一種利用冰點前臨界低溫長期保存香港牡蠣眼點幼蟲的方法
【專利摘要】本發明公開了一種利用冰點前臨界低溫長期保存香港牡蠣眼點幼蟲的方法。它包括a、幼蟲冷藏：采集濃縮香港牡蠣眼點幼蟲，將其用海水潤濕的篩絹網裝好扎成包，再用海水潤濕的海綿包裹封好，置于0-1℃下冷藏；b、對步驟a冷藏的眼點幼蟲噴灑海水于其海綿上，使其保持濕潤；c、幼蟲解凍：將步驟b冷藏的眼點幼蟲從低溫環境中取出，利用常溫海水潤濕，之后放入容器中，將其攪勻，待完全恢復常溫后，即獲得眼點幼蟲。本發明保存的眼點幼蟲，幾乎尚未出現凍傷現象，可有效的提高采苗效率，90%以上可以完成變態。本發明為研究香港牡蠣幼蟲低溫生物學、干法幼蟲運輸、規模化苗種同步生產等提供了理論與實踐基礎。本發明具有操作簡便、實用性強等優點。
【專利說明】一種利用冰點前臨界低溫長期保存香港牡蠣眼點幼蟲的方法
【技術領域】:
[0001]本發明屬于現代海洋農業中貝類苗種繁育【技術領域】，具體涉及一種利用冰點前臨界低溫長期保存香港牡蠣眼點幼蟲的方法。
【背景技術】:
[0002]低溫生物學是20世紀50年代發展起來的一門新興的學科，目前這門學科已經在人、畜等的配子和胚胎的保存方面獲得了廣泛的應用(常萬存等，1998)。雖然超低溫冷凍技術在海洋生物中已得到了廣泛應用，但是由于某些海洋生物的卵子比較大，且含有大量的卵黃、油滴等，增加了冷凍保存的難度，故這方面的研究集中在海洋生物精子的低溫保存研究上(李永仁等，2005)。
[0003]目前，低溫保存 精子技術已經在多種經濟魚、蝦、貝類上獲得了成功，并得到實際應用。在貝類配子、胚胎的保存上也已經取得了突破性的進展，特別是對于牡蠣早期擔輪幼蟲的超低溫保存技術，已達到商業化的規模(張巖等，2004)。雖然，有個別報道牡蠣幼蟲低溫短期保存研究(于瑞海等，2006)，但尚未見低溫長期保存香港牡蠣眼點幼蟲的相關報道。
【發明內容】
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[0004]針對于當前香港牡蠣眼點幼蟲尚無有效長期保存措施的現狀，結合香港牡蠣眼點幼蟲耐低溫的生物學特性，本發明通過幼蟲采集、幼蟲冷藏、幼蟲管理等技術手段提供了一種利用冰點前臨界低溫長期保存香港牡蠣眼點幼蟲的方法。
[0005]本發明的利用冰點前臨界低溫長期保存香港牡蠣眼點幼蟲的方法，其特征在于，包括以下步驟:
[0006]a、幼蟲冷藏:采集濃縮香港牡蠣眼點幼蟲，將其用海水潤濕的篩絹網裝好扎成包，再用海水潤濕的海綿包裹封好，置于o-rc下冷藏；
[0007]b、對步驟a冷藏的眼點幼蟲噴灑海水于其海綿上，使其保持濕潤；冷藏時間一般可以達到< 90d。
[0008]C、幼蟲解凍:將步驟b冷藏的眼點幼蟲從低溫環境中取出，利用常溫海水潤濕，之后放入容器中，將其攪勻，大約15-20min后，待完全恢復常溫后，即獲得眼點幼蟲。幼蟲解凍過程中，90%以上眼點幼蟲可以在海水中浮游，處于存活狀態。可將解凍后存活的眼點幼蟲投入盛有新鮮海水的下好附著基水泥池中采苗。
[0009]所述的步驟a的采集濃縮香港牡蠣眼點幼蟲是利用80目篩絹網(網孔最大孔徑250 μ m)濃縮香港牡蠣眼點幼蟲。
[0010]所述的步驟a的海水潤濕的篩絹網為500目篩絹網(網孔最大孔徑20 μ m)。
[0011]所述的步驟a中采集濃縮的香港牡蠣眼點幼蟲，殼高在320_360μπι，殼長在270_300 u π?ο
[0012]所述的步驟a中將香港牡蠣眼點幼蟲用海水潤濕的篩絹網裝好扎成包，每包眼點幼蟲裝限制在< 1kg,防止大量幼蟲推擠對幼蟲自身造成損傷。
[0013]所述的步驟b的對步驟a冷藏的眼點幼蟲噴灑海水于其海綿上，使其保持濕潤，是為了防止眼點幼蟲體內脫水，使其處于濕潤氛圍下的干燥狀態，空氣濕度維持在100%以上。
[0014]所述的步驟b的噴灑海水，其頻率為5-7天一次。
