種子；
3)二級液體種子擴繁培養:將酵母菌一級固體種子按質量分數為10%~20%的接種量接種到二級種子罐培養基中，經培養，得到酵母菌種子液；所述二級種子罐培養基以重量百分比計為:葡萄糖2.0~4.0%、玉米漿干粉2.0~4.0%、硫酸銨O~0.2%、磷酸氫二鉀O~0.2%，余量為水；二級種子罐滅菌條件:罐壓0.08~0.lOMPa、溫度115~121 °C、時間18~20min ;二級液體種子培養條件:罐壓0.01~0.05MPa、風量100:100~100:150vvm、轉速180~220rpm、溫度28°C~32°C、時間48~64h ;酵母菌種子液中含酵母菌活菌數≥50億cfu/mlο
[0012]進一步優選的，酵母菌種子液的制備步驟3)中，將酵母菌一級固體種子按質量分數為20%的接種量接種到二級種子罐培養基中，經培養，得到酵母菌種子液；所述二級種子罐培養基以重量百分比計為:葡萄糖3.0%、玉米漿干粉3.0%、硫酸銨0.1%、磷酸氫二鉀
0.1%，余量為水；二級種子罐滅菌條件:0.10MPa、12rC、20min ;二級液體種子培養條件:罐壓 0.03MPa、風量 100:150vvm、轉速 200rpm、溫度 30°C、時間 56h。
[0013]優選的，步驟(2)中枯草芽孢桿菌種子液的制備，包括以下步驟:
1)單菌落分離:將活化的枯草芽孢桿菌斜面菌種在盛有葡萄糖牛肉膏蛋白胨枯草芽孢桿菌培養基的培養皿上涂布，培養基組成以重量百分比計為:葡萄糖1.0%、蛋白胨1.0%、牛肉膏0.5%、酵母膏0.5%、磷酸氫二鉀0.1%、瓊脂2.0%，余量為水；滅菌條件:0.08MPa、115°C、20min ;培養條件:在恒溫培養箱中培養，溫度30°C、時間56h，得到枯草芽孢桿菌單菌落種子；
2)—級固體種子培養:枯草芽孢桿菌單菌落種子在盛有上述葡萄糖牛肉膏蛋白胨枯草芽孢桿菌培養基的200ml茄形扁瓶中劃線接種，所述培養基組成、滅菌條件和培養條件同上述步驟I)所述，得到枯草芽孢桿菌一級固體種子；
3)二級液體種子擴繁培養:將枯草芽孢桿菌一級固體種子按質量分數為10%?20%的接種量接種到二級種子罐培養基中，經培養，得到枯草芽孢桿菌種子液；所述二級種子罐培養基以重量百分比計為:葡萄糖0.5?1.5%、玉米漿干粉2.0?4.0%、硫酸銨O?0.2%、磷酸氫二鉀O?0.2%，余量為水;二級種子罐滅菌條件，0.08?0.1OMPaU 15?121。。、18?20min ;二級液體種子培養條件，罐壓0.01?0.05MPa、風量100:80?100:120vvm、轉速100?200rpm、溫度28 V?32°C、時間48?64h ;枯草芽孢桿菌種子液中含枯草芽孢桿菌活菌數> 100億cfu/ml。
[0014]進一步優選的，枯草芽孢桿菌種子液的制備步驟3)中，將枯草芽孢桿菌一級固體種子按質量分數為20%的接種量接種到二級種子罐培養基中，經培養，得到枯草芽孢桿菌種子液；所述二級種子罐培養基以重量百分比計為:葡萄糖1.0%、玉米漿干粉3.0%、硫酸銨
0.1%、磷酸氫二鉀0.1%，余量為水；二級種子罐滅菌條件，0.10MPa、12rC、20min ;二級液體種子培養條件，罐壓0.03MPa、風量100:100vvm、轉速150rpm、溫度30°C、時間56h。
[0015]優選的，步驟(3)中發酵原料的重量比為:精氨酸濃菌液濕粉100份、豆柏10份、麥麩皮20份、米糠10份。
