一種高盆櫻桃（原變種）莖段組織培養獲得再生植株的方法
【專利摘要】本發明公開了一種高盆櫻桃(原變種)莖段組織培養獲得再生植株的方法。該方法包括如下步驟：(1)外植體消毒；(2)誘導培養；(3)增殖培養；(4)生根壯苗培養；(5)煉苗移栽。本發明采用高盆櫻桃(原變種)莖段為外植體進行組織培養，能夠通過選擇優良母本進行取材，快速獲得大量高度一致同時具有優良表型的群體；而且由于組織培養不受季節限制，并且能保持通過有性繁殖不能保持的優良性狀，能夠滿足園林綠化對其需求量的要求，為提高戶外園林景觀的周年觀賞價值具有極其重要的意義。
【專利說明】一種高盆櫻桃(原變種）莖段組織培養獲得再生植株的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及植物組織培養【技術領域】，尤其涉及的是一種高盆櫻桃（原變種）莖段 組織培養獲得再生植株的方法。
【背景技術】
[0002] 高盆搜桃（原變種）（Cerasus cerasoides var. cerasoides)為舊薇科搜屬 (Cerasus)落葉喬木，高達3 - 10米。高盆櫻桃作為野生櫻花資源中極為特殊的一個類群， 是櫻屬植物中惟一在冬季開花的原始種類，花期一般從11月?翌年1月，幾乎沒有任何觀 賞樹木的自然花期與之重疊，團簇花相，花感強烈，其葉初發時為紫紅色，舒展成熟后呈黃 綠色，秋季又逐漸變為黃色，是一種典型的具有明顯季相變化的春色葉和秋色葉樹種。其果 實由于成熟先后時間不同，呈現出五彩斑斕的色彩。高盆櫻桃無論從花期、葉色、果實方面， 都具有很高的觀賞價值，是極具應用潛力的優良園林觀賞樹種，自然花期填補了大自然深 冬無花盛開的空白期，這為提高戶外園林景觀的周年觀賞價值具有極其重要的意義。
[0003] 高盆櫻桃（原變種）廣泛分布于中國云南、西藏等地，尼泊爾、日本、緬甸也有分 布，其中以云南為現代分布中心，天然分布范圍為北緯2Γ 43'?26°，東經96° 12'? 104° 41'，生于溝谷密林中，海拔1300-2200米。高盆櫻桃系陽性樹，喜溫暖濕潤氣候，適 宜生長區氣候條件是年均氣溫13. 2 - 20. 9°C，最冷月（1月）均溫>14. 6°C，且彡10°C，積 溫應在3750°C以上，年降水量>609mm。花期繁盛程度與平均溫度和光照相關，平均溫度高 則開花率高，高盆櫻桃（原變種）雖能忍耐蔭庇環境，但在其生長發育時期則需要充足的光 照，陽光充足時，生長快且花繁而艷，反之則生長不良，花朵稀少。它對土質不甚選擇，以排 水良好的肥沃的沙質酸性土壤為佳，不耐積水。
[0004] 高盆櫻桃（原變種）種子具有壽命短、含水量大、油脂含量高、易失水，不易貯藏的 特點，采取隨采隨播的方法、但出苗率不高，由于種子產量低而不穩定，尚不能滿足其園林 綠化的需求。而且高盆櫻桃（原變種）自然生長耗時長、成型慢、采種困難，良種少，優質種 苗產量低，在一定程度上限制了栽培面積的擴大。因此，通過無性繁殖的手段提高高盆櫻桃 的產量和質量顯得比較重要，但高盆櫻桃的扦插、嫁接的存活率一般僅為30% -50%，因而 其無性繁殖也受到一定限制。而組織培養結合相關生物技術，如基因工程、花藥培養和原 生質融合等，在植物種質資源創新和品種選育等方面的作用日益突出。近20年來，植物組 織培養研究取得了很大的進展，尤其是脫毒技術和快速繁殖，其應用已涉及到觀賞植物、果 樹、農作物、林木、藥用植物及工業原料植物等的繁殖。
【發明內容】
[0005] 本發明所要解決的技術問題是針對現有技術的不足，提供了一種高盆櫻桃（原變 種）莖段組織培養獲得再生植株的方法。
[0006] 本發明的技術方案如下：
[0007] -種高盆櫻桃（原變種）莖段組織培養獲得再生植株的方法，其步驟如下：
