PH調整以改善細胞庫的解凍復蘇的制作方法

本申請要求2014年7月9日提交的美國臨時申請序列號62/022,392的優先權權益，其全部內容通過引用并入本文。

技術領域

本發明涉及冷凍細胞(例如哺乳動物細胞)的方法，用于在冷凍細胞中使用的建庫(banking)和冷凍介質。

背景技術：

通過首先在分批/灌注細胞培養方法中積累細胞、然后收獲細胞用于建庫來產生細胞庫。該方法包括三個階段：細胞積累、收獲和細胞濃縮、以及細胞建庫。收獲方法步驟用于濃縮最終的細胞培養液或使用離心從細胞培養液中提取細胞。隨后的匯集和填充方法用于制備用于長期儲存的細胞庫安瓿。

這些傳統方法可能導致選定細胞系解凍后不一致或差的生存力。細胞建庫方法必要的是在解凍冷凍細胞后需要高的細胞生存力。因此，改進的用于細胞建庫的冷凍細胞的方法是期待的。在建庫后解凍時允許更大細胞生存力的用于冷凍細胞的細胞培養基將是有益的。

本文中出于所有目的引用的所有出版物、專利和專利申請通過引用整體并入本文。

技術實現要素：

一方面，本文提供了一種改善細胞庫的解凍復蘇的方法，所述方法包括在冷凍培養基中冷凍用于建庫的真核細胞(例如，哺乳動物細胞、昆蟲細胞等)，其中所述冷凍培養基包含緩沖溶液和低溫防護劑，并且其中所述冷凍培養基在冷凍之前具有約6.7至約8.5的pH或在冷凍之前已經調節至約6.7至約8.5的pH。

在另一方面，本文提供了冷凍用于儲存的真核細胞(例如，哺乳動物細胞、昆蟲細胞等)的方法，所述方法包括在冷凍培養基中冷凍細胞，其中冷凍培養基包含緩沖溶液和低溫防護劑，并且其中所述冷凍培養基在冷凍之前具有約6.7至約8.5的pH或在冷凍之前已經調節至約6.7至約8.5的pH。

在上文或本文所述方法的一些實施方案中，冷凍培養基在冷凍之前具有約6.7至約8.3、約6.8至約8.3、約6.9至約8.3、約7.0至約8.3、約7.1至約8.3、約7.2至約8.3、約7.3至約8.3、約7.4至約8.3、約7.5至約8.3、約7.2至約8.0、約7.2至約7.8或約7.5的pH。

在上文或本文所述方法的一些實施方案中，冷凍培養基的pH已經調節至約6.7至約8.5、約6.7至約8.3、約6.8至約8.3、約6.9至約8.3、約7.0至約8.3、約7.1至約8.3、約7.2至約8.3、約7.3至約8.3、約7.4至約8.3、約7.5至約8.3、約7.2至約8.0、約7.2至約7.8、或約7.5。在上文或本文所述方法的一些實施方案中，在pH調節之前和/或之后將細胞(例如哺乳動物細胞或昆蟲細胞)與冷凍培養基組合。在一些實施方案中，調節的pH是目標pH或測量pH。在一些實施方案中，目標pH為約6.7至約8.5，或本文所述的任何pH或任何pH范圍。在一些實施方案中，測量pH為約6.7至約8.5，或本文所述的任何pH或任何pH范圍。在上文或本文所述方法的一些實施方案中，所述方法還包括在調節冷凍培養基的pH之前測量含有細胞(例如哺乳動物細胞或昆蟲細胞)的冷凍培養基的初始pH的步驟。在上文或本文所述方法的一些實施方案中，所述方法還包括測量調節的冷凍培養基的pH的步驟。在上文或本文所述方法的一些實施方案中，如果冷凍培養基的測量pH低于目標pH，則所述方法包括重復調節步驟和測量步驟，直到調節的冷凍培養基的pH為約6.7至約8.5，或本文所述的任何pH或任何pH范圍。

在本文或上文所述方法的一些實施方案中，通過加入堿來調節pH。在一些實施方案中，堿選自碳酸鈉、碳酸氫鈉、HEPES(4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸)鈉鹽、氫氧化鈉和氫氧化鉀。在一些實施方案中，根據下式V_堿＝C_堿*V_p(pH_t-pH_i)通過向冷凍培養基中加入堿調節冷凍培養基的pH，其中C_堿是堿特異性系數，V_堿是加入到冷凍培養基中的堿的體積，V_p是冷凍培養基的體積，pH_t是目標pH，pH_i是初始pH。在一些實施方案中，根據下式V_Na2CO3＝0.0085V_p(pH_t-pH_i)通過向冷凍培養基中加入碳酸鈉調節冷凍培養基的pH，其中V_Na2CO3是加入到冷凍培養基中的1M碳酸鈉的體積，V_p是冷凍培養基的體積，pH_t是目標pH，pH_i是初始pH。在一些實施方案中，目標pH是介于約6.7至約8.5之間、約7.2至約8.3之間或本文所述的任何pH或任何pH范圍內的pH。在一些實施方案中，目標pH為7.5。

在上文或本文所述方法的一些實施方案中，在細胞與冷凍培養基組合之前，細胞(例如哺乳動物細胞或昆蟲細胞)在pH約6.2至約6.6的培養基中。

在上文或本文所述方法的一些實施方案中，低溫防護劑是DMSO(二甲基亞砜)、甘油、丙二醇、乙二醇、大分子、糖或其組合。在一些實施方案中，冷凍之前冷凍培養基中的DMSO或甘油的濃度為約5％至約12.5％，以體積計。在一些實施方案中，冷凍細胞(例如哺乳動物細胞或昆蟲細胞)之前冷凍培養基中的DMSO或甘油的濃度為約5％至約10％，以體積計。

在上文或本文所述方法的一些實施方案中，含有細胞(例如哺乳動物細胞或昆蟲細胞)的冷凍培養基在冷凍前具有約8％至約28％的收集細胞體積(packed cell volume)(PCV)的細胞密度。