[0016]優選的，步驟(4)中發酵料的發酵起始質量含水量為40%?50%，發酵起始溫度為20°C?30°C，過程控制溫度為30°C?60°C，發酵時間為100?120小時，pH值為4?5，發酵達到終點，繼續對發酵床上發酵料進行通風，降低質量含水量到20?30%，然后傳輸到流化床上，在45 °C?60 V條件下烘干，烘干到質量含水量< 10%后，在無菌潔凈條件下進行粉碎、過100目篩，得到生物飼料添加劑。
[0017]進一步優選的，發酵料的發酵起始質量含水量40%，發酵起始溫度為20°C，過程控制溫度為40°C?60°C，發酵時間為100小時，pH值為5，發酵達到終點，繼續對發酵床上發酵料進行通風，降低質量含水量到20%，然后傳輸到流化床上，在60°C條件下烘干，烘干到質量含水量< 10%后，在無菌潔凈條件下進行粉碎、過100目篩，得到生物飼料添加劑；發酵原料與酵母菌種子液、枯草芽孢桿菌種子液的重量比為:發酵原料100份、酵母菌種子液20份、枯草芽孢桿菌種子液20份。
[0018]采用上述技術方案所產生的有益效果在于:
(I)本發明酵母菌、枯草芽孢桿菌本身含有一定的動物蛋白，并且能夠充分的利用發酵原料中精氨酸濃菌液濕粉中的非蛋白氮，將其降解為可吸收利用的氨基酸和短鏈肽，從而使其蛋白利用率大大提高，非蛋白氮被發酵過程吸收利用。本生物飼料添加劑中含粗蛋白可以達到60%以上，氨基酸短鏈肽生成率可達20%以上(短鏈肽分子量為2000個道爾頓以下)，含有各種氨基酸的平均值為:賴氨酸2.18%、蛋氨酸1.16%、蘇氨酸1.26%、色氨酸
1.36%ο
[0019](2)本發明具有發酵原料來源廣泛、價格低廉易得，生產工藝簡單、生產周期短，發酵產物多、產品質量好、應用效果好等特點。本產品在海珍品、畜禽養殖中的飼料中添加，可以防病治病，提聞成活率，提聞免疫力，提聞生長速度，提聞品質；由于本發明詞料是活性詞料，含有一定數量的酵母菌和枯草芽孢桿菌，可以改善養殖環境，凈化水質，是一種綠色的聞效、無毒、無害的優質的氣基酸類聞蛋白詞料添加劑，具有廣闊的市場如景。
[0020](3)本發明在微生物發酵過程中，氨基酸和多種微生物的協同作戰，通過產生的各種生物活性物質如酵母菌和芽孢菌及其代謝產物，短鏈氨基酸，小肽，消化吸收酶類等，將原料中的大分子蛋白逐步分解為簡單物質，再經過復雜的物理化學和生物化學的反應，形成具有獨特的發酵料風味。
[0021](4)本發明產品是發酵類產品，內含多種氨基酸，小肽，各種酶類，可以大大提高蛋白飼料利用率，并且有活菌在繁殖和產生各種代謝產物，所以，可以處理養殖動物的腸胃，調整菌群平衡，殺滅有害菌，減少抗生素的使用量。
【具體實施方式】
[0022]本發明各實施例采用的酵母菌為:中國工業微生物菌種保藏管理中心保藏的釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae), CICC編號為1355 ;枯草芽抱桿菌為中國工業微生物菌種保藏管理中心保藏的枯草芽孢桿菌枯草亞種(Bacillus subtilis subsp.subtilis),CICC編號為20822 ;絮凝劑聚丙烯酸鈉純度為95%。
[0023]實施例1
