一種茅蒼術組培快繁的方法
【專利摘要】本發明公開了一種茅蒼術組培快繁的方法，包括如下步驟：種子的處理與消毒滅菌；建立無菌培養體系；愈傷組織誘導；愈傷組織分化成苗；無菌苗增殖培養；無菌苗生根培養；煉苗移栽。通過組培快繁技術能在短期內獲得大量無菌苗，解決茅蒼術種苗問題，為大規模栽培生產和繁殖種苗提供有效途徑。通過組培不僅能提供優質茅蒼術種苗，還可以在此基礎上選育出高產優質的新品種，開辟新的藥用資源，并對緩解供需矛盾，保護野生茅蒼術資源具有重要的意義。
【專利說明】一種茅蒼術組培快繁的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種組培快繁體系的方法，尤其涉及茅蒼術組培快繁的方法。
【背景技術】
[0002]茅蒼術(Atractylodes lancea (Thunb.)DC.)是菊科蒼術屬多年生草本植物，以根莖入藥，是我國傳統中藥材。茅蒼術性辛、苦、溫，歸脾、胃、肝經。臨床上主要用于治療脘腹脹滿，水腫，腳氣痿辟，風濕痹痛，風寒感冒，雀目夜盲等。近年來對茅蒼術的綜合開發使蒼術的用途擴大，除藥用外可用作各種飲料的添加劑和加工工藝品香包。
[0003]茅蒼術主要分布在海拔40-400米的丘陵山區，對土壤要求不高，荒山、坡地瘦土均能生長，分布區土壤類型多樣，喜叢生在疏松的砂質土壤和富含腐殖質的土壤中。根際土壤多為酸性，PH在5左右，極少弱堿性(pH7.5)，向陽山坡疏林下及少見陽光的密林下皆可生長。至今茅蒼術主要分布于長江流域的江蘇、安徽、湖北、四川、浙江、江西等省，江蘇茅山一帶是茅蒼術道地藥材的產區。但長期以來，茅山野生蒼術不受重視、疏于管理，被掠奪性采挖，野生資源面臨枯竭。
[0004]人工繁殖茅蒼術既可以用種子繁殖也可用根莖繁殖，但是種子繁殖其繁殖系數太低，種子的生命力較差；用根莖繁殖則需要大量根莖材料，而且品質易退化。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在于提供了一種能提高成活率的茅蒼術組培快繁的方法，以期開辟新的藥用資源，并且緩解供需矛盾，保護野生茅蒼術資源。
[0006]為了解決上述技術問題，本發明所采用的技術方案為:一種茅蒼術組培快繁的方法，其特征在于:所述方法包括如下步驟:
(1)茅蒼術種子處理與消毒滅菌:選取茅蒼術種子，清洗后進行消毒滅菌處理；
(2)建立無菌培養體系:將消毒滅菌后種子接入發芽培養基，在設定的培養條件下，10-14天發芽，約一個月后，長成幼苗；
(3)愈傷組織誘導:將步驟(2)培養的無菌幼苗去除根系，剪去葉片，保留嫩莖，基部向下接入愈傷組織誘導與分化培養基，在設定的培養條件下，培養10-14天后，嫩莖基部膨大逐漸形成綠色到褐色愈傷組織；
(4)愈傷組織分化成 苗:在步驟(3)的基礎上繼續培養，20-28天后愈傷組織上分化出叢生芽，45~50天后叢生芽陸續形成叢生苗；
(5)無菌苗增殖培養:將步驟(4)中的叢生苗從愈傷組織基座上分株，剪去葉片，保留嫩莖，接入增殖培養基，在設定的培養條件下，5、天后開始出芽，18~24天后形成叢苗；
(6)無菌苗生根培養:取步驟(5)中高5cm以上、性狀穩定的單株健壯幼苗，接種至生根培養基，在設定的培養條件下，28天后完成生根；
(7)煉苗移栽:挑選步驟(6)中葉片數多于8片、不定根數多于12，苗高超過6cm的壯苗，先將組培瓶移至常溫15°C下鍛煉一周，移栽前兩天開瓶蓋，并澆水保持葉片不萎縮，移栽時將苗去除培養基并洗凈后定植于穴盤，經滅菌處理后，將穴盤置于溫室，相對濕度保持80%以上，14-21天苗長出新葉，即可認為成活。
[0007]優選，在步驟(7)中，移栽后每隔7天噴施一次多菌靈粉劑殺菌，噴施量以苗葉片濕潤為宜，待苗長出新葉即可停止。
[0008]上述步驟(2)至步驟(6)中所述的設定的培養條件為光照強度:2000-25001Χ ;光照時間:12~15h/d ;培養溫度:(22±2) 0C ;培養地點無菌培養室。