在上文或本文所述方法的一些實施方案中，所述方法還包括在細胞(例如哺乳動物細胞或昆蟲細胞)與冷凍培養基組合之前、在細胞收獲和濃縮過程中冷卻細胞培養液的步驟。在一些實施方案中，將細胞培養液冷卻至等于或低于約20℃的溫度。在一些實施方案中，將細胞培養液冷卻至等于或低于約10℃的溫度。

在另一方面，本文提供了冷凍用于儲存的真核細胞(例如，哺乳動物細胞、昆蟲細胞等)或改善細胞庫的解凍復蘇的方法，所述方法包括(a)將含有細胞的冷凍培養基的pH調節至pH約6.7至約8.5，其中所述冷凍培養基包含緩沖溶液和低溫防護劑；和(b)冷凍細胞。

在一些實施方案中，將pH調節至約6.7至約8.3、約6.8至約8.3、約6.9至約8.3、約7.0至約8.3、約7.1至約8.3、約7.2至約8.3、約7.3至約8.3、約7.4至約8.3、約7.5至約8.3、約7.2至約8.0、約7.2至約7.8、或約7.5。在一些實施方案中，調節的pH是目標pH或測量pH。在一些實施方案中，目標pH為約6.7至約8.5，或本文所述的任何pH或任何pH范圍。在一些實施方案中，目標pH為約7.5。在一些實施方案中，測量pH為約6.7至約8.5，或本文所述的任何pH或任何pH范圍。

在上文或本文所述方法的一些實施方案中，所述方法還包括在調節冷凍培養基的pH之前測量含有細胞(例如哺乳動物細胞或昆蟲細胞)的冷凍培養基的初始pH的步驟。在一些實施方案中，該方法還包括測量冷凍培養基的調節pH的步驟。在一些實施方案中，如果冷凍培養基的測量pH低于目標pH，則該方法包括重復調節步驟和測量步驟，直到冷凍培養基的調節pH為約6.7至約8.5、約7.2至約8.3、或本文所述的任何pH或任何pH范圍。

在上文或本文所述方法的一些實施方案中，通過加入堿來調節pH。在一些實施方案中，堿選自碳酸鈉、碳酸氫鈉、HEPES鈉鹽、氫氧化鈉和氫氧化鉀。在一些實施方案中，根據下式V_堿＝C_堿*V_p(pH_t-pH_i)通過向冷凍培養基中加入堿調節冷凍培養基的pH，其中C_堿是堿特異性系數，V_堿是加入到冷凍培養基中的堿的體積，V_p是冷凍培養基的體積，pH_t是目標pH，pH_i是初始pH。在一些實施方案中，根據下式V_Na2CO3＝0.0085V_p(pH_t-pH_i)通過向冷凍培養基中加入碳酸鈉調節冷凍培養基的pH，其中V_Na2CO3是加入到冷凍培養基中的1M碳酸鈉的體積，V_p是冷凍培養基的體積，pH_t是目標pH，pH_i是初始pH。在一些實施方案中，目標pH是約6.7至約8.5、或本文所述的任何pH或任何pH范圍。在一些實施方案中，目標pH為約7.5。

在一些實施方案中，在細胞與冷凍培養基組合之前，細胞(例如哺乳動物細胞或昆蟲細胞)在pH為約6.2至約6.6的培養基中。

在一些實施方案中，冷凍培養基中的低溫防護劑是DMSO、甘油、丙二醇、乙二醇、大分子、糖或其組合。在一些實施方案中，在冷凍之前含有細胞(例如，哺乳動物細胞或昆蟲細胞)的冷凍培養基中的DMSO或甘油的濃度為約5％至約12.5％，以體積計。在一些實施方案中，在冷凍細胞之前，含有細胞(例如哺乳動物細胞或昆蟲細胞)的冷凍培養基中的DMSO或甘油的濃度為約5％至約10％，以體積計。

在一些實施方案中，含有細胞(例如哺乳動物細胞或昆蟲細胞)的冷凍培養基在冷凍之前具有約8％至約28％收集細胞體積(PCV)的細胞密度。

在一些實施方案中，所述方法還包括在細胞(例如哺乳動物細胞或昆蟲細胞)與冷凍培養基組合之前、在細胞收獲和濃縮過程中冷卻細胞培養液的步驟。在一些實施方案中，將細胞培養液冷卻至等于或低于約20℃，或等于或低于約10℃的溫度。

在另一方面，本文提供了冷凍用于儲存的真核細胞(例如，哺乳動物細胞，昆蟲細胞等)或改善細胞庫的解凍復蘇的方法，所述方法包括(a)將冷凍培養基的pH調節至pH為約6.7至約8.5，其中所述冷凍培養基包含緩沖溶液和低溫防護劑；(b)將細胞與冷凍培養基組合以形成細胞池；和(c)冷凍細胞池中的細胞。

在一些實施方案中，將pH調節至約6.7至約8.3、約6.8至約8.3、約6.9至約8.3、約7.0至約8.3、約7.1至約8.3、約7.2至約8.3、約7.3至約8.3、約7.4至約8.3、約7.5至約8.3、約7.2至約8.0、約7.2至約7.8、或約7.5。在一些實施方案中，調節的pH是目標pH或測量pH。在一些實施方案中，目標pH為約6.7至約8.5，或本文所述的任何pH或任何pH范圍。在一些實施方案中，測量pH為約6.7至約8.5，或本文所述的任何pH或任何pH范圍。

在一些實施方案中，該方法還包括測量冷凍培養基的調節pH的步驟。在一些實施方案中，如果冷凍培養基的測量pH低于目標pH，則該方法還包括重復調節步驟和測量步驟，直到冷凍培養基的調節pH為約6.7至約8.5，或本文所述的任何pH或任何pH范圍。