[0008] (1)外植體消毒
[0009] 在天氣晴朗的下午，取林間半木質化高盆櫻桃（原變種）新稍，裝入塑料袋中，帶 回室內，稍作修剪，用2. Og/Ι洗衣粉溶液浸泡30min，將表面灰塵用毛刷輕輕刷去，并剪成 獨立的帶頂芽的小枝條，長度5cm ;將小枝條置于燒杯中，流水沖洗3h ;吸干外植體表面的 水分，再用0.2% (W/V)的多菌靈溶液浸泡30min，用蒸餾水清洗2次，放入無菌培養室進行 無菌消毒；在超凈工作臺下用體積百分濃度為75%的酒精消毒10-20S后，再用0. 1% (W/ V)的升汞浸泡4-6min，然后在無菌條件下用無菌水清洗4-6次，用無菌紗布吸干備用；
[0010] ⑵誘導培養
[0011] 從（1)中處理后的小枝條上截取2. 5cm的莖段，每個莖段帶一個芽點，接入誘導培 養基中，先置于黑暗培養箱中培養72-120h，再置于光照培養箱中培養，12d?15d即有芽開 始膨大萌動，40d?45d即長出叢生芽；
[0012] ⑶增殖培養
[0013] 將誘導產生的叢生芽分株，每株約含3個芽，接種到增殖培養基上，置于光照培養 箱內培養，45d后產生大量叢生芽，繼續進行分株增殖培養；
[0014] (4)生根壯苗培養
[0015] 在（3)中培養后的叢生芽中，剪取3-5cm帶頂芽的材料，接種到生根培養基，置于 光照培養箱中培養25d?30d后，獲得生長健壯且具有效根的幼苗；
[0016] (5)煉苗移栽
[0017] 將已經生根的幼苗置于自然光下閉瓶培養10d，然后解開封口膜繩子煉苗5d，接 著打開封口膜煉苗7d，再將幼苗小心取出（避免傷根）栽種，栽種基質是泥炭和紅壤，其體 積比為1:1，28d?30d后長出新的嫩芽，幼苗成活。
[0018] 所述的誘導培養基為 MS 基本培養基 +6-BA0. 6-1. Omg · P+IBAO. 04-0. 08mg · 1^+ 蔗糖3(^·Ι^+瓊脂78·?Α
[0019] 所述的增殖培養基為 MS 基本培養基 +6-ΒΑ0. 5-0. 8mg · P+IBAO. 02-0. 04mg · 1^+ 蔗糖3(^·Ι^+瓊脂78·?Α
[0020] 所述的生根培養基為1/2MS基本培養基+ΙΒΑ0. 05-0. lmg · Ι^+蔗糖30g · I/k瓊 脂 7g · L-1。
[0021] 所述的方法，步驟⑷中，所述光照培養箱的溫度為20_25°C，光照強度為 1500-2000LX，光照時間為 12-15h/d。
[0022] 本發明采用高盆櫻桃（原變種）莖段為外植體進行組織培養，能夠通過選擇優良 母本進行取材，快速獲得大量高度一致同時具有優良表型的群體；而且由于組織培養不受 季節限制，并且能保持通過有性繁殖不能保持的優良性狀，能夠滿足園林綠化對其需求量 的要求，為提高戶外園林景觀的周年觀賞價值具有極其重要的意義。
【具體實施方式】
[0023] 以下結合具體實施例，對本發明進行詳細說明。
[0024] 1、主要試劑及藥品
[0025] 植物生長調節劑6-BA、IBA均購自上海生工生物工程技術服務有限公司；基本培 養基配方中所有試劑、蔗糖、瓊脂粉、以及消毒試劑等均為國產分析純。
[0026] 2、儀器設備
[0027] (1)高壓滅菌鍋：主要用于植物組織培養操作中的培養基及其它多種需要無菌用 品的滅菌。高壓滅菌時，要求的最低壓力為l.〇6kg/cm 2,溫度為121°C，滅菌時間為20min。