(I)精氨酸濃菌液濕粉的制備:將制取精氨酸(同現有技術)得到的精氨酸發酵液經過孔徑為30萬分子量的陶瓷膜過濾，得到的截留液為精氨酸發酵濃縮液，將16噸精氨酸發酵濃縮液打入到20噸容器中，靜置,加入絮凝劑聚丙烯酸鈉,加入量為400mg/kg,用質量分數35%的硫酸調節pH值到6.0后，在溫度為45°C下反應，反應時間為70min，而后，用3MPa的壓力，壓入到壓濾機中，壓濾時間為50分鐘，得到質量含水量為30%的精氨酸濃菌液濕粉。
[0024](2) a、酵母菌種子液的制備:
1)單菌落分離:將酵母菌接種到斜面培養基(5°Β?麥芽汁1.0L，瓊脂15.0g，自然pH)中，28-300C，培養三天，得到活化的酵母菌斜面菌種。將活化的酵母菌斜面菌種在盛有新配置的葡萄糖酵母培養基的培養皿上涂布，培養基組成為:葡萄糖3.0%、蛋白胨1.0%、酵母膏
1.0%、磷酸氫二鉀0.1%，瓊脂2.0%、余量為水；滅菌條件:0.08MPa、115°C、20min ;培養條件:在恒溫培養箱中培養，溫度30°C、時間56h，到酵母菌單菌落種子；
2)一級固體種子培養:酵母菌單菌落種子在盛有上述葡萄糖酵母膏酵母培養基的200ml茄形扁瓶中劃線接種，培養基組成、滅菌條件和培養條件均同上述步驟(2) a、l)所述，得到酵母菌一級固體種子；
3)二級液體種子擴繁培養:采取深層發酵法生產酵母菌種子液，將培養好的茄形扁瓶中的酵母菌一級固體種子，用200mL無菌水洗入至500mL無菌的三角瓶中，用火焰接種法將酵母菌一級固體種子按質量分數為20%的接種量接種到500立升二級種子罐培養基中(二級種子罐裝液量不超過70%)，經培養，得到酵母菌種子液；二級種子罐培養基以重量百分比計為:葡萄糖3.0%、玉米漿干粉3.0%、硫酸銨0.1%、磷酸氫二鉀0.1%，余量為水；二級種子罐滅菌條件:0.10MPa、12rC、20min ;二級液體種子培養條件:罐壓0.03MPa、風量100:150vvm、轉速 200rpm、溫度 30°C、時間 56h。
[0025]酵母菌顯微鏡檢查:酵母細胞形態大小約為2-5 X 5-30 μ m，酵母多數為單細胞微生物，常呈卵圓形或者圓柱形。
[0026]酵母菌培養皿檢查:平板培養基上的酵母菌落呈白色粒狀凸起，有酒香味。
[0027]采用平板計數法測定酵母菌種子液中含酵母菌活菌數為52.8億cfu/ml。
[0028]培養成熟時，酵母菌種子液有一種酒香味，顯微鏡下檢查菌體健壯，無雜菌污染等異常現象，可與枯草芽孢桿菌種子液混合使用。
[0029](2) b、枯草芽孢桿菌種子液的制備:
1)單菌落分離:將枯草芽孢桿菌接種到斜面培養基(蛋白胨5.0g，牛肉浸取物3.0g,NaC15.0g，瓊脂15.0g，蒸餾水1.0L, Ph7.0)中，30°C，培養1_2天，得到活化的枯草芽孢桿菌斜面菌種。將活化的枯草芽孢桿菌斜面菌種在盛有新配置的葡萄糖牛肉膏蛋白胨培養基的培養皿上涂布，培養基組成為:葡萄糖1.0%、蛋白胨1.0%、牛肉膏0.5%、酵母膏0.5%、磷酸氫二鉀0.1%，瓊脂2.0%、余量為水；滅菌條件:0.08MPa、115°C、20min ;培養條件:在恒溫培養箱中培養，溫度30°C、時間56h，得到枯草芽孢桿菌單菌落種子；
2)—級固體種子培養:枯草芽孢桿菌單菌落種子在盛有上述葡萄糖牛肉膏蛋白胨培養基的200ml茄形扁瓶中劃線接種，培養基組成、滅菌條件和培養條件均同步驟(2) b、l)所述，得到枯草芽孢桿菌一級固體種子；
