一種車前草離體快速繁殖的方法
【專利摘要】本發明提供一種車前草離體快速繁殖的方法，包括如下步驟：1）愈傷組織誘導培養：將經滅菌消毒的車前草葉片切去葉脈和葉緣，切成小塊，接種到愈傷組織誘導培養基上，常規培養至形成愈傷組織和不定芽；2）生根培養：挑選步驟1）中芽長達2-3厘米的不定芽，將其從愈傷組織上切下，其余愈傷組織和不定芽繼續愈傷組織誘導培養，切下的不定芽接種到生根培養基上，常規培養至長出白色的根，獲得無菌車前草種苗。本發明的方法外植體消毒效率高達80%，無菌苗生根率達100%，可快速繁殖車前草無菌種苗，解決了車前草植株的繁殖能力低、繁殖周期長、資源匱乏、農藥殘留等諸多問題，在保護野生車前草自然資源和良好的生態環境等方面具有重要意義。
【專利說明】一種車前草離體快速繁殖的方法【技術領域】
[0001]本發明屬于植物的組織培養領域，具體涉及一種車前草離體快速繁殖的方法。
【背景技術】
[0002]車前草屬于車前草科植物，別名又為牛甜草、車前菜、車輪菜、豬耳草等，長在潮濕的環境中，如池塘、樹下、河邊、路旁等地。車前草具有食用及食療價值，富含多種維生素和蛋白質，含豐富優良的可溶性膳食纖維。
[0003]車前草的種子和全草均可入藥，且毒副作用較小，是一種優良的藥用植物，含有多種藥用成份，如熊果酸，車前苷、β_谷留醇等，具有利水消腫、止瀉、清熱殺菌、明目化痰、消炎、降血壓等功效；含有的β -表馬錢酸(β-epiloganic acid)、胡蘿卜苷和木犀草苷三種成分不但能夠能夠清除體內的氧自由基防止衰老，而且還具有抗抑郁的作用，臨床方面的應用有:治療陰道炎、治療急性乳腺炎、治療產后尿潴留、治療隱匿性腎炎、治療褥瘡、治療慢性活動性肝炎、治療運動性血紅蛋白尿等；還具有一定的利尿作用，可以治療血尿、感冒和腹瀉，治療婦科病(如白帶過多)，治療頑固性牙痛。目前也有以車前草為原料生產制劑的(如軟膏，糖漿，保健含片，保健飲料等)。另外，車前草中還含有烏蘇酸B-谷留醇、車前甙桃葉珊瑚甙、苯乙醇苷、維生素B、正三十一烷等藥用化學成分以及車前果膠、梓醇、膽堿、花生酸和亞麻酸等脂肪酸、腺嘌呤等物質。
[0004]目前對于車前草的繁殖僅有傳統栽培技術。但因長期過度采伐導致野生車前草逐漸減少、種子攜帶病毒，環境條件惡化導致藥用價值的差異、育種周期長、優良品質退化和農藥殘余量超標等諸多缺點，都已嚴重地影響了車前草的開發利用。研究車前草組織離體培養快速繁殖技術是解決目前車前草利用困境的有效方法。
【發明內容】
[0005]為解決目前車前草利用中存在的種子攜毒、繁殖周期長、品質退化、藥用價值參差不齊、農藥殘余量超標等諸多問題，本發明提供一種車前草離體快速繁殖的方法。
[0006]本發明提供的車前草離體快速繁殖的方法，包括如下步驟:
[0007]I)愈傷組織誘導培養:將經滅菌消毒的車前草葉片切去葉脈和葉緣，切成小塊，接種到愈傷組織誘導培養基上，常規培養至形成愈傷組織和不定芽；
[0008]2)生根培養:挑選步驟I)中芽長達2-3厘米的不定芽，將其從愈傷組織上切下，其余愈傷組織和不定芽繼續愈傷組織誘導培養，切下的不定芽接種到生根培養基上，常規培養至長出白色的根，獲得無菌車前草種苗。
[0009]其中，所述滅菌消毒的具體方法為:采摘無病蟲害的車前草葉片，流水沖洗，在超凈工作臺上用酒精浸泡30s，再轉入0.1%的升汞溶液中浸泡8min，用無菌水沖洗3_5次。
[0010]其中，所述小塊優選0.8mmX 0.8mm的小塊。