[0028] (2)超凈工作臺：超凈工作臺又稱凈化工作臺，主要用于培養材料的接種等無菌 操作過程。由于它具有機動的濾菌裝置，可以在工作人員與操作對象之間形成風幕，使工作 臺面處于基本無菌的狀態。在使用超凈工作臺前應先用70%的酒精棉將臺面及周圍擦凈， 再用紫外燈照射30min左右對臺面進行滅菌，同時啟動風機把貯存于機體內的含菌空氣排 出。經常使用的超凈工作臺每隔半年左右要把濾料清洗一次，否則會因濾料附著太多的灰 塵而影響正常的工作。濾料清洗后，超凈工作臺必須啟動一個小時后才能進行正常的無菌 操作。由于從超凈工作臺中吹出的空氣也不是絕對無菌的，因此操作時要借助于酒精燈進 行無菌操作，否則難以達到完全無菌的效果。本實施例所用的超凈工作臺型號為蘇州安泰 空氣技術有限公司生產的SW-CJ-ZFD。
[0029] (3)智能人工氣候箱：具有光照、加濕功能的高精度冷熱恒溫設備。主要用于植物 材料的恒溫培養、光照培養以及用于愈傷組織分化和植株再生過程的培養。氣候箱的溫度 變化范圍為5-50°C (無光照）、10°C _50°C (有光照），組織培養時的使用溫度常為20-30°C。 氣候箱內通常有四層活動的金屬網格，每層網格都可以放滿培養瓶，但上下層培養物之間 必須保留一定的空隙，以保證箱內空氣的流動和溫度的恒定。本實施例所用的是寧波江南 儀器廠制造的RXZ型智能人工氣候箱。
[0030] 除了上述儀器設備以外，還用到電子天平、電爐、冰箱、容量瓶、燒杯、玻璃棒、移 液管、洗耳球、量筒、酒精燈、試管、組培瓶、解剖刀、鑷子、封口膜等。
[0031] 實施例1
[0032] (1)外植體消毒
[0033] 在天氣晴朗的下午，取林間半木質化高盆櫻桃（原變種）新稍，裝入塑料袋中，帶 回室內，稍作修剪，用2. Og/Ι洗衣粉溶液浸泡30min，將表面灰塵用毛刷輕輕刷去，并剪成 獨立的帶頂芽的小枝條，長度5cm。將小枝條置于燒杯中，流水沖洗3h。吸干外植體表面的 水分，再用0.2% (W/V)的多菌靈溶液浸泡30min，用蒸餾水清洗2次，放入無菌培養室進行 無菌消毒。在超凈工作臺下用75% (V/V)的酒精消毒10s后，再用0.1% (W/V)的升汞浸 泡6min，然后在無菌條件下用無菌水清洗5次，用無菌紗布吸干備用。
[0034] (2)誘導培養
[0035] 從（1)中處理后的小枝條上截取2. 5cm的莖段，每個莖段帶一個芽點，接入誘導培 養基（誘導培養基為MS基本培養基+6-BA0. 6mg · P+IBAO· 04mg · 1^+蔗糖30g · 1^+瓊 脂7g · I71)中，先置于黑暗培養箱中培養100h，再置于光照培養箱中培養，15d即有芽開始 膨大萌動，45d長出叢生芽；
[0036] (3)增殖培養
[0037] 將誘導產生的叢生芽分株，每株含3個芽，接種到增殖培養基（增殖培養基為MS 基本培養基+6-BA0. 5mg · P+IBAO· 02mg · 1^+蔗糖30g · 1^+瓊脂7g · L-1)上，置于光照 培養箱內培養，45d后產生大量叢生芽，繼續進行分株增殖培養；
[0038] (4)生根壯苗培養
[0039] 在（3)中培養后的叢生芽中，剪取4cm帶頂芽的材料，接種到生根培養基（生根培 養基為1/2MS基本培養基+IBAO. 05mg · 1^+蔗糖30g · 1^+瓊脂7g · L-1)，置于培養箱溫度 為20°C、光照強度為15001x光照培養箱中培養30d，每天光照時間為12h，獲得生長健壯且 具有效根的幼苗；
[0040] (5)煉苗移栽
[0041] 將已經生根的幼苗置于自然光下閉瓶培養l〇d，然后解開封口膜繩子煉苗5d，接 著打開封口膜煉苗7d，再將幼苗小心取出（避免傷根）栽種，栽種基質是泥炭和紅壤，其體 積比為1:1，30d后長出新的嫩芽，幼苗成活。
[0042] 實施例2
[0043] (1)外植體消毒