3)二級液體種子擴繁培養:采取深層發酵法生產酵母菌種子液，將培養好的茄形扁瓶中的枯草芽孢桿菌一級固體種子，用200mL無菌水洗入至500mL無菌的三角瓶中，用火焰接種法將枯草芽孢桿菌一級固體種子按質量分數為20%的接種量接種到500立升二級種子罐培養基中(二級種子罐裝液量不超過70%)，經培養，得到枯草芽孢桿菌種子液；二級種子罐培養基以重量百分比計為:葡萄糖1.0%、玉米漿干粉3.0%、硫酸銨0.1%、磷酸氫二鉀
0.1%，余量為水；二級種子罐滅菌條件:0.10MPa、121°C、20min ;二級液體種子培養條件:罐壓 0.03MPa、風量 100:100vvm、轉速 150rpm、溫度 30°C、時間 56h。
[0030]采用平板計數法測定枯草芽孢桿菌種子液中含枯草芽孢桿菌活菌數為108億cfu/mlο
[0031 ] 顯微鏡下檢查枯草芽孢桿菌種子液，菌體運動活潑，健壯，整齊，無雜菌，無異味，無污染等異常現象，并有30%芽孢出現，可與酵母菌種子液混合使用。
[0032](3)發酵原料的制備:按重量比，將發酵原料精氨酸濃菌液濕粉100份、豆柏10份、麥麩皮20份、米糠10份混合，經旋轉蒸球滅菌；其中，發酵原料的質量含水量為精氨酸濃菌液濕粉30%、豆柏10%、麥麩皮10%、米糠10%。
[0033](4)有氧固體發酵:將酵母菌種子液、枯草芽孢桿菌種子液混合，接種到步驟(3)所制備的發酵原料中(發酵原料與酵母菌種子液、枯草芽孢桿菌種子液的重量比為發酵原料100份、酵母菌種子液20份、枯草芽孢桿菌種子液20份)，得到發酵料，在發酵床上進行通風有氧發酵，發酵料的發酵起始質量含水量40%，發酵起始溫度為20°C，過程控制溫度為40°C?60°C，發酵時間為100小時，pH值為5，發酵達到終點。繼續對發酵床上發酵料進行通風，降低質量含水量到20%，然后傳輸到流化床上，在60°C條件下烘干，烘干到質量含水量10%后，在無菌潔凈條件下進行粉碎、過100目篩，得到生物飼料添加劑。
[0034]實施例2
(I)精氨酸濃菌液濕粉的制備:將制取精氨酸(同現有技術)得到的精氨酸發酵液經過孔徑為30萬分子量的陶瓷膜過濾，得到的截留液為精氨酸發酵濃縮液，將16噸精氨酸發酵液打入到20噸容器中，靜置，加入絮凝劑聚丙烯酸鈉，加入量為300mg/kg，用質量分數35%的硫酸調節pH值到5.5后，在溫度為40°C下反應，反應時間為60min，而后，用3MPa的壓力將反應后的精氨酸發酵液壓入到壓濾機中，壓濾時間為40分鐘，得到質量含水量為35%的精氨酸濃菌液濕粉。
[0035](2) a、酵母菌種子液的制備:
與實施例1的區別在于步驟(2)a、3)中二級液體種子擴繁培養:用壓差接種法將酵母菌一級固體種子按質量分數為10%的接種量接種到I噸二級種子罐培養基中，經培養，得到酵母菌種子液；二級種子罐培養基以重量百分比計為:葡萄糖2.0%、玉米漿干粉2.0%，余量為水；二級種子罐滅菌條件:0.08MPa、115°C、19min ;二級液體種子培養條件:罐壓
0.05MPa、風量 100:120vvm、轉速 220rpm、溫度 32°C、時間 64h。
[0036]采用平板計數法測定酵母菌種子液中含酵母菌活菌數為52.2億cfu/ml。
[0037](2) b、枯草芽孢桿菌種子液的制備:
