棉花內生真菌cef-818及其在棉花黃萎病防治中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及植物病理學，具體地涉及棉花的內生真菌CEF-818及其在棉花黃萎病防治中的應用。根據本發明的棉花的內生真菌CEF-818，其保藏編號為：CGMCC?No.8320。CEF-818的代謝產物對棉花黃萎病菌的抑制效果達100%，其產生的揮發性代謝物對棉花黃萎病菌的抑制效果為77.5%。溫室試驗結果表明，25%的CEF-818培養濾液浸種對棉花黃萎病的防治效果為66.2%，對黃萎病有顯著的控制作用，與生產上應用較多的枯草芽孢桿菌相比，防治效果提高25.1%左右，對作物生長無毒負作用，對人畜、昆蟲和作物安全，環境友好。
【專利說明】棉花內生真菌CEF-818及其在棉花黃萎病防治中的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及植物病理學，具體地涉及棉花的內生真菌CEF-818及其在棉花黃萎病防治中的應用。
【背景技術】
[0002]由大麗輪枝菌引起的黃萎病是世界性的棉花重要病害之一。90年代以來，該病在我國各大棉區爆發成災，年發生面積為300萬公頃左右，產量損失約I億公斤皮棉。由于輪作倒茬難，缺乏抗病品種和具有較好防治效果的農藥，致使目前生產上對黃萎病的防治幾乎是空白，病害的發生危害日趨嚴重，成為發展棉花生產的主要限制因子之一。
[0003]利用有益微生物控制植物病害的發生危害具有經濟、環境友好的特點。目前利用拮抗微生物防治棉花黃萎病研究較多的是枯草芽孢桿菌，作用機理是產生桿菌肽等多種抗菌物質來抑制病原菌，對黃萎病的防治具有一定的效果，但是在生產應用中存在不少問題，其中最主要的問題是防治效果較低，國內登記的枯草芽孢桿菌劑型對棉花黃萎病的防治效果在45%左右，且在不同年份效果不穩定。例如2008年和2009年，由中國農業科學院棉花研究所承擔國家農藥登記試驗中(任務來源于農業部農藥鑒定所)，黑龍江強爾生化技術開發區有限公司生產的1000億活芽孢/克枯草芽孢桿菌可濕性粉劑對棉花黃萎病的防治效果為46.0%-52.9%，但在2010年大面積試驗中防治效果只有32.7%。
[0004]生防菌通常可利用競爭、抗生、寄生和交叉保護等直接的拮抗機制抑制植物病害；同時某些生防菌還能促進植物生長，誘導植物對真菌、細菌和病毒引起的病害乃至對線蟲和昆蟲為害的抗性，稱為誘導系統抗性(ISR)，又稱獲得性抗病性，是植物在一定的生物或非生物因子的刺激或作用下，產生對隨后病原物侵染的抗性。
[0005]誘導的系統抗病性(或免疫作用)優于化學防治和抗病育種，其優點如下:⑴免疫作用能有效地防治病毒、細 菌和真菌病害。(2)免疫作用是穩定的，它決定幾種不同的機制，而內吸殺菌劑往往具有單一的作用位點，容易產生新的抗藥小種，因而是不穩定的。(3)免疫作用是系統的、持久的，瓜類中的免疫作用可通過嫁接，從砧木傳導到接穗。(4)在感病植物中亦具有免疫能力，說明潛在的抗病基因存在于所有的植物中。(5)免疫物質，可從免疫植株的化學提取物中獲得，可在田間噴施或種子處理。
[0006]植物內生真菌資源是個巨大的寶庫，近年來，由于內生真菌在病蟲害的生物防治、醫藥工業上的用途和范圍逐漸增大，因此有關內生真菌的研究逐漸受到重視。從棉花的內生真菌入手，分離篩選對黃萎病菌具有抑制活性的菌株，獲得對該病控制效果好的生防菌株，是值得探討的棉花黃萎病防治的新途徑。本發明的發明人經多年的研究，從健康棉花的莖桿中獲得一株內生真菌，經溫室苗期試驗對棉花黃萎病的防治效果達66.2%，對棉花黃萎病的防治具有巨大的潛能。
【發明內容】
[0007]本發明的發明人為解決現有的拮抗微生物防治棉花黃萎病效果較差的問題，提出并完成本發明。
[0008]本發明從棉花的內生真菌入手，通過分離、篩選、鑒定、抑菌測定及溫室的生物測定，獲得對棉花黃萎病具有顯著控制作用的菌株CEF-818(Penicillium simplicissimum),其保藏編號為:CGMCC N0.8320。