在上文或本文所述方法的一些實施方案中，通過加入堿來調節pH。在一些實施方案中，堿選自碳酸鈉、碳酸氫鈉、HEPES鈉鹽、氫氧化鈉和氫氧化鉀。

在上文或本文所述方法的一些實施方案中，在細胞與冷凍培養基組合之前，細胞(例如哺乳動物細胞或昆蟲細胞)在具有pH為約6.2至約6.6的培養基中。

在上文或本文所述方法的一些實施方案中，冷凍培養基中的低溫防護劑是DMSO、甘油、丙二醇、乙二醇、大分子、糖或其組合。在一些實施方案中，細胞池中的DMSO或甘油的濃度為約5％至約12.5％，以體積計，或約5％至約10％，以體積計。

在上文或本文所述方法的一些實施方案中，細胞池含有細胞密度為約8％至約28％收集細胞體積(PCV)的細胞(例如，哺乳動物細胞或昆蟲細胞)。

在上述或本文所述方法的一些實施方案中，所述方法還包括在細胞(例如哺乳動物細胞或昆蟲細胞)與冷凍培養基組合之前、在細胞收獲和濃縮過程中冷卻細胞培養液的步驟。在一些實施方案中，將細胞培養液冷卻至等于或低于約20℃的溫度。在一些實施方案中，將細胞培養液冷卻至等于或低于約10℃的溫度。

在上文或本文所述方法的一些實施方案中，細胞是哺乳動物細胞，如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、NS0鼠骨髓瘤細胞、人細胞或雜交瘤。在一些實施方案中，細胞是昆蟲細胞，如High Five^TM、S2(Schneider 2)、Sf9和Sf21。在上文或本文所述方法的一些實施方案中，細胞(例如哺乳動物細胞或昆蟲細胞)包含編碼多肽的核酸。在一些實施方案中，多肽是治療性蛋白質。在一些實施方案中，治療性蛋白質選自抗體、抗體片段、酶和受體融合蛋白。

在另一方面，本文提供用于冷凍細胞的真核細胞池(例如，哺乳動物細胞池或昆蟲細胞池)，其包含緩沖溶液、低溫防護劑和包含編碼多肽的核酸的真核細胞，其中培養基在冷凍細胞之前具有約6.7至約8.5或約7.2至約8.3的pH(或本文所述的任何pH或任何pH范圍)。在一些實施方案中，細胞是哺乳動物細胞，如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、NS0鼠骨髓瘤細胞、人細胞或雜交瘤。在一些實施方案中，細胞是昆蟲細胞，如High Five^TM、S2(Schneider 2)、Sf9和Sf21。在一些實施方案中，細胞(例如哺乳動物細胞或昆蟲細胞)包含編碼多肽的核酸。在一些實施方案中，多肽是治療性蛋白質。在一些實施方案中，治療性蛋白質選自抗體、抗體片段、酶和受體融合蛋白。

另一方面，本文提供了包含多個容器的細胞庫，每個容器含有(a)包含緩沖液和低溫防護劑的冷凍介質，和(b)包含編碼多肽的核酸的真核細胞(例如哺乳動物細胞或昆蟲細胞)，其中冷凍培養基在冷凍細胞之前具有約6.7至約8.5或約7.2至約8.3的pH(或本文所述的任何pH或任何pH范圍)。在一些實施方案中，容器是安瓿。在一些實施方案中，細胞是哺乳動物細胞，如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、NS0鼠骨髓瘤細胞、人細胞或雜交瘤。在一些實施方案中，細胞是昆蟲細胞，如High Five^TM、S2(Schneider 2)、Sf9和Sf21。在一些實施方案中，細胞(例如哺乳動物細胞或昆蟲細胞)包含編碼多肽的核酸。在一些實施方案中，多肽是治療性蛋白質。在一些實施方案中，治療性蛋白質選自抗體、抗體片段、酶和受體融合蛋白。

應當理解，本文所述的各種實施方案的一種、一些或所有性質可以組合以形成本發明的其它實施方案。本發明的這些和其它方面對于本領域技術人員將變得顯而易見。

附圖說明

圖1顯示了細胞建庫方法流程的示例。

圖2A-2B顯示了在初始pH6.6或6.3的pH調節池中產生的細胞庫的解凍傳代第1天生存力(圖2A)和第4天生長(PCV)(圖2B)的結果。

圖3A-3F顯示了解凍傳代第1天生存力(圖3A、3C和3E)和PCV的整體生長率(圖3B、3D和3F)相對建庫pH，和將pH調節至一個目標pH范圍對九個CHO細胞系(每個產生不同的抗體(抗體1-9))的影響。

圖4A-4B顯示了解凍傳代活細胞密度(VCD)或活細胞計數(VCC)(圖4A)和生存力(％)(圖4B)趨勢，其證明了從初始池pH 6.3調節pH至7.5相對無pH調節的影響。

圖5顯示了在合并過程中活收集細胞體積(VPCV)與活細胞計數(VCC)的比率，其是估計細胞大小的間接方法。數據顯示了冷凍介質(FM)添加和pH調節至pH 7.3、7.6或8.0對細胞大小的影響。較大的比率表示較大的細胞大小。

圖6A-6B顯示了在t0(圖6A)和t2(2小時)(圖6B)時、在初始pH 6.4(目標6.2)或6.6(目標6.7)的pH調節池產生的細胞庫的PCV解凍傳代整體生長率結果。

詳細說明

本文提供了改善細胞庫的解凍復蘇的方法，所述方法包括在冷凍培養基中冷凍用于建庫的真核細胞(例如，哺乳動物細胞、昆蟲細胞等)，其中所述冷凍培養基包含緩沖溶液和低溫防護劑，并且其中所述冷凍培養基在冷凍之前具有約6.7至約8.5的pH。

本文還提供了冷凍用于儲存的真核細胞(例如，哺乳動物細胞、昆蟲細胞等)的方法，所述方法包括在冷凍培養基中冷凍細胞，其中冷凍培養基包含緩沖溶液和低溫防護劑，并且其中冷凍培養基在冷凍之前具有約6.7至約8.5的pH。