與實施例1的區別在于步驟(2)b、3)中二級液體種子擴繁培養:用壓差接種法將枯草芽孢桿菌一級固體種子按質量分數為10%的接種量接種到I噸二級種子罐培養基中，經培養，得到枯草芽孢桿菌種子液；二級種子罐培養基以重量百分比計為:葡萄糖0.5%、玉米漿干粉2.0%，余量為水；二級種子罐滅菌條件:0.08MPa、115°C、18min ;二級液體種子培養條件:罐壓 0.05MPa、風量 100:120vvm、轉速 200rpm、溫度 32°C、時間 64h。
[0038]采用平板計數法測定枯草芽孢桿菌種子液中含枯草芽孢桿菌活菌數為102億cfu/mlο
[0039](3)發酵原料的制備:發酵原料的制備:按重量比，將發酵原料精氨酸濃漿菌液濕粉110份、豆柏20份、麥麩皮10份、米糠15份混合，經旋轉蒸球滅菌；其中，發酵原料的質量含水量為精氨酸濃漿菌液濕粉30%、豆柏10%、麥麩皮10%、米糠10%。
[0040](4)有氧固體發酵:將酵母菌種子液、枯草芽孢桿菌種子液混合，接種到步驟(3)所制備的發酵原料中(發酵原料與酵母菌種子液、枯草芽孢桿菌種子液的重量比為發酵原料120份、酵母菌種子液25份、枯草芽孢桿菌種子液30份)，得到發酵料，在發酵床上進行通風有氧發酵，發酵料的發酵起始質量含水量45%，發酵起始溫度為25°C，過程控制溫度為30°C?50°C，發酵時間為120小時，pH值為4，發酵達到終點。繼續對發酵床上發酵料進行通風，降低質量含水量到25%，然后傳輸到流化床上，在45°C條件下烘干，烘干到質量含水量8%后，在無菌潔凈條件下進行粉碎、過100目篩，得到生物飼料添加劑。
[0041]實施例3
(I)精氨酸濃菌液濕粉的制備:將制取精氨酸(同現有技術)得到的精氨酸發酵液經過孔徑為30萬分子量的陶瓷膜過濾，得到的截留液為精氨酸發酵濃縮液，將16噸精氨酸發酵液打入到20噸容器中，靜置，加入絮凝劑聚丙烯酸鈉，加入量為500mg/kg，用質量分數35%的硫酸調節pH值到6.5后，在溫度為50°C下反應，反應時間為80min，而后，用3MPa的壓力將反應后的精氨酸發酵液壓入到壓濾機中，壓濾時間為60分鐘，得到質量含水量為25%的精氨酸濃菌液濕粉。
[0042](2) a、酵母菌種子液的制備：
與實施例I的區別在于步驟（2)a、3)中二級液體種子擴繁培養：用火焰接種法將酵母菌一級固體種子按質量分數為15%的接種量接種到2噸二級種子罐培養基中，經培養，得到酵母菌種子液；二級種子罐培養基以重量百分比計為：葡萄糖4. 0%、玉米漿干粉4. 0%，硫酸銨0. 2%、磷酸氫二鉀0. 2%，余量為水；二級種子罐滅菌條件：0. 09MPa、118°C、18min ;二級液體種子培養條件：罐壓0.01MPa、風量100: lOOvvm、轉速180rpm、溫度28°C、時間48h。
[0043]采用平板計數法測定酵母菌種子液中含酵母菌活菌數為51. 6億cfu/ml。
[0044](2) b、枯草芽孢桿菌種子液的制備：
與實施例I的區別在于步驟（2)b、3)中二級液體種子擴繁培養：用火焰接種法將枯草芽孢桿菌一級固體種子按質量分數為15%的接種量接種到500立升二級種子罐培養基中，經培養，得到枯草芽孢桿菌種子液；二級種子罐培養基以重量百分比計為：葡萄糖I. 5%、玉米漿干粉4. 0%、硫酸銨0. 2%、磷酸氫二鉀0. 2%，余量為水；二級種子罐滅菌條件：0. 09MPa、118°C> 19min ;二級液體種子培養條件：罐壓0.01MPa、風量100:80vvm、轉速lOOrpm、溫度28°C、時間 48h。