[0009]根據本發明的棉花的內生真菌CEF-818，該菌株是一株棉花的內生真菌，在分離時，首先要選擇健康的棉株，最重要的是，在分離過程中，一定要保證樣品的表面消毒徹底，確保分離到的是棉花的內生真菌。
[0010]本發明獲得的生防菌株CEF-818來自棉株體內，通過用生防菌株的培養濾液來浸泡棉花種子，使棉花獲得對黃萎病的抗病性。使用方法簡單，適宜生產上推廣用用。
[0011]該菌株經鑒定是一株青霉屬真菌。從棉花中可以分離到豐富的內生真菌。由于微生物的培養性狀容易受培養條件的影響，傳統的以形態學為基礎的分類鑒定有時候會受到限制。分子生物學的發展給微生物的分類鑒定提供了新的有效措施，因此，以傳統的形態學鑒定為基礎，結合分子生物學的手段，對篩選到的菌株進行鑒定，最后獲得目的菌株。
[0012]利用棉花的內生真菌CER)8111來控制棉花黃萎病在以下三方面產生有益效果。
[0013]UCEF-818能夠在人工培養基上培養，容易獲得和培養。用于生物防治的菌株必須能夠在人工培養基上培養，以利于工廠化生產和推廣應用。CEF818是一株棉花的內生真菌，在土壤中廣泛存在，能侵染多種作物，有報道該菌也是紅豆林、紅豆杉和野山藥等植物的內生真菌。該菌株在PDA、查氏及玉米沙粒培養基上生長良好，有利于大量繁殖和推廣應用。
[0014]2、CEF-818對棉花黃萎病菌具有較好的抑制效果。在PDA培養基上，CEF-818和棉花黃萎病菌Verticillium dahliae對扣培養時，產生的揮發性代謝物對黃萎病菌抑菌效果達到77.5% ;在同樣條件下采用圓盤濾膜法培養時，CEF-818產生的非揮發性代謝物對黃萎病菌抑菌效果為100%。
`[0015]3、CEF-818對黃萎病控制效果好。將25%的CEF-818的查彼克培養發酵液浸泡感病棉花品種冀棉11的種子(光子)12小時，將棉花種子播種于蛭石沙土制作的無底紙缽中，于棉苗一片真葉平展時接種棉花黃萎病強致病力菌株Vd080，棉苗2-3片真葉期調查黃萎病的發病情況。用25%的CEF-818發酵液處理的棉苗黃萎病病情指數為27.7，未經CEF-818發酵液處理直接接種Vd080的棉花病情指數為56.6，經CEF-818處理后冀棉11的抗病性顯著提高，由感病上升為耐病，CEF-818對棉花黃萎病的控制效果為66.2%，與生產上應用較多的枯草芽孢桿菌相比，防治效果提高47.1%左右。
[0016]4、CEF_818為環境友好型生防菌株。CEF-818是一株分離自健康棉株的內生真菌，經鑒定為簡青霉，屬于青霉屬的叉狀亞屬。據報道，簡青霉是一類來源于土壤中的優勢真菌，具有吸附水中的重金屬離子和降解木質素的能力，是一種應用較為廣泛的環保真菌。本發明獲得的簡青霉菌株CEF-818分離自棉花，土壤中廣泛存在，對多數的作物不致病，解決了具有生防潛力的微生物可能轉變為致病菌的問題，因此對人畜、昆蟲和作物安全，環境友好。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0017]圖1為CEF-818在PDA上的菌落形態，其中a為正面，b為反面，c為顯微鏡下觀察到的菌絲及分生孢子；[0018]圖2圓盤慮膜法測定CEF-818對棉花黃萎病菌的抑制作用。a，對照，直接在PDA平板中央接種的棉花黃萎病菌Vd080菌液5μ I (查彼克液體培養7d)，25°C恒溫培養箱內培養7d ;b，在平板中央接種5μ I的青霉CEF-818菌液(查彼克液體培養7d)，25°C恒溫培養箱內培養7d后去玻璃紙，再在平板中央接種5μ I的黃萎病菌Vd080菌液(查彼克液體培養7d)，25 °C恒溫培養箱內培養7d。
[0019]圖3CEF-818對棉花黃萎病的控制作用。a，清水浸種，播種后18天接種大麗輪枝菌強致病力菌株Vd080 ；b, 25%的CEF-818培養濾液浸種，播種后18天接種大麗輪枝菌強致病力菌株Vd080 ;c，清水浸種，播種后18天用滅菌蒸餾水蘸根。