本文還提供了冷凍用于儲存的真核細胞(例如，哺乳動物細胞、昆蟲細胞等)或改善細胞庫的解凍復蘇的方法，所述方法包括(a)將含有細胞的冷凍培養基的pH調節至pH約6.7至約8.5，其中所述冷凍培養基包含緩沖溶液和低溫防護劑；和(b)冷凍細胞。

本文還提供了冷凍用于儲存的真核細胞(例如，哺乳動物細胞、昆蟲細胞等)或改善細胞庫的解凍復蘇的方法，所述方法包括(a)將冷凍培養基的pH調節至pH約6.7至約8.5，其中所述冷凍培養基包含緩沖溶液和低溫防護劑；(b)將細胞與冷凍培養基組合以形成細胞池；和(c)在細胞池中冷凍細胞。

本文還提供了用于冷凍真核細胞(例如，哺乳動物細胞、昆蟲細胞等)的真核細胞池，其包含緩沖溶液、低溫防護劑和包含編碼多肽的核酸的真核細胞，其中所述培養基在冷凍細胞之前具有約6.7至約8.5的pH。

本文還提供了包含多個容器的細胞庫，每個容器包含(a)包含緩沖液和低溫防護劑的冷凍培養基，和(b)包含編碼多肽的核酸的真核細胞(例如哺乳動物細胞、昆蟲細胞等)，其中所述冷凍培養基在冷凍細胞之前具有約6.7至約8.5的pH。

定義

術語“培養基”和“細胞培養基”是指用于維持細胞的溶液。培養基可以進一步包含用于生長細胞的營養源。如本領域技術人員所理解的，營養源可以包含細胞用于生長和/或存活所需的成分，或者可以包含有助于細胞生長和/或存活的成分。維生素、必需或非必需氨基酸和微量元素是培養基組分的實例。

“基礎營養培養基”是指包含細胞生長和存活所需的基本營養物的培養基。基礎營養培養基的實例包Eagle氏最低必須培養基(Eagle's Minimum Essential Medium(EMEM))和Dulbecco改良的Eagle氏培養基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM))。

“化學上確定的細胞培養基”或“CDM”是具有確定組合物的培養基，其不含來源于動物或植物的產物，如，例如動物血清和植物蛋白胨。如本領域技術人員將理解的，CDM可以用于多肽生產過程，其中細胞與CDM接觸并將多肽分泌到CDM中。因此，應當理解，組合物可以含有CDM和多肽產物，并且多肽產物的存在不會使CDM在化學上不確定。

“化學上不確定的細胞培養基”是指其化學組分不能被確定并且可以包含一種或多種源自動物或植物來源的產物的培養基，例如動物血清或植物蛋白胨。如本領域技術人員所理解的，化學上不確定的細胞培養基可以含有來源于動物或植物的產物作為營養源。

“冷凍培養基”、“細胞冷凍培養基”或“用于冷凍的細胞培養基”是指含有低溫防護劑的緩沖溶液。冷凍培養基可用于冷凍包含在冷凍培養基中的細胞(例如哺乳動物細胞或昆蟲細胞)。本文所用的“緩沖溶液”是指水基、等滲的pH緩沖鹽溶液，其用于保持細胞膜的完整性，并用作一種或多種低溫防護劑的載體。冷凍培養基還可以含有細胞培養基中存在的額外組分。緩沖液的實例可包括碳酸氫鹽緩沖液、PBS(磷酸鹽緩沖鹽水)、HEPES(4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸)、MOPS(3-(N-嗎啉代)丙磺酸)、TES(N-[三(羥甲基)甲基]-2-氨基乙磺酸)、TRIS(三(羥甲基)氨基甲烷)、TEST(TES/TRIS組合)、及其組合。培養基的實例可包括Eagle氏最低必須培養基(EMEM)和Dulbecco改良的Eagle氏培養基(DMEM)。低溫防護劑保護細胞免受冷凍損傷，并且可以分類為能夠穿過質膜的“滲透型”(例如甘油、二甲基亞砜(DMSO)、丙二醇、乙二醇等)或“非滲透型”(例如大分子、糖等)。

“培養”細胞是指在適合細胞存活和/或生長和/或增殖的條件下使細胞與細胞培養基接觸。

“批次培養”是指在培養過程開始時將用于細胞培養的所有組分(包括細胞和所有培養營養物)供應到培養容器中的培養。

本文所用的短語“補料批次細胞培養”是指批次培養，其中最初供應細胞和培養基到培養容器中，并且在培養終止之前、在培養過程中連續地或離散增量地向培養中補料額外的培養營養物，有或沒有周期性細胞和/或產物收獲。

“灌注培養”是通過例如過濾、包封、錨定到微載體上等將細胞限制在培養物中的培養，其中培養基連續或間歇地引入并從培養容器中取出。

“細胞建庫”或“建庫”是將細胞冷凍至低于零度(sub-zero)的溫度(冷凍保存)以停止酶/化學反應、從而將細胞保持在活的狀態用于以后使用的方法。冷凍細胞可以在低于約0℃(例如，-20℃、-70℃、-80℃或更低)下儲存用于以后使用。例如，細胞可以儲存在安瓿中，以氣相放置在-196℃的包含液氮的冷凍器中。

“培養容器”是指用于培養細胞的容器。培養容器可以是任何大小，只要其可用于培養細胞。

本文所用的術語“滴度”是指通過細胞培養物產生的重組表達的多肽的總量除以給定量的培養基體積。效價通常以每毫升培養基的多肽毫克數為單位表示。

如本文可互換使用的“核酸”是指任何長度的核苷酸的聚合物，包括DNA和RNA。核苷酸可以是脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修飾的核苷酸或堿基、和/或其類似物，或可以通過DNA或RNA聚合酶或通過合成反應摻入聚合物的任何底物。多核苷酸可以包含修飾的核苷酸，如甲基化的核苷酸及其類似物。如果存在，可以在聚合物組裝之前或之后賦予核苷酸結構修飾。