[0045]采用平板計數法測定枯草芽孢桿菌種子液中含枯草芽孢桿菌活菌數為106億cfu/mlo
[0046](3)發酵原料的制備：按重量比，將精氨酸濃漿菌液濕粉120份、豆柏15份、麥麩皮15份、米糠20份混合，經旋轉蒸球滅菌；其中，發酵原料的質量含水量為精氨酸濃漿菌液濕粉30%、豆柏10%、麥麩皮10%、米糠10%。
[0047](4)有氧固體發酵：將酵母菌種子液、枯草芽孢桿菌種子液混合，接種到步驟（3)所制備的發酵原料中（發酵原料與酵母菌種子液、枯草芽孢桿菌種子液的重量比為發酵原料110份、酵母菌種子液30份、枯草芽孢桿菌種子液25份)，得到發酵料，在發酵床上進行通風有氧發酵，發酵料的發酵起始質量含水量50%，發酵起始溫度為30°C，過程控制溫度為35°C~55°C，發酵時間為110小時，pH值為4. 5，發酵達到終點。繼續對發酵床上發酵料進行通風，降低質量含水量到30%，然后傳輸到流化床上，在52°C條件下烘干，烘干到質量含水量6%后，在無菌潔凈條件下進行粉碎、過100目篩，得到生物飼料添加劑。
[0048]通過本發明方法制得的生物飼料添加劑經測定粗蛋白含量可達60%以上，氨基酸短鏈肽生成率達20%以上(短鏈肽分子量為2000個道爾頓以下)，含有各種氨基酸的平均值(或保證值）為：賴氨酸2. 18%、蛋氨酸I. 16%、蘇氨酸I. 26%、色氨酸I. 36%。
[0049]應用時，將本發明所得的產品生物飼料添加劑，在海藍褐色殼蛋雞日糧中添加
0.2wt%進行飼養試驗，結果見表1 :
表1產品生物飼料添加劑對海藍褐色殼蛋雞雞群生產性能的影響
【權利要求】
1.一種富含氨基酸蛋白生物飼料添加劑的生產方法，其特征在于，以精氨酸濃菌液濕粉、豆柏、麥麩皮、米糠為發酵原料，采用酵母菌種子液、枯草芽孢桿菌種子液對所述發酵原料進行有氧固體發酵，具體包括以下步驟: (1)精氨酸濃菌液濕粉的制備:將制取精氨酸得到的精氨酸發酵液經過陶瓷膜過濾，得到的截留液為精氨酸發酵濃縮液，向精氨酸發酵濃縮液中加入絮凝劑，并用硫酸調節PH值，反應后，壓濾，得到精氨酸濃菌液濕粉； (2)酵母菌種子液和枯草芽孢桿菌種子液的制備:將活化的酵母菌、枯草芽孢桿菌斜面菌種分別進行單菌落分離，得到酵母菌、枯草芽孢桿菌的單菌落種子；再分別進行一級固體種子培養和二級液體種子擴繁培養，得到酵母菌種子液和枯草芽孢桿菌種子液； (3)發酵原料的制備:按重量比，將發酵原料精氨酸濃菌液濕粉100~120份、豆柏10~20份、麥麩皮10~20份、米糠10~20份混合，經旋轉蒸球滅菌；所述發酵原料的質量含水量為精氨酸濃菌液濕粉含水量30%、豆柏含水量10%、麥麩皮含水量10%、米糠含水量10% ； (4)有氧固體發酵:將酵母菌種子液、枯草芽孢桿菌種子液混合，接種到步驟(3)所制備的發酵原料中，得到發酵料，在發酵床上進行通風有氧發酵，發酵達到終點，繼續對發酵床上發酵料進行通風、烘干、粉碎、過篩，得到生物飼料添加劑；所述發酵原料與酵母菌種子液、枯草芽孢桿菌種子液的重量比為發酵原料100~120份、酵母菌種子液20~30份、枯草芽孢桿菌種子液20~30份。
2.根據權利要求1所述的一種富含氨基酸蛋白生物飼料添加劑的生產方法，其特征在于所述步驟(1)中將制取精氨酸得到的精氨酸發酵液經過孔徑為30萬分子量的陶瓷膜過濾，得到的截留液為精氨酸發酵濃縮液，向精氨酸發酵濃縮液中加入絮凝劑聚丙烯酸鈉，加入量為300~500mg/kg，用質量分數35%的硫酸調節pH值到5.5~6.5后，在溫度為40°C~50°C下反應，反應時間為60~80min，而后，用3MPa的壓力，壓入到壓濾機中，壓濾時間為40~60分鐘，得到質量含水量為25~35%的精氨酸濃菌液濕粉。