[0020]棉花內生真菌(Penicilliumsimplicissimum)CEF-818,于 2013 年 10 月 10 日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，100101)，其保藏編號是=CGMCC N0.8320。
【具體實施方式】
[0021]實施例1菌株的分離[0022](一)樣品采集
[0023]于6-8月份,選擇健康棉株,取主莖的中上部及果枝15cm。
[0024](二)菌株的分離
[0025]先將采集到的樣品(棉花莖桿)用清水洗凈，去皮，置于直徑為9cm的滅菌的培養皿中，用75%的酒精消毒lmin。再用5.0%的次氯酸鈉進行消毒60s，用滅菌水洗3次，每次時間不少于3min。然后用滅菌的吸水紙沾干表面的水分，用消毒的剪刀剪成0.4cm長的小段，置于9cm的培養皿中，25°C培養。用最后一遍清洗液為對照，檢查消毒是否徹底。每天檢查內生真菌的生長情況，發現有菌落長出，及時轉移至直徑為6cm的培養皿中培養，然后觀察其菌落大小、顏色、表面特征、質地。
[0026](三)CER)8111的特征
[0027]1、形態特征在PDA平板上，菌落具有放射狀的皺褶，呈絨狀生長，正面分生孢子區開始為白色，后變為淡灰綠色，孢子區周圍有較窄的白邊，反面開始為亮黃色，繼續培養顏色變深，呈紅褐色。顯微鏡下(400X)該菌株小梗疏松，頂端急劇變細，單層或雙層，大小約21 μ m;分生子串生，圓形或橢圓形，大約2.8μπι (圖1)。
[0028]2、生理特征CEF-818在5_30°C條件下均能生長，最適生長溫度是25°C。
[0029]依據CEF-818形態特征、生理特征和分子鑒定結果，將CEF-818歸屬為Penicillium simplicissimum。
[0030](四)培養基及培養條件
[0031 ] 1.PDA培養基馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂15_20g，水1000ml，自然pH。稱取削皮的200g馬鈴薯，切成小塊置于鍋中加水煮爛(煮沸20-30min)，用紗布過濾后，濾液中加入葡萄糖和瓊脂繼續加熱攪勻，稍冷卻后再補水至1000ml，分裝到錐形瓶，加塞包扎后120°C滅菌20min。25°C，黑暗培養7d。
[0032]2.查彼克(Czapek)液體培養基 KNO3, 2.0Og ;K2HP04，1.0Og ;KCI，0.50g ;MgSO4.7Η20，0.50g ；FeS04.7Η20，0.01g ;蔗糖，30.0Og ;加水至 1000ml，分裝到錐形瓶，加塞包扎后120°C滅菌20min。置搖床150rpm，25°C，黑暗條件震蕩培養7d。[0033]3.玉米粉沙土培養基將2份玉米粉和1份沙土加適量水(將培養基捏在手中不滴水)混勻，悶半小時后，放入克氏瓶中，120°C滅菌30min。25°C，黑暗培養14d。
[0034]實施例2CEF-818對棉花黃萎病菌的抑制作用
[0035]1、試驗方法
[0036]對扣培養法。在直徑90_培養皿的皿蓋和皿底分別倒入一定量的PDA培養基，皿蓋培養基稍少些。凝固后，在皿蓋中心接入5μ I的青霉CEF-818菌液(查彼克液體培養7d)，在皿底中心接種5 μ I的黃萎病病原菌菌液(查彼克液體培養7d)。放入25°C恒溫培養箱中，倒置培養，以僅接種病原菌的培養皿為對照，每個處理重復4次。每天觀察病原菌及青霉菌絲的生長狀況，接種黃萎病菌7d后采用十字交叉法測量病原菌的菌落直徑，計算青霉CEF-818揮發性代謝產物對病原菌生長的抑制率。
[0037]圓盤濾膜法。在直徑為9cm的PDA平板上，平鋪上直徑略大于9cm的雙層玻璃紙(硝酸纖維素膜)，在平板中央接種5 μ I的青霉CEF-818菌液(查彼克液體培養7d)，25°C恒溫培養箱內培養7d后去玻璃紙，再在平板中央接種5μ I的黃萎病菌Vd080菌液(查彼克液體培養7d)，25°C恒溫培養箱內培養7d。以不含CEF-818代謝產物的PDA平板接種棉花黃萎病菌Vd080為對照。每個處理重復4次，用十字法測定菌落直徑，計算抑制率。