“分離的核酸”是指在其通常環境之外或與之分離的并包括非天然存在的、重組的或天然存在的序列。分離的核酸分子不是其在自然界中存在的形式或設置。因此，分離的核酸分子不同于存在于天然細胞中的核酸分子。然而，分離的核酸分子包括在通常表達蛋白質的細胞中包含的核酸分子，例如其中該核酸分子存在于與天然細胞不同的染色體位置。

“分離的”蛋白質(例如分離的抗體)是已經從其天然環境的組分中鑒定和分離和/或回收的蛋白質。其天然環境的污染物組分是干擾蛋白質的研究、診斷或治療用途的物質，可包括酶、激素和其它蛋白質或非蛋白質溶質。分離的蛋白質包括重組細胞內的原位蛋白質，因為蛋白質天然環境的至少一種組分將不存在。然而，通常通過至少一個純化步驟制備分離的蛋白質。

“純化的”多肽是指多肽的純度已經提高，使得其以比在其天然環境中存在和/或在實驗室條件下最初產生時和/或合成時和/或擴增時更純的形式存在。純度是相對術語，并不一定意味著絕對純度。

“污染物”是指不同于所需多肽產物的物質。污染物包括但不限于：宿主細胞材料，如宿主細胞蛋白；核酸；所需多肽的變體、片段、聚集體或衍生物；另一種多肽；內毒素；病毒污染物；細胞培養介質組分等。污染物還可以包括通過純化過程引入的物質，如過濾的蛋白A。

術語“多肽”和“蛋白質”在本文中可互換使用，是指任何長度的氨基酸聚合物。聚合物可以是直鏈或支鏈的，其可以包含修飾的氨基酸，并且其可以被非氨基酸中斷。該術語還包括已經天然修飾或通過干預修飾的氨基酸聚合物；例如二硫鍵形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其它操作或修飾，如與標記組分的綴合。還包括在定義內的是，例如含有一個或多個氨基酸類似物(包括例如非天然氨基酸等)的多肽，以及本領域已知的其它修飾。包含在本文定義內的多肽的實例包括哺乳動物蛋白，如腎素；生長激素，包括人生長激素和牛生長激素；生長激素釋放因子；甲狀旁腺激素；促甲狀腺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰島素A鏈；胰島素B鏈；胰島素原；促卵泡激素；降鈣素；促黃體激素；胰高血糖素；凝血因子如因子VIIIC、因子IX、組織因子和血管性血友病因子；抗凝血因子如蛋白C；心房利鈉因子；肺表面活性劑；纖溶酶原激活劑，如尿激酶或人尿或組織型纖溶酶原激活物(t-PA)；鈴蟾肽；凝血酶；造血生長因子；腫瘤壞死因子-α和β；腦啡肽酶；RANTES(調節激活正常T細胞表達和分泌)；人巨噬細胞炎性蛋白(MIP-1-α)；血清白蛋白如人血清白蛋白；Muellerian抑制物質；松弛素A鏈；松弛素B鏈；松弛素原(prorelaxin)；小鼠促性腺激素相關肽；微生物蛋白質，如β-內酰胺酶；DNase；IgE；細胞毒性T淋巴細胞相關抗原(CTLA)，如CTLA-4；抑制素；激活素；血管內皮生長因子(VEGF)；激素或生長因子的受體；蛋白A或D；類風濕因子；神經營養因子如骨源性神經營養因子(BDNF)、神經營養因子-3，-4，-5或-6(NT-3，NT-4，NT-5或NT-6)，或神經生長因子如NGF-b；血小板衍生生長因子(PDGF)；成纖維細胞生長因子如aFGF和bFGF；表皮生長因子(EGF)；轉化生長因子(TGF)如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1，TGF-β2，TGF-β3，TGF-β4或TGF-β5；胰島素樣生長因子-I和-II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-1(腦IGF-I)，胰島素樣生長因子結合蛋白(IGFBP)；CD蛋白如CD3，CD4，CD8，CD19和CD20；紅細胞生成素；骨誘導因子；免疫毒素；骨形態發生蛋白(BMP)；干擾素如干擾素-α，-β和-γ；集落刺激因子(CSF)，例如M-CSF，GM-CSF和G-CSF；白細胞介素(IL)，例如IL-1至IL-10；超氧化物歧化酶；T細胞受體；表面膜蛋白；衰變加速因子；病毒抗原，如，例如，AIDS包膜的一部分；轉運蛋白；尋靶受體；地址素；調節蛋白；整合素如CD11a，CD11b，CD11c，CD18，ICAM，VLA-4和VCAM；腫瘤相關抗原如CA125(卵巢癌抗原)或HER2，HER3或HER4受體；免疫粘附素；以及任何上述列出的蛋白質的片段和/或變體，以及與蛋白質(包括例如任何上述蛋白質)結合的抗體，包括抗體片段。

本文中的術語“抗體”以最廣泛的含義使用，并且特別涵蓋單克隆抗體(包括全長單克隆抗體)、多克隆抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)和抗體片段，只要它們展示所需的生物活性。抗體可以是人、人源化的和/或親和力成熟的。