3.根據權利要求2所述的一種富含氨基酸蛋白生物飼料添加劑的生產方法，其特征在于向精氨酸發酵濃縮液中加入絮凝劑聚丙烯酸鈉，加入量為400mg/kg，用質量分數35%的硫酸調節pH值到6.0后，在溫度為45°C下反應，反應時間為70min，而后，用3MPa的壓力，壓入到壓濾機中，壓濾時間為50分鐘，得到質量含水量為30%的精氨酸濃菌液濕粉。
4.根據權利要求1所述的一種富含氨基酸蛋白生物飼料添加劑的生產方法，其特征在于所述步驟(2)中酵母菌種子液的制備，包括以下步驟: 1)單菌落分離:將活化的酵母菌斜面菌種在盛有葡萄糖酵母膏酵母培養基的培養皿上涂布，培養基組成以重量百分比計為:葡萄糖3.0%、蛋白胨1.0%、酵母膏1.0%、磷酸氫二鉀.0.1%、瓊脂2.0%，余量為水；滅菌條件:0.08MPa、115°C、20min ;培養條件:在恒溫培養箱中培養，溫度30°C、時間56h，得到酵母菌單菌落種子； 2)一級固體種子培養:酵母菌單菌落種子在盛有上述葡萄糖酵母膏酵母培養基的200ml茄形扁瓶中劃線接種，所述培養基組成、滅菌條件和培養條件同上述步驟I)所述，得到酵母菌一級固體種子； 3)二級液體種子擴繁培養:將酵母菌一級固體種子按質量分數為10%~20%的接種量接種到二級種子罐培養基中，經培養，得到酵母菌種子液；所述二級種子罐培養基以重量百分比計為：葡萄糖2. O~4. 0%、玉米漿干粉2. O~4. 0%、硫酸銨O~0. 2%、磷酸氫二鉀0~0.2%，余量為水；二級種子罐滅菌條件：罐壓0. 08~0. lOMPa、溫度115~121°C、時間18~20min ;二級液體種子培養條件：罐壓0. 01~0. 05MPa、風量100:100~100:150vvm、轉速180~220rpm、溫度28°C~32°C、時間48~64h ;酵母菌種子液中含酵母菌活菌數≥50億cfu/mlo
5.根據權利要求4所述的一種富含氨基酸蛋白生物飼料添加劑的生產方法，其特征在于所述酵母菌種子液的制備步驟3)中，將酵母菌一級固體種子按質量分數為20%的接種量接種到二級種子罐培養基中，經培養，得到酵母菌種子液；所述二級種子罐培養基以重量百分比計為：葡萄糖3. 0%、玉米漿干粉3. 0%、硫酸銨0. 1%、磷酸氫二鉀0. 1%，余量為水；二級種子罐滅菌條件：0. 10MPa、12rC、20min ;二級液體種子培養條件：罐壓0. 03MPa、風量100:150vvm、轉速 200rpm、溫度 30°C、時間 56h。
6.根據權利要求1所述的一種富含氨基酸蛋白生物飼料添加劑的生產方法，其特征在于所述步驟（2)中枯草芽孢桿菌種子液的制備，包括以下步驟： 1)單菌落分離：將活化的枯草芽孢桿菌斜面菌種在盛有葡萄糖牛肉膏蛋白胨枯草芽孢桿菌培養基的培養皿上涂布，培養基組成以重量百分比計為：葡萄糖I. 0%、蛋白胨I. 0%、牛肉膏0. 5%、酵母膏0. 5%、磷酸氫二鉀0. 1%、瓊脂2. 0%，余量為水；滅菌條件:0. 