[0038]2、試驗結果
[0039]對扣培養結果表明，經CEF-818處理的棉花黃萎病菌菌落直徑為1.4cm，未經CEF-818處理的菌落直徑為6.lcm, CEF-818揮發性代謝產物對病原菌生長的抑制率為77.1% (表 I)。
[0040]圓盤濾膜法培養結`果表明，經CEF-818處理的棉花黃萎病菌停止生長，菌落直徑為0.0cm，未經CEF-818處理的菌落直徑為6.lcm, CEF-818分泌的代謝產物對病原菌生長的抑制率為100% (表1，圖2)。
[0041]實施例3CEF-818對棉花黃萎病的控制作用
[0042]1、試驗方法
[0043]CEF-818經查彼克液體培養基25°C，黑暗條件震蕩培養7d,經濾紙過濾后，獲得培養濾液用以浸種。對照菌株Vd080 (棉花黃萎病強致病力菌株)經查彼克液體培養基25°C，黑暗條件震蕩培養7d，經3層紗布過濾后，獲得孢子懸浮液用以接種。試驗設置4個處理，分別為25%、50%和100%的CEF-818培養濾液及清水浸種，4個處理均在棉苗一片真葉平展時接種棉花黃萎病菌Vd080分生孢子懸浮液。
[0044]將滅菌后的蛭石和沙子按6:4混合,做直徑6cm的無底紙缽,放置45cmX 35cm的塑料盤內。以感病品種冀棉11為供試品種，將經脫絨棉籽在CEF-818的培養濾液中浸泡12h后，淋干備播。每缽播種棉花種子8粒，出苗后留苗5株，每處理15個缽，每5個缽為一個重復，3次重復，隨機排列。棉花播種后，將塑料盤置溫室中，待棉苗長一片真葉，接種Vd080孢子懸浮液IOml，孢子濃度為I X IO7個孢子/ml。接種方法為，將IOml孢子懸浮液倒入直徑IOcm的培養皿中，將紙缽從塑料盤中取出放置在培養皿中40s，待孢子懸浮液被吸干后，將紙缽放回塑料盤中。棉苗置18°C _28°C的溫室中，按5級分級標準進行病害的分級調查。計算病株率、病情指數和防治效果。
[0045]2、試驗結果
[0046]2012年和2013的結果表明，用25%、50%和100%的CEF-818浸種處理的棉苗黃萎病的病情指數分別23.5和22.1,32.6和30.6及31.0和32.0，均顯著低于清水對照處理(66.6 和 68.4)，其防治效果分別為 64.7% 和 67.7%, 51.1% 和 55.3% 及 53.5% 和 53.2%,以25%浸種處理的防治效果最好,顯著高于50%和100%浸種處理(圖3,表2)。
[0047]實施例4CEF-818對棉苗生長的影響
[0048]1、試驗方法
[0049]CEF-818查彼克液體發酵液的獲得及棉苗培育同實施例3。試驗設置4個處理，分別為25%、50%和100%的CEF-818培養濾液及清水浸種，4個處理均不再接種棉花黃萎病菌，播種后50天，每處理隨機選取25棵棉苗，測量株高、根長、棉苗鮮重和根鮮重。
[0050]2、試驗結果
[0051]結果表明，不同濃度的CEF-818濾液浸種處理棉苗的株高、根長、棉苗鮮重和根鮮重都與清水浸種沒有顯著差異，表明CEF-818浸種對棉苗的生長發育沒有負作用(表3)。
[0052]表1CEF-818對棉花黃萎病菌的抑制作用
【權利要求】
1.棉花的內生真菌CEF-818，其特征在于，其保藏編號為:CGMCCN0.8320。
2.權利要求1所述內生真菌CEF-818的應用。
3.權利要求1所述內生真菌CEF-818用于抑制棉花黃萎病菌的應用。
4.權利要求1所述內生真菌CEF-818用于控制棉花黃萎病的應用。
5.權利要求1所述內生真菌CEF-818的培養方法，其特征在于，在PDA培養基、查彼克液體培養基或玉米 沙土培養基上25°C暗培養7天。
【文檔編號】A01P3/00GK103627643SQ201310695638
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2013年12月16日 優先權日:2013年12月16日
【發明者】朱荷琴, 李志芳, 馮自力, 王玲飛, 鄭綋爽, 師勇強, 趙麗紅 申請人:中國農業科學院棉花研究所