如本文所用的術語“單克隆抗體”是指從基本上同質的抗體群獲得的抗體，即包含各抗體的群體是相同的，除了可能以少量存在的可能的天然存在的突變。單克隆抗體是高度特異性的，針對單個抗原位點。此外，與包含針對不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體制劑相反，每種單克隆抗體針對抗原上的單一決定簇。除了它們的特異性之外，單克隆抗體的優點在于它們可以被未被其它抗體污染的合成。修飾語“單克隆”不應解釋為需要通過任何特定方法產生抗體。例如，根據本發明使用的單克隆抗體可以通過多種技術制備，包括例如雜交瘤方法(例如，Kohler和Milstein,Nature,256:495-97(1975)；Hongo等人,Hybridoma,14(3):253-260(1995),Harlow等人,Antibodies:A Laboratory Manual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,2nd ed.1988)；Hammerling等人,在Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681(Elsevier,N.Y.,1981)中)，在細菌、真核動物或植物細胞中的重組DNA方法(參見，例如美國專利號4,816,567))；噬菌體展示技術(參見例如Clackson等人，Nature，352：624-628(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.222：581-597(1992)；Sidhu等人，J.Mol.Biol.338(2)：299-310(2004)；Lee等人，J.Mol.Biol.340(5)：1073-1093(2004)；Fellouse，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34)：12467-12472(2004)；和Lee等人，J.Immunol.Methods 284(1-2)：119-132(2004)和用于在動物中產生人或人樣抗體的技術，所述動物具有部分或全部人免疫球蛋白基因座或編碼人免疫球蛋白序列的基因(參見例如WO1998/24893；WO1996/34096；WO 1996/33735；WO 1991/10741；Jakobovits等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2551(1993)；Jakobovits等人,Nature 362:255-258(1993)；Bruggemann等人,Year in Immunol.7:33(1993)；美國專利號5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425和5,661,016；Marks等人,Bio/Technology 10:779-783(1992)；Lonberg等人,Nature 368:856-859(1994)；Morrison,Nature 368:812-813(1994)；Fishwild等人,Nature Biotechnol.14:845-851(1996)；Neuberger,Nature Biotechnol.14:826(1996)；和Lonberg and Huszar,Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995)。

術語“藥物制劑”是指這樣形式的制劑，其允許活性成分的生物活性是有效的，并且其不含有施用該制劑的受試者不可接受的毒性的額外成分。這樣的制劑是無菌的。

“藥學上可接受的”載體、賦形劑或穩定劑是對以所采用的劑量和濃度暴露于其中的細胞或哺乳動物是無毒的那些載體、賦形劑或穩定劑(Remington's Pharmaceutical Sciences(第20版)，A.Gennaro編輯，2000，Lippincott，Williams&Wilkins，Philadelphia，PA)。通常生理學上可接受的載體是水性pH緩沖溶液。生理學上可接受的載體的實例包括緩沖液，如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其它有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸；低分子量(小于約10個殘基)多肽；蛋白質，如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑如EDTA；糖醇如甘露醇或山梨醇；成鹽抗衡離子如鈉；和/或非離子表面活性劑，如Tween^TM、聚乙二醇(PEG)和Pluronics^TM。

如本說明書和所附權利要求中所使用的，除非內容另有明確規定，否則單數形式“a”、“an”和“the(該)”包括復數指示物。因此，例如，提及“化合物(a compound)”任選地包括兩種或更多種這樣的化合物的組合等。

應當理解，本文所述的本發明的方面和實施方案包括“包含”、“由...組成”和“基本上由...組成”的方面和實施方案。

本文中對“約”某值或某參數的引用包括(描述)涉及該值或該參數本身的實施方案。例如，涉及“約X”的描述包括“X”的描述。數字范圍包括限定該范圍的數字。

在馬庫什組或其它替代物組的方面描述本發明的方面或實施方案時，本發明不僅包括作為整體列出的整個組，還單獨地包括該組的每個成員和主組的所有可能的亞組，還包括缺少一個或多個組成員的主組。本發明還設想在所要求保護的發明中明確排除任何組成員中的一個或多個。

II.本發明的方法和用途

本文提供在細胞冷凍培養基中冷凍用于培養或儲存的細胞的方法。本文還提供改善細胞庫的解凍復蘇的方法。方法包括在冷凍培養基中冷凍細胞的步驟，其中冷凍培養基包含緩沖溶液和低溫防護劑，并且其中含有細胞的冷凍培養基在冷凍之前具有約6.7至約8.5或約6.7至約8.3的pH值。該方法可以進一步包括將冷凍培養基的pH調節至約6.7至約8.5或約6.7至約8.3的步驟。本文提供的方法可用于制備主細胞庫(MCB)和工作細胞庫(WCB)。在一些實施方案中，本文所述的方法改善解凍后的細胞生存力和/或細胞生長。

用于冷凍和建庫方法中的真核細胞(例如哺乳動物細胞、昆蟲細胞等)可以通過本領域已知的方法包括細胞培養和濃縮方案制備。方法可以包括細胞建庫之前的細胞積累、收獲和細胞濃縮。細胞積累可通過幾種方法發生。一個實例可以使用過程控制的生物反應器用于細胞積累；然而，也可以使用其它方法/培養容器(例如T-燒瓶、搖瓶、滾瓶、旋轉容器等)。收獲和細胞濃縮可以通過離心以及隨后將細胞沉淀物重懸于冷凍培養基中進行。在另一個實例中，可以通過中空纖維過濾器(HFF)在單一步驟中收獲和濃縮細胞。也可以通過使用替代性灌注膜/裝置從細胞培養液中除去培養基實現細胞濃縮(例如漂浮灌注膜、細胞沉淀器、連續循環離心機等)。在本文所述方法的一些實施方案中，將收獲和細胞濃縮過程或收獲的細胞培養液冷卻至等于或低于約20℃(例如，等于或低于約19℃、18℃、17℃、16℃、15℃、14℃、13℃、12℃、11℃和10℃)。