08MPa、115°C、20min ;培養條件：在恒溫培養箱中培養，溫度30°C、時間56h，得到枯草芽孢桿菌單菌落種子； 2)—級固體種子培養：枯草芽孢桿菌單菌落種子在盛有上述葡萄糖牛肉膏蛋白胨枯草芽孢桿菌培養基的200ml茄形扁瓶中劃線接種，所述培養基組成、滅菌條件和培養條件同上述步驟I)所述，得到枯草芽孢桿菌一級固體種子； 3)二級液體種子擴繁培養：將枯草芽孢桿菌一級固體種子按質量分數為10%~20%的接種量接種到二級種子罐培養基中，經培養，得到枯草芽孢桿菌種子液；所述二級種子罐培養基以重量百分比計為：葡萄糖0. 5~I. 5%、玉米漿干粉2. 0~4. 0%、硫酸銨0~0. 2%、磷酸氫二鉀0~0. 2%，余量為水;二級種子罐滅菌條件，0. 08~0. IOMPaU 15~121。。、18~20min ;二級液體種子培養條件，罐壓0. 01~0. 05MPa、風量100:80~100:120vvm、轉速100~200rpm、溫度28 V~32°C、時間48~64h ;枯草芽孢桿菌種子液中含枯草芽孢桿菌活菌數> 100億cfu/ml。
7.根據權利要求6所述的一種富含氨基酸蛋白生物飼料添加劑的生產方法，其特征在于所述枯草芽孢桿菌種子液的制備步驟3)中，將枯草芽孢桿菌一級固體種子按質量分數為20%的接種量接種到二級種子罐培養基中，經培養，得到枯草芽孢桿菌種子液；所述二級種子罐培養基以重量百分比計為：葡萄糖I. 0%、玉米漿干粉3. 0%、硫酸銨0. 1%、磷酸氫二鉀0.1%，余量為水；二級種子罐滅菌條件，0. 10MPa、12rC、20min ;二級液體種子培養條件，罐壓 0. 03MPa、風量 100:100vvm、轉速 150rpm、溫度 30°C、時間 56h。
8.根據權利要求1所述的一種富含氨基酸蛋白生物飼料添加劑的生產方法，其特征在于所述步驟（3)中發酵原料的重量比為：精氨酸濃菌液濕粉100份、豆柏10份、麥麩皮20份、米糠10份。
9.根據權利要求1所述的一種富含氨基酸蛋白生物飼料添加劑的生產方法，其特征在于所述步驟（4)中發酵料的發酵起始質量含水量為40%~50%，發酵起始溫度為20°C~30°C，過程控制溫度為30°C~60°C，發酵時間為100~120小時，pH值為4~5，發酵達到終點，繼續對發酵床上發酵料進行通風，降低質量含水量到20~30%，然后傳輸到流化床上，在45°C~60°C條件下烘干，烘干到質量含水量< 10%后，在無菌潔凈條件下進行粉碎、過100目篩，得到生物飼料添加劑。
10.根據權利要求9所述的一種富含氨基酸蛋白生物飼料添加劑的生產方法，其特征在于所述發酵料的發酵起始質量含水量40%，發酵起始溫度為20°C，過程控制溫度為40°C~60°C，發酵時間為100小時，pH值為5，發酵達到終點，繼續對發酵床上發酵料進行通風，降低質量含水量到20%，然后傳輸到流化床上，在60°C條件下烘干，烘干到質量含水量< 10%后，在無菌潔 凈條件下進行粉碎、過100目篩，得到生物飼料添加劑；發酵原料與酵母菌種子液、枯草芽孢桿菌種子液的重量比為:發酵原料100份、酵母菌種子液20份、枯草芽孢桿菌種子液20份。
【文檔編號】A23K1/16GK103535525SQ201310474972
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2013年10月12日 優先權日:2013年10月12日
【發明者】李斌水, 薛德林, 張仲良, 張習偉, 吳雷, 張韶睿 申請人:精晶藥業股份有限公司