[0009]步驟(1)中消毒滅菌處理方法為；將清洗后的種子加入清水浸泡0.5~lh，浸泡結束后，用流動水反復沖洗，再用蒸餾水沖洗兩次，然后用體積百分比為70%乙醇溶液浸泡約2(T30s,再用質量百分比為0.1%氯化萊溶液浸泡15mirTl8min,最后用無菌水沖洗至少3遍，在無菌濾紙上吸干水分備用。
[0010]步驟(2)中發芽培養基為MS加入質量百分比為3%的蔗糖和0.75%瓊脂，所述培養基PH為5.8~6.2。
[0011]步驟(3)中愈傷組織誘導與分化培養基為MS+0.5^1.5mg/L的6_芐氨基腺嘌呤+0.05^0.15mg/L的萘乙酸+質量百分比為3%的蔗糖+質量百分比為0.75%瓊脂，所述培養基PH為5.8~6.2。
[0012]步驟(5)中增殖培養基為MS+0.5^1.5mg/L的6_芐氨基腺嘌呤+0.1-0.3mg/L的萘乙酸+質量百分比為 3%的蔗糖+質量百分比為0.75%瓊脂，所述培養基PH為5.8飛.2。
[0013]步驟(6)中生根培養基為1/2MS+NAA (萘乙酸)0.1-0.2mg/L加入質量百分比為
0.5%~0.8%的活性炭、3%的蔗糖和0.75%瓊脂，所述培養基PH為5.8~6.2。
[0014]步驟(7)中在穴盤中裝有移栽基質，移栽基質包括如下重量比的組分，泥炭土:蛭石:普通黃土 =1~2:1~2:廣2。
[0015]有益效果:與現有技術相比，本發明是通過組培快繁技術能在4飛個月內獲得大量無菌苗，解決茅蒼術種苗問題，為大規模栽培生產和繁殖種苗提供有效途徑。通過組培不僅能提供優質茅蒼術種苗，還可以在此基礎上選育出高產優質的新品種，開辟新的藥用資源，并對緩解供需矛盾，保護野生茅蒼術資源具有重要的意義。
【具體實施方式】
[0016]下面結合實施例對本發明作進一步的闡述。應當指出，對于本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干變型和改進，這些也應視為屬于本發明的保護范圍。
[0017]實施例1:一種茅蒼術組培快繁的方法，包括如下步驟:
1、種子處理與消毒滅菌
培養皿中放入大小適宜的濾紙，選取秋天收獲的粒大飽滿的野生茅蒼術{Atractylodes lancea (Thunb.)DC.)種子,用洗衣粉清洗后,然后加入適量清水浸泡(以剛好沒及種子為宜)0.5h ;浸泡結束后，用流水反復沖洗，再用蒸餾水沖洗兩次；再將種子用體積百分比為70%乙醇浸泡30s,后再用質量百分比為0.1%氯化萊溶液浸泡15min,無菌水沖洗3遍，在無菌濾紙上吸干水分備用。
[0018]2、無菌培養體系建立
將上述消毒滅菌后種子接入發芽培養基，每瓶I粒；14天后發芽，一個月后，長成具有兩片真葉的無菌幼苗，苗高約5cm。其中，發芽培養基為MS加入質量百分比為3%的蔗糖和質量百分比為0.75%瓊脂，所述培養基PH為5.8。
[0019]3、愈傷組織誘導
將第2步得到的無菌幼苗去除根系，剪去葉片，保留嫩莖，基部向下接入愈傷組織誘導與分化培養基；培養2周，嫩莖基部膨大逐漸形成綠色到褐色愈傷組織。其中，愈傷組織誘導與分化培養基為MS+6-BA (6-芐氨基腺嘌呤)1.0mg/L+NAA (萘乙酸)0.lmg/L加入質量百分比為3%的蔗糖和質量百分比為0.75%瓊脂，所述培養基PH為5.8。
[0020]4、愈傷組織分化成苗
四周后愈傷組織上分化出叢生芽，七至八周后叢生芽陸續長成叢生苗。
[0021]5、無菌苗增殖培養
將叢生苗從愈傷組織基座上分株，剪去葉片，保留嫩莖，接入增殖培養基；1周開始出芽，3周后形成叢苗，平均增殖倍數約為6.0。其中，增殖培養基為MS+6-BA (6-芐氨基腺嘌呤)1.0mg/L+NAA (萘乙酸)0.2mg/L加入質量百分比為3%的蔗糖和0.75%瓊脂，所述培養基PH為5.8。
[0022]6、無菌苗生根培養