[0015]在貝類幼蟲低溫保存技術研究中，李一峰等(2012)公開了《厚殼貽貝早期幼蟲低溫保存的影響研究》的對比文件I。對比文件I與本發明相比，具有以下不同點，①保存對象不同:對比文件保存的是厚殼貽貝，而本發明保存的是香港牡蠣。②保存階段不同:對比文件I保存的D形幼蟲，即前期面盤幼蟲；而本發明保存是眼點幼蟲，為面盤后期幼蟲。③保存方式不同:對比文件保存時采用的在海水中低密度保存，保存幼蟲數量及其有限25個幼蟲/mL海水)；而本發明采用的干法保存，可以保存大量幼蟲O 10萬個/g)。④保存管理流程不同:對比文件I保存過程中需要投喂餌料，步驟繁瑣；而本發明勿需投喂任何餌料。
[0016]于瑞海等(2006)公開了《不同發育期的太平洋牡蠣在不同干露狀態下的成活率研究》對比文件2。對比文件2與本發明相比，具有以下不同點，①保存對象不同:對比文件2保存的是長牡蠣，而本發明保存的是香港牡蠣。長牡蠣主要分布在我國北方溫帶區域，喜好高鹽低溫純海水環境，年 產量在80萬噸左右；而香港牡蠣主要分布在華南沿海亞熱帶及熱帶區域，喜好低鹽高溫的半咸水環境，年產量在130萬噸左右。②保存方式不同:對比文件2使用的低溫是8-10°C，而本發明使用的是0-l°C。8-10°C為結冰前低溫中的中低溫環境，相比較而言比較安全，但是無法達到長期保存的目的；而o-rc為冰點前臨界超低溫度，本領域技術人員認為，在o-rc環境下，可能會將幼蟲凍死，但是本發明人發現o-rc冰點前臨界超低溫度可以使眼點幼蟲處于休克狀態，從而可以長期保存。③保存時間不同:對比文件2為短期保存，僅僅保存了 24h ;而本發明為長期保存，保存時間為2-3個月。④幼蟲狀態不同:對比文件2中的長牡蠣幼蟲處于低溫代謝狀態，僅僅是降低了代謝速率；而本發明使其眼點幼蟲處于冷休克式的冬眠狀態，幾乎不再進行代謝，但仍維持幼蟲處于活體狀態。⑤保存效果不同:對比文件2保存的眼點幼蟲，24h后其存活率不足90%，而本發明長期保存3個月以內的存活率均在90%以上。⑥保存用途不同:對比文件2為主要適用于短時間內長途運輸，而本發明主要目的是為了研究香港牡蠣低溫生物學及其對冰點前臨界低溫的耐受力，從而提高香港牡蠣幼蟲變態率,進行大規模生產香港牡蠣健康苗種。
[0017]本發明結合牡蠣幼蟲耐低溫的生物學特性，采用冷休克方式，通過幼蟲采集、幼蟲冷藏、幼蟲管理、幼蟲解凍等技術手段，創造了一種利用冰點前臨界低溫長期保存香港牡蠣眼點幼蟲的方法。本發明不同于以往利用抗凍劑等開展的低溫冷藏技術，首次采用o-1°c低溫條件下進行幼蟲冷藏，可大量保存眼點幼蟲O 1000億個)。本發明保存的眼點幼蟲，幾乎尚未出現凍傷現象，可有效的提高采苗效率，90%以上可以完成變態(< 90d)。本發明為研究香港牡蠣幼蟲低溫生物學、干法幼蟲運輸、規模化苗種同步生產等提供了理論與實踐基礎。本發明具有操作簡便、實用性強等優點。
【具體實施方式】
[0018]以下實施例是對本發明的進一步說明，但不構成對本發明的限制。[0019]實施例1
[0020]a、幼蟲采集:2010年5月30日，在大連莊河海洋貝類育苗場內，利用80篩絹網(網孔最大孔徑250 μ m)濃縮60m3水泥池中的香港牡蠣眼點幼蟲，共獲得6000萬個眼點幼蟲，其殼高在320-360 μ m。
[0021]b、幼蟲冷藏:將步驟a中眼點幼蟲用海水潤濕后的500目篩絹網(網孔最大孔徑20 μ m)裝好扎成包，每包< 1kg，之后外面利用海水濕潤過的海綿包裹一層，放入2L容積的保溫箱中封好，之后放置于0-l°C冰箱中冷藏。
[0022]C、幼蟲管理:對步驟b中包裝好的眼點幼蟲每隔7天利用小型噴霧器噴灑海水于其外層的海綿上，使其一直處于濕潤狀態。
[0023]d、幼蟲解凍:冷藏60d后，先將其從冰箱中拿出來，打開后利用常溫海水潤濕眼點幼蟲，之后放入20L紅盤中，利用水舀子攪勻，大約15-20min后，完全恢復常溫后，將眼點幼蟲投入60m3水泥池中，發現幼蟲近乎100%存活，正常攝食、游動。15d后，獲得了 5500萬牡蠣稚貝，變態率在90%以上。