[0044] 在天氣晴朗的下午，取林間半木質化高盆櫻桃（原變種）新稍，裝入塑料袋中，帶 回室內，稍作修剪，用2. Og/Ι洗衣粉溶液浸泡30min，將表面灰塵用毛刷輕輕刷去，并剪成 獨立的帶頂芽的小枝條，長度5cm。將小枝條置于燒杯中，流水沖洗3h。吸干外植體表面的 水分，再用0.2% (W/V)的多菌靈溶液浸泡30min，用蒸餾水清洗2次，放入無菌培養室進行 無菌消毒。在超凈工作臺下用75% (V/V)的酒精消毒15s后，再用0.1% (W/V)的升汞浸 泡5min，然后在無菌條件下用無菌水清洗5次，用無菌紗布吸干備用。
[0045] (2)誘導培養
[0046] 從（1)中處理后的小枝條上截取2. 5cm的莖段，每個莖段帶一個芽點，接入誘導培 養基（誘導培養基為MS基本培養基+6-BA0. 6mg · P+IBAO· 08mg · 1^+蔗糖30g · 1^+瓊 脂7g · I71)中，先置于黑暗培養箱中培養100h，再置于光照培養箱中培養，15d即有芽開始 膨大萌動，40d長出叢生芽；
[0047] (3)增殖培養
[0048] 將誘導產生的叢生芽分株，每株含3個芽，接種到增殖培養基（增殖培養基為MS 基本培養基+6-BA0. 8mg · P+IBAO· 04mg · 1^+蔗糖30g · 1^+瓊脂7g · L-1)上，置于光照 培養箱內培養，45d后產生大量叢生芽，繼續進行分株增殖培養；
[0049] (4)生根壯苗培養
[0050] 在（3)中培養后的叢生芽中，剪取3cm帶頂芽的材料，接種到生根培養基（生根培 養基為1/2MS基本培養基+ΙΒΑ0. 08mg · I/1-蔗糖30g · I/1-瓊脂7g · Γ1)，置于培養箱溫度 為20°C、光照強度為15001x光照培養箱中培養30d，每天光照時間為12h，獲得生長健壯且 具有效根的幼苗；
[0051] (5)煉苗移栽
[0052] 將已經生根的幼苗置于自然光下閉瓶培養10d，然后解開封口膜繩子煉苗5d，接 著打開封口膜煉苗7d，再將幼苗小心取出（避免傷根）栽種，栽種基質是泥炭和紅壤，其體 積比為1:1，28d后長出新的嫩芽，幼苗成活。
[0053] 實施例3
[0054] (1)外植體消毒
[0055] 在天氣晴朗的下午，取林間半木質化高盆櫻桃（原變種）新稍，裝入塑料袋中，帶 回室內，稍作修剪，用2. Og/Ι洗衣粉溶液浸泡30min，將表面灰塵用毛刷輕輕刷去，并剪成 獨立的帶頂芽的小枝條，長度5cm。將小枝條置于燒杯中，流水沖洗3h。吸干外植體表面的 水分，再用0.2% (W/V)的多菌靈溶液浸泡30min，用蒸餾水清洗2次，放入無菌培養室進行 無菌消毒。在超凈工作臺下用75% (V/V)的酒精消毒20s后，再用0.1% (W/V)的升汞浸 泡4min，然后在無菌條件下用無菌水清洗5次，用無菌紗布吸干備用。
[0056] (2)誘導培養
[0057] 從（1)中處理后的小枝條上截取2. 5cm的莖段，每個莖段帶一個芽點，接入誘導培 養基（誘導培養基為MS基本培養基+6-BA1. Omg · P+IBAO· 06mg · 1^+蔗糖30g · 1^+瓊 脂7g · Γ1)中，先置于黑暗培養箱中培養100h，再置于光照培養箱中培養，12d即有芽開始 膨大萌動，40d長出叢生芽；
[0058] (3)增殖培養
[0059] 將誘導產生的叢生芽分株，每株含3個芽，接種到增殖培養基（增殖培養基為MS 基本培養基+6-BA0. 8mg · P+IBAO· 02mg · 1^+蔗糖30g · 1^+瓊脂7g · L-1)上，置于光照 培養箱內培養，45d后產生大量叢生芽，繼續進行分株增殖培養；
[0060] (4)生根壯苗培養