取第5步中得到的 高5cm以上、性狀穩定的單株健壯幼苗，接種至生根培養基，在設定的培養條件下，3周后完成生根，平均根長約8cm，不定根數量平均達10以上，生根率超過99%。其中，生根培養基為1/2MS+NAA (萘乙酸)0.15 mg/L加入質量百分比為0.5%的活性炭、質量百分比為3%的蔗糖和質量百分比為0.75%瓊脂，所述培養基PH為5.8。
[0023]上述步驟2至步驟6中所涉及到的設定培養條件如下:
光照強度:20001x ;光照時間:12h/d ;培養溫度:20°C。培養地點為無菌培養室。
[0024]7、煉苗移栽
挑選第6步中葉片數多于8片、不定根數多于12，苗高超過6cm的壯苗，將組培瓶先移至常溫15°C下鍛煉一周，移栽前兩天開瓶蓋，并澆適量水保持葉片不萎縮；移栽時將苗去除培養基并洗凈后定植于72孔穴盤，移栽基質采用為泥炭土:蛭石:普通黃土 =1:1:1，高壓蒸汽滅菌處理；移栽后穴盤置于溫室，相對濕度保持80%，每隔7天噴施多菌靈粉劑一次。21天后成活率88%。
[0025]實施例2:與實施例1基本相同，所不同的是:
步驟2至步驟6中所涉及到的設定培養條件如下:光照強度:25001x ;光照時間:15h/d ;培養溫度:24°C。
[0026]步驟(1)中消毒滅菌處理方法為；將清洗后的種子加入清水浸泡lh，浸泡結束后，用流動水反復沖洗，再用蒸餾水沖洗兩次，然后用體積百分比為70%乙醇溶液浸泡約20s，再用質量百分比為0.1%氯化汞溶液浸泡18min，最后用無菌水沖洗5遍，在無菌濾紙上吸干水分備用。
[0027]步驟(2)中在設定的培養條件下10天發芽，發芽培養基PH為6.2。
[0028]步驟(3 )中愈傷組織誘導與分化培養基為:MS+0.5mg/L的6_芐氨基腺嘌呤+0.05mg/L的萘乙酸+質量百分比為3%的蔗糖+質量百分比為0.75%瓊脂，PH為6.2。
[0029]步驟(5)中增殖培養基為:MS+0.5mg/L的6_芐氨基腺嘌呤+0.lmg/L的萘乙酸+質量百分比為3%的蔗糖+質量百分比為0.75%瓊脂，PH為6.2。[0030]步驟(6)中生根培養基為:1/2MS+0.lmg/L的萘乙酸+ 0.8% (質量)的活性炭+3%(質量)的蔗糖+0.75% (質量)瓊脂，PH為6.2。
[0031]步驟(7)中移栽基質的成分按重量比計為，泥炭土:蛭石:普通黃土 =2: 2:1 ;溫室的相對濕度保持90%，14天后成活率92%。
[0032]實施例3:與實施例1基本相同，所不同的是:
步驟2至步驟6中所涉及到的設定培養條件如下:光照強度:25001x ;光照時間:13h/d ;培養溫度:22°C。
[0033]步驟(1)中消毒滅菌處理方法為；將清洗后的種子加入清水浸泡0.7h，浸泡結束后，用流動水反復沖洗，再用蒸餾水沖洗兩次，然后用體積百分比為70%乙醇溶液浸泡約25s,再用質量百分比為0.1%氯化萊溶液浸泡17min,最后用無菌水沖洗5遍,在無菌濾紙上吸干水分備用。
[0034]步驟(2)中在設定的培養條件下13天發芽，發芽培養基PH為6.0。
[0035]步驟(3 )中愈傷組織誘導與分化培養基為:MS+1.5mg/L的6_芐氨基腺嘌呤+0.15mg/L的萘乙酸+質量百分比為3%的蔗糖+質量百分比為0.75%瓊脂，PH為6.0。
[0036]步驟(5)中增殖培養基為:MS+1.5mg/L的6_芐氨基腺嘌呤+0.3mg/L的萘乙酸+質量百分比為3%的蔗糖+質量百分比為0.75%瓊脂，PH為6.0。 [0037]步驟(6)中生根培養基為:l/2MS+0.2 mg/L的萘乙酸+ 0.7%的活性炭+3%的蔗糖+0.75% 瓊脂，PH 為 6.0。
[0038]步驟(7)中移栽基質的成分按重量比計為，泥炭土:蛭石:普通黃土 =1:1:2 ;溫室的相對濕度保持85%，14天后成活率90%。
【權利要求】