[0011]其中，所述愈傷組織誘導培養基為以MS培養基為基本培養基，所含蔗糖濃度為10~50g/L、萘乙酸(NAA)濃度為0.05~0.5mg/L、6_芐氨基嘌呤(6-BA)濃度為1.0~4.0mg/L的培養基。
[0012]優選的，所述愈傷組織誘導培養基為以MS培養基為基本培養基，所含蔗糖濃度為30g/L、萘乙酸濃度為0.lmg/L、6-芐氨基嘌呤濃度為1.0mg/L的培養基，或以MS培養基為基本培養基，所含蔗糖濃度為30g/L、萘乙酸濃度為0.lmg/L、6-芐氨基嘌呤濃度為2.0mg/L
的培養基。
[0013]其中，所述生根培養基為以MS培養基為基本培養基，所含蔗糖濃度為30g/L、萘乙酸濃度為0.lmg/L、6-芐氨基嘌呤濃度為2.0mg/L的培養基。
[0014]其中，所述常規培養的培養條件為pH值6.0，培養溫度25°C，光照周期12小時/天，光照強度為20001x。
[0015]其中，所述愈傷組織誘導培養的時間為30天。
[0016]其中，所述生根培養的時間為15天。
[0017]本發明還提供所述車前草離體快速繁殖的方法在車前草繁育中的應用。
[0018]本發明的有益效果在于:
[0019]I)本發明外植體消毒效率高達80%，無菌苗生根率達100%，可快速繁殖車前草無菌種苗。
[0020]2)本發明解決了車前草植株的繁殖能力低、繁殖周期長、資源匱乏、農藥殘留等諸多問題。
[0021 ] 3 )本發明首次采用離體快速繁殖技術對車前草進行組織培養，不僅可以滿足市場需求，而且還可以為工廠大規模生產提供有益的理論參考。
[0022]4)本發明在保護野生車前草自然資源和良好的生態環境等方面具有重要意義。【具體實施方式】
[0023]以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發明的范圍。
[0024]若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。實施例中所用化學試劑均可市購。
[0025]實施例1
[0026]利用本發明進行車前草離體快速繁殖。
[0027]外植體的選擇及消毒:從野外采摘無病蟲害的野生車前草葉片，在流水下洗去塵土，在超凈工作臺上先用酒精浸泡30s，再轉入0.1%的升汞溶液中浸泡8min，用無菌水沖洗3-5次，最后在無菌條件下切去車前草葉片的葉脈和邊緣，切成0.8mmX0.8mm的小塊。
[0028]I)愈傷組織誘導培養:將經滅菌消毒的車前草葉片切成的0.8mmX0.8mm小塊接種到愈傷組織誘導培養基上，常規培養。所述愈傷組織誘導培養基為以MS培養基為基本培養基，所含蔗糖濃度為30g/L、萘乙酸濃度為0.lmg/L、6-芐氨基嘌呤濃度為1.0mg/L的培養基，培養基PH值為6.0。所述常規培養的培養條件為pH值6.0,培養溫度25 V，光照周期12小時/天，光照強度為20001χ。培養30天，形成了愈傷組織和大量不定芽，其中有些不定芽長達2-3厘米。
[0029]2)生根培養:挑選步驟I)中芽長達2-3厘米的不定芽，將其從愈傷組織上切下，其余愈傷組織和不定芽繼續愈傷組織誘導培養，切下的不定芽接種到生根培養基上，常規培養，培養條件同步驟I)。所述生根培養基為以MS培養基為基本培養基，所含蔗糖濃度為30g/L、萘乙酸濃度為0.lmg/L、6-芐氨基嘌呤濃度為2.0mg/L的培養基，培養基pH值為6.0。培養15天，長出了白色的根，獲得無菌車前草種苗。
[0030]結果表明，外植體消毒效率高達80%，能快速獲得無菌不定芽，生根率達100%，能夠得到保持母株優良性狀的大量車前草種苗。