[0061] 在（3)中培養后的叢生芽中，剪取3cm帶頂芽的材料，接種到生根培養基（生根培 養基為1/2MS基本培養基+ΙΒΑ0. lmg · I/1-蔗糖30g · 1^+瓊脂7g · Γ1)，置于培養箱溫度 為20°C、光照強度為15001x光照培養箱中培養25d，每天光照時間為13h，獲得生長健壯且 具有效根的幼苗；
[0062] (5)煉苗移栽
[0063] 將已經生根的幼苗置于自然光下閉瓶培養10d，然后解開封口膜繩子煉苗5d，接 著打開封口膜煉苗7d，再將幼苗小心取出（避免傷根）栽種，栽種基質是泥炭和紅壤，其體 積比為1:1，30d后長出新的嫩芽，幼苗成活。
[0064] 應當理解的是，對本領域普通技術人員來說，可以根據上述說明加以改進或變換， 而所有這些改進和變換都應屬于本發明所附權利要求的保護范圍。
【權利要求】
1. 一種高盆櫻桃（原變種）莖段組織培養獲得再生植株的方法，其特征是，其步驟如 下： (1) 外植體消毒 在天氣晴朗的下午，取林間半木質化高盆櫻桃（原變種）新稍，裝入塑料袋中，帶回室 內，稍作修剪，用2. Og/Ι洗衣粉溶液浸泡30min，將表面灰塵用毛刷輕輕刷去，并剪成獨立 的帶頂芽的小枝條，長度5cm ;將小枝條置于燒杯中，流水沖洗3h ;吸干外植體表面的水分， 再用0. 2 % W/V的多菌靈溶液浸泡30min，用蒸餾水清洗2次，放入無菌培養室進行無菌消 毒；在超凈工作臺下用體積百分濃度為75%的酒精消毒10-20S后，再用0. 1% W/V的升汞 浸泡4-6min，然后在無菌條件下用無菌水清洗4-6次，用無菌紗布吸干備用； (2) 誘導培養 從（1)中處理后的小枝條上截取2. 5cm的莖段，每個莖段帶一個芽點，接入誘導培養基 中，先置于黑暗培養箱中培養72-120h，再置于光照培養箱中培養，12d?15d即有芽開始膨 大萌動，40d?45d即長出叢生芽； (3) 增殖培養 將誘導產生的叢生芽分株，每株約含3個芽，接種到增殖培養基上，置于光照培養箱內 培養，45d后產生大量叢生芽，繼續進行分株增殖培養； (4) 生根壯苗培養 在（3)中培養后的叢生芽中，剪取3-5cm帶頂芽的材料，接種到生根培養基，置于光照 培養箱中培養25d?30d后，獲得生長健壯且具有效根的幼苗； (5) 煉苗移栽 將已經生根的幼苗置于自然光下閉瓶培養l〇d，然后解開封口膜繩子煉苗5d，接著打 開封口膜煉苗7d，再將幼苗小心取出栽種，栽種基質是泥炭和紅壤，其體積比為1: 1，28d? 30d后長出新的嫩芽，幼苗成活。
2. 根據權利要求1所述的方法，其特征是，所述誘導培養基為MS基本培養基+6-BA0. 6 -1. Omg · L klBAO· 04-0. 08mg · L 工+ 鹿糖 30g · L 工+ 瓊脂 7g · L、
3. 根據權利要求1所述的方法，其特征是，所述增殖培養基為MS基本培養基+6-BA0. 5 -〇· 8mg · L klBAO· 02-0. 04mg · L 工+ 鹿糖 30g · L 工+ 瓊脂 7g · L、
4. 根據權利要求1所述的方法，其特征是，所述生根培養基為1/2MS基本培養基 +ΙΒΑ0. 05-0. lmg · L-1+ 鹿糖 30g · L-1+ 瓊脂 7g · I71。
5. 根據權利要求1所述的方法，其特征是，步驟（4)中，所述光照培養箱的溫度為 20-25°C，光照強度為1500-2000LX，光照時間為12-15h/d。
【文檔編號】A01H4/00GK104145814SQ201410357605
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年7月24日 優先權日:2014年7月24日
【發明者】張帆, 萬雪琴, 葉露, 鐘宇, 張雙, 趙景龍, 蔣時姣, 朱逸濤 申請人:四川農業大學