然后，在冷凍細胞之前，可以將沉淀或濃縮的細胞與冷凍培養基組合。在一些實施方案中，沉淀的細胞可以重懸于冷凍培養基中。在一些實施方案中，可將含有濃縮的低溫防護劑的冷凍培養基加入到收獲和濃縮的細胞中，或者可將收獲和濃縮的細胞加入到含有濃縮的低溫防護劑的冷凍培養基中用于細胞建庫。冷凍培養基可以包含緩沖溶液和低溫防護劑。在一些實施方案中，培養基中的緩沖液可以包含兩性離子緩沖液。在一些實施方案中，培養基中的緩沖液可以包含選自碳酸氫鹽緩沖液、PBS(磷酸鹽緩沖鹽水)、HEPES(4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸)、MOPS(3-(N-嗎啉代)丙磺酸)、TES(N-[三(羥甲基)甲基]-2-氨基乙磺酸)、TRIS(三(羥甲基)氨基甲烷)、TEST(TES/TRIS組合)及其組合的緩沖液。在一些實施方案中，冷凍細胞之前冷凍培養中的緩沖液濃度為約10mM至約50mM。在一些實施方案中，冷凍細胞之前冷凍培養基含有約10mM至約35mM碳酸氫鈉(例如約10mM、約15mM、約20mM、約25mM、約30mM或約35mM，包括在這些值之間的任何濃度)。在一些實施方案中，冷凍細胞之前冷凍培養基含有約10mM至約50mM HEPES(例如約10mM、約15mM、約20mM、約25mM、約30mM、約35mM、約40mM、約45mM或約50mM，包括這些值之間的任何濃度)。在一些實施方案中，冷凍細胞之前冷凍培養基含有約10mM至約12mM PBS(例如約10mM、約11mM或約12mM，包括這些值之間的任何濃度)。在一些實施方案中，冷凍細胞之前冷凍培養基含有約10mM至約20mM MOPS(例如約10mM、約12mM、約15mM、約18mM或約20mM，包括這些值之間的任何濃度)。在一些實施方案中，冷凍細胞之前冷凍培養基含有約10mM至約30mM TES(例如約10mM、約15mM、約20mM、約25mM或約30mM，包括這些值之間的任何濃度)。在一些實施方案中，冷凍細胞之前冷凍培養基含有約10mM至約30mM TRIS(例如約10mM、約15mM、約20mM、約25mM或約30mM，包括這些值之間的任何濃度)。在一些實施方案中，冷凍細胞之前冷凍培養基含有約10mM至約30mM TEST(例如約10mM、約15mM、約20mM、約25mM或約30mM，包括這些值之間的任何濃度)。在一些實施方案中，低溫防護劑是滲透劑或非滲透劑。在一些實施方案中，低溫防護劑是選自甘油、二甲基亞砜(DMSO)、丙二醇、乙二醇和糖的試劑。在一些實施方案中，添加到收獲和濃縮細胞中的冷凍培養基是濃縮的冷凍培養基。在一些實施方案中，含有濃縮的低溫防護劑的冷凍培養基可以含有20-30％(v/v)二甲基亞砜(DMSO)或甘油。在一些實施方案中，將濃縮的冷凍培養基(例如，1份冷凍培養基(含有濃縮的低溫防護劑)體積：3份細胞培養液)倒入收獲和濃縮細胞中。在一些實施方案中，在冷凍細胞之前含有細胞的冷凍培養基含有約5％至約12.5％的DMSO或甘油。

在一些實施方案中，冷凍培養基可以進一步包含在細胞培養基中存在的額外組分。在一些實施方案中，冷凍培養基可以含有Eagle氏最低必須培養基(EMEM)或Dulbecco改良的Eagle氏培養基(DMEM)。

在一些實施方案中，制備用于冷凍的細胞(例如哺乳動物細胞或昆蟲細胞)的方法可以進一步包括調節冷凍培養基或包含濃縮的低溫防護劑的冷凍培養基的pH的步驟，其中在沉淀的細胞或濃縮的細胞與冷凍培養基或含有濃縮的低溫防護劑的冷凍培養基組合之前，將pH調節至約6.7至約8.5。在一些實施方案中，制備用于冷凍的細胞(例如哺乳動物細胞或昆蟲細胞)的方法還包括調節含有細胞的冷凍培養基的pH的步驟，其中冷凍培養基的pH調節至約6.7至約8.5。在一些實施方案中，調節的pH是目標pH或測量pH。

在某些實施方案中，在冷凍之前通過收集細胞體積(PCV)測量細胞密度。在一些實施方案中，包含待建庫細胞的冷凍培養基在冷凍之前具有8％至28％(例如，約8％、10％、15％、20％、25％或28％中的任一)PCV的細胞密度。在一些實施方案中，冷凍之前冷凍培養基中的細胞密度可以為約21％PCV。

在一些實施方案中，冷凍培養基中的細胞在冷凍之前分配到安瓿或一次性袋中。在一個示例性實施方案中，該方法包括：使用高壓滅菌自填充注射器將細胞懸液分配到置于濕冰上的高壓滅菌的玻璃安瓿中，密封安瓿，進行完整性測試，并在速率控制的冷凍器中冷凍安瓿，然后將安瓿轉移到液氮冷凍器中長期儲存。

在一些實施方案中，通過使用本文所述的方法改善解凍后的細胞生存力。在一些實施方案中，與在pH 6.7或更低的冷凍培養基中冷凍和/或在收獲過程和解凍期間不冷卻收獲細胞培養物的細胞生存力相比，細胞生存力增加至少約10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或85％中的任意。

pH調節

根據本文所述的方法，可以調節冷凍培養基(含有或不含細胞)的pH，例如通過向培養基中加入堿。在一些實施方案中，將冷凍培養基的pH調節至高于約6.7的pH。在一些實施方案中，將冷凍培養基的pH調節至約6.7和約8.5之間的pH(目標pH或測量pH)。在一些實施方案中，將冷凍培養基的pH調節至約6.8至約8.3之間、約6.9至約8.3之間、約7.0至約8.3之間、約7.1至約8.3之間、約7.2至約8.3之間、約7.3至約8.3之間、約7.4至約8.3之間，約7.5至約8.3之間、約7.6至約8.3之間、約7.7至約8.3之間、或約7.8至約8.3之間。在一些實施方案中，冷凍培養基的pH調節至約7.2至約7.8之間的pH(目標pH或測量pH)。在一些實施方案中，目標pH或測量pH為約7.2至約8.3。在一些實施方案中，目標pH或測量pH為約7.2至約7.8(例如約7.5的pH)。在一些實施方案中，如果第一pH調節不足以將pH增加至目標pH范圍(例如，pH為約7.3至約7.7)，則進行第二pH調節。在一些實施方案中，可以進行多于一次pH調節。