[0024]實施例2
[0025]a、幼蟲采集:2011年6月10日，在深圳旭聯海洋生物有限公司育苗場內，利用80篩絹網(網孔最大孔徑250 μ m)濃縮30m3水泥池中的香港牡蠣眼點幼蟲，共獲得1500萬個眼點幼蟲，其殼高在320-36 0 μ m。
[0026]b、幼蟲冷藏:將步驟a中眼點幼蟲用海水潤濕后的500目篩絹網(網孔最大孔徑20 μ m)裝好扎成包，每包< 1kg，之后外面利用海水濕潤過的海綿包裹一層，放入2L容積的保溫箱中封好，之后放置于0-l°C冰箱中冷藏。
[0027]C、幼蟲管理:對步驟b中包裝好的眼點幼蟲每隔7天利用小型噴霧器噴灑海水于其外層的海綿上，使其一直處于濕潤狀態。
[0028]d、幼蟲解凍:冷藏36d后，先將其從冰箱中拿出來，打開后利用常溫海水潤濕眼點幼蟲，之后放入20L紅盤中，利用水S子攪勻，大約15-20min后，完全恢復常溫后，將其投入30m3水泥池中，發現幼蟲近乎100%存活，正常攝食、游動。15d后，獲得了 1400萬牡蠣稚貝，變態率在90%以上。
[0029]實施例3
[0030]a、幼蟲采集:2012年6月15日，在中國科學院南海海洋研究所湛江海洋經濟動物實驗育苗場內，利用80篩絹網(網孔最大孔徑250 μ m)濃縮20m3水泥池中的香港牡蠣眼點幼蟲，共獲得1000萬個眼點幼蟲，其殼高在320-360 μ m。
[0031]b、幼蟲冷藏:將步驟a中眼點幼蟲用海水潤濕后的500目篩絹網(網孔最大孔徑20 μ m)裝好扎成包，每包< 1kg，之后外面利用海水濕潤過的海綿包裹一層，放入2L容積的保溫箱中封好，之后放置于0-l°C冰箱中冷藏。
[0032]C、幼蟲管理:對步驟b中包裝好的眼點幼蟲每隔7天利用小型噴霧器噴灑海水于其外層的海綿上，使其一直處于濕潤狀態。
[0033]d、幼蟲解凍:冷藏90d后，先將其從冰箱中拿出來，打開后利用常溫海水潤濕眼點幼蟲，之后放入IOL紅桶中，利用水S子攪勻，大約15-20min后，完全恢復常溫后，將其投入20m3水泥池中，發現幼蟲近乎100%存活，正常攝食、游動。15d后，獲得了 910萬牡蠣稚貝，變態率在90%以上。
【權利要求】
1.一種利用冰點前臨界低溫長期保存香港牡蠣眼點幼蟲的方法，其特征在于，包括以下步驟: a、幼蟲冷藏:采集濃縮香港牡蠣眼點幼蟲，將其用海水潤濕的篩絹網裝好扎成包，再用海水潤濕的海綿包裹封好，置于o-rc下冷藏； b、對步驟a冷藏的眼點幼蟲噴灑海水于其海綿上，使其保持濕潤； C、幼蟲解凍:將步驟b冷藏的眼點幼蟲從低溫環境中取出，利用常溫海水潤濕，之后放入容器中，將其攪勻，待完全恢復常溫后，即獲得眼點幼蟲。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟a的采集濃縮香港牡蠣眼點幼蟲是利用80目篩絹網濃縮香港牡蠣眼點幼蟲。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟a的海水潤濕的篩絹網為500目篩絹網。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟a中將香港牡蠣眼點幼蟲用海水潤濕的篩絹網裝好扎成包，每包眼點幼蟲裝限制在< 1kg。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟b的噴灑海水，其頻率為5-7天一次。
【文檔編號】A01K61/00GK103931531SQ201410153382
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年4月16日 優先權日:2014年4月16日
【發明者】張躍環, 肖述, 張揚, 李軍, 向志明, 喻子牛 申請人:中國科學院南海海洋研究所