[0031]實施例2
[0032]利用本發明進行車前草離體快速繁殖。
[0033]所述愈傷組織誘導培養基為以MS培養基為基本培養基，所含蔗糖濃度為30g/L、萘乙酸濃度為0.lmg/L、6-芐氨基嘌呤濃度為2.0mg/L的培養基，培養基pH值為6.0。其他條件同實施例1。
[0034]結果表明，外植體消毒效率高達80%，能快速獲得無菌不定芽，生根率達100%，能夠得到保持母株優良性狀的大量車前草種苗。
[0035]以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本【技術領域】的普通技術人員來說，在不脫離本發明技術原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍 。
【權利要求】
1.一種車前草離體快速繁殖的方法，包括如下步驟: 1)愈傷組織誘導培養:將經滅菌消毒的車前草葉片切去葉脈和葉緣，切成小塊，接種到愈傷組織誘導培養基上，常規培養至形成愈傷組織和不定芽； 2)生根培養:挑選步驟I)中芽長達2-3厘米的不定芽，將其從愈傷組織上切下，其余愈傷組織和不定芽繼續愈傷組織誘導培養，切下的不定芽接種到生根培養基上，常規培養至長出白色的根，獲得無菌車前草種苗。
2.如權利要求1所述的車前草離體快速繁殖的方法，其特征在于，所述滅菌消毒的具體方法為:采摘無病蟲害的車前草葉片，流水沖洗，在超凈工作臺上用酒精浸泡30s，再轉入0.1%的升萊溶液中浸泡8min,用無菌水沖洗3_5次。
3.如權利要求1所述的車前草離體快速繁殖的方法，其特征在于，所述小塊優選0.8mm X 0.8mm 的小塊。
4.如權利要求1所述的車前草離體快速繁殖的方法，其特征在于，所述愈傷組織誘導培養基為以MS培養基為基本培養基，所含蔗糖濃度為10~50g/L、萘乙酸濃度為0.05~0.5mg/L、6-芐氨基嘌呤濃度為1.0~4.0mg/L的培養基。
5.如權利要求4所述的車前草離體快速繁殖的方法，其特征在于，所述愈傷組織誘導培養基為以MS培養基為基本培養基，所含蔗糖濃度為30g/L、萘乙酸濃度為0.lmg/L、6-芐氨基嘌呤濃度為1.0mg/L的培養基，或以MS培養基為基本培養基，所含蔗糖濃度為30g/L、萘乙酸濃度為0.lmg/L、6-芐氨基嘌呤濃度為2.0mg/L的培養基。
6.如權利要求1所述的車前草離體快速繁殖的方法，其特征在于，所述生根培養基為以MS培養基為基本培養基， 所含蔗糖濃度為30g/L、萘乙酸濃度為0.lmg/L、6-芐氨基嘌呤濃度為2.0mg/L的培養基。
7.如權利要求1所述的車前草離體快速繁殖的方法，其特征在于，所述常規培養的培養條件為PH值6.0，培養溫度25°C，光照周期12小時/天，光照強度為20001x。
8.如權利要求1所述的車前草離體快速繁殖的方法，其特征在于，所述愈傷組織誘導培養的時間為28-32天。
9.如權利要求1所述的車前草離體快速繁殖的方法，其特征在于，所述生根培養的時間為14-16天。
10.權利要求1-9任一項所述的車前草離體快速繁殖的方法在車前草繁育中的應用。
【文檔編號】A01H4/00GK103704135SQ201310710565
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2013年12月20日 優先權日:2013年12月20日
【發明者】陳建榮, 唐映紅, 劉芳, 郭清泉 申請人:長沙學院