1.一種茅蒼術組培快繁的方法，其特征在于:所述方法包括如下步驟: (1)茅蒼術種子處理與消毒滅菌:選取茅蒼術種子，清洗后進行消毒滅菌處理； (2)建立無菌培養體系:將消毒滅菌后種子接入發芽培養基，在設定的培養條件下，10-14天發芽，約一個月后，長成幼苗； (3)愈傷組織誘導:將步驟(2)培養的無菌幼苗去除根系，剪去葉片，保留嫩莖，基部向下接入愈傷組織誘導與分化培養基，在設定的培養條件下，培養10-14天后，嫩莖基部膨大逐漸形成綠色到褐色愈傷組織； (4)愈傷組織分化成苗:在步驟(3)的基礎上繼續培養，20-28天后愈傷組織上分化出叢生芽，45~50天后叢生芽陸續形成叢生苗； (5)無菌苗增殖培養:將步驟(4)中的叢生苗從愈傷組織基座上分株，剪去葉片，保留嫩莖，接入增殖培養基，在設定的培養條件下，5、天后開始出芽，18~24天后形成叢苗； (6)無菌苗生根培養:取步驟(5)中高5cm以上、性狀穩定的單株健壯幼苗，接種至生根培養基，在設定的培養條件下，28天后完成生根； (7)煉苗移栽:挑選步驟(6)中葉片數多于8片、不定根數多于12，苗高超過6cm的壯苗，先將組培瓶移至常溫15°C下鍛煉一周，移栽前兩天開瓶蓋，并澆水保持葉片不萎縮，移栽時將苗去除培養基并洗凈后定植于穴盤，經滅菌處理后，將穴盤置于溫室，相對濕度保持80%以上，14-21天苗長出新葉，即可認為成活。
2.根據權利要求1所述的一種茅蒼術組培快繁的方法，其特征在于，所述設定的培養條件為光照強度:2000-25001χ ;光照時間:12~15h/d ;培養溫度:22±2°C ;培養地點無菌培養室。
3.根據權利要求1所述的一種茅蒼術組培快繁的方法，其特征在于，所述步驟(1)中消毒滅菌處理方法為；將清洗后的種子加入清水浸泡0.5~lh，浸泡結束后，用流動水反復沖洗，再用蒸餾水沖洗兩次，然后用體積百分比為70%乙醇溶液浸泡約2(T30s，再用質量百分比為0.1%氯化萊溶液浸泡15min"l8min,最后用無菌水沖洗至少3遍,在無菌濾紙上吸干水分備用。
4.根據權利要求1所述的一種茅蒼術組培快繁的方法，其特征在于，所述步驟(2)中發芽培養基為MS+質量百分比為3%的蔗糖+質量百分比為0.75%瓊脂，所述培養基PH為5.8~6.2。
5.根據權利要求1所述的一種茅蒼術組培快繁的方法，其特征在于，所述步驟(3)中愈傷組織誘導與分化培養基為MS+0.5^1.5mg/L的6-芐氨基腺嘌呤+0.05、.15mg/L的萘乙酸+質量百分比為3%的蔗糖+質量百分比為0.75%瓊脂，所述培養基PH為5.8飛.2。
6.根據權利要求1所述的一種茅蒼術組培快繁的方法，其特征在于，所述步驟(5)中增殖培養基為MS+0.5^1.5mg/L的6-芐氨基腺嘌呤+0.1-0.3mg/L的萘乙酸+質量百分比為3%的蔗糖+質量百分比為0.75%瓊脂，所述培養基PH為5.8~6.2。
7.根據權利要求1所述的一種茅蒼術組培快繁的方法，其特征在于，所述步驟(6)中生根培養基為1/2MS+0.1~0.2 mg/L的萘乙酸+ 0.5%~0.8%的活性炭+3%的蔗糖+0.75%瓊月旨，所述培養基PH為5.8飛.2，以上百分數均為質量百分數。
8.根據權利要求1所述的一種茅蒼術組培快繁的方法，其特征在于，所述步驟(7)中在穴盤中裝有移栽基質，移栽基質包括如下重量比的組分，泥炭土:蛭石:普通黃土 =廣2:1~2:1 ~2。
9.根據權利要求1所述的一種茅蒼術組培快繁的方法，其特征在于，所述步驟(7)中移栽后每隔7天噴施一次多菌靈粉劑殺菌，噴施量以苗葉片濕潤為宜，待苗長出新葉即可停止噴施。
【文檔編號】A01H4/00GK103960129SQ201410166522
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年4月24日 優先權日:2014年4月24日
【發明者】宋剛, 徐銀, 曹正, 楊士虎, 宋金耀, 謝正林, 黃小忠, 韋穎 申請人:江蘇農林職業技術學院