加入以調節pH的堿可以是本領域技術人員熟知的任何堿，但是在示例性實施方案中，堿是碳酸鈉、碳酸氫鈉、HEPES鈉鹽、氫氧化鈉或氫氧化鉀。

可以在冷凍之前的任何點測量冷凍介質的pH，并且可以在冷凍之前的任何時間調節pH。在一些實施方案中，在與待建庫的細胞組合之前測量和/或調節冷凍培養基的pH。在其它實施方案中，在與待建庫的細胞組合之后測量和/或調節冷凍培養基的pH。在一些實施方案中，冷凍培養基的pH被測量和/或調節多于一次。在一些實施方案中，在冷凍之前測量和/或調節冷凍培養基的pH兩次、三次或更多次。在其它實施方案中，在與待建庫的細胞組合之前和之后測量和/或調節冷凍培養基的pH。在一些實施方案中，根據以下公式調節pH：V_堿＝C_堿*V_p(pH_t-pH_i)，其中C_堿是堿特異性系數，V_堿是加入到冷凍培養基的堿的體積，V_p是冷凍培養基的體積，pH_t是目標pH，pH_i是初始pH。如本文所用，初始pH是含有細胞的冷凍培養基的pH(即其與細胞組合之后)，但是在調節pH用于冷凍之前的pH。C_堿表示取決于為了pH調節選擇的堿的類型和濃度的特異性系數。可以根據堿的選擇獲得C_堿系數。在示例性實施方案中，其中堿為1M碳酸鈉，根據下式1進行pH調節：

公式1：計算用于pH值調節添加的堿的體積

V_Na2CO3＝0.0085·V_p·(pH_t-pH_i)

其中V_Na2CO3是添加到冷凍培養基中的1M碳酸鈉的體積，V_p是冷凍培養基的體積，pH_t是目標pH，pH_i是初始pH。初始pH是含有細胞的冷凍培養基的pH(即其與細胞組合之后)，但在調節pH用于冷凍之前。冷凍培養基的目標pH可以是高于生理pH的pH，例如高于7.2的pH。在一些實施方案中，冷凍培養基的目標pH在7.2和8.3之間。在一些實施方案中，冷凍培養基的目標pH在7.2和7.8之間。在一些實施方案中，冷凍培養基的目標pH為7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2和8.3中的任意。

可以使用本領域已知的方法測量冷凍培養基的pH。例如，培養基的pH可以在400(Nova Biomedical)或 FLEX(Nova Biomedical)分析儀上測量。如本文所用，本申請中對pH的所有提及，包括測量pH、目標pH、調節的pH和初始pH，是指在樣品溫度調節至約37℃(例如，36℃至38℃之間或35℃至39℃之間)時測量的pH。

III.冷凍介質

本文提供的細胞冷凍介質可用于方法(例如，冷凍真核細胞(例如，哺乳動物細胞、昆蟲細胞等)中；和/或改善包含真核細胞(例如，哺乳動物細胞或昆蟲細胞)的細胞庫的解凍復蘇的方法和組合物(例如，包含緩沖溶液、低溫防護劑和真核細胞(例如，哺乳動物細胞或昆蟲細胞)的細胞池)中。

在一些實施方案中，本文所述的冷凍培養基包含緩沖溶液和低溫防護劑。在一些實施方案中，緩沖液包含兩性離子緩沖液。在一些實施方案中，緩沖液包括PBS、HEPES、TES、TRIS和TEST。

冷凍培養基可以包含本領域已知的和本文所述的任何低溫防護劑，如DMSO、甘油、乙二醇、不滲透的大分子、糖等。在一些實施方案中，在與待建庫的細胞組合之后在細胞冷凍培養基中DMSO或甘油的濃度為5％-12.5％(v/v)，以體積計。在一些實施方案中，可以通過將含有濃縮緩沖液和/或低溫防護劑的冷凍培養基加入到濃縮細胞中來提供冷凍培養基。在一些實施方案中，冷凍培養基濃縮低溫防護劑可以含有約20％至約30％(v/v)DMSO或甘油。

在一些實施方案中，冷凍培養基可以包含在細胞培養基中存在的額外組分。在一些實施方案中，可以向本文所述的冷凍培養基中加入適于培養哺乳動物細胞的Ham's F10(Sigma)、最低必需培養基([MEM]，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和Dulbecco改良的Eagle氏培養基([DMEM]，Sigma)用于冷凍哺乳動物細胞。此外，可以如本文詳述地補充或修飾在Ham和Wallace,Meth.Enz.,58:44(1979),Barnes和Sato,Anal.Biochem.,102:255(1980),Vijayasankaran等人,Biomacromolecules.,6:605:611(2005),Patkar等人,J Biotechnology,93:217-229(2002),美國專利號4,767,704；4,657,866；4,927,762或4,560,655；WO 90/03430；WO 87/00195；美國專利號Re.30,985；或美國專利號5,122,469中描述的任何介質，所有這些專利的公開內容通過引用整體并入本文。

如本領域技術人員將理解的，本文詳述的細胞冷凍培養基可以包含可用于細胞培養或冷凍的其它組分。例如，應當理解，培養基可以包含額外的組分，如氨基酸(例如谷氨酰胺、精氨酸或天冬酰胺)，維生素(包括但不限于B族維生素，如維生素B1、維生素B2、維生素B3、維生素B6、維生素B7、維生素B9或維生素B12)，過渡金屬(包括但不限于鎳、鐵(例如三價鐵或亞鐵)或鋅)和其它介質組分。本文提供的任何介質也可以根據需要補充激素和/或其它生長因子(例如胰島素、轉鐵蛋白或表皮生長因子)，離子(例如鈉、氯化物、鈣、鎂和磷酸鹽)，緩沖液(如HEPES)，核苷(如腺苷和胸苷)，微量元素(定義為通常以微摩爾范圍的終濃度存在的無機化合物)和葡萄糖或等效能量源。在一些方面，本文提供的冷凍培養基含有源自植物或動物的蛋白質。在一些實施方案中，本文提供的冷凍培養基不含源自植物或動物的蛋白質。也可以以本領域技術人員已知的適當濃度包括任何其它必需的補充物。

如本文所述的細胞冷凍培養基(細胞池)可以進一步包含一個或多個待建庫的細胞。在一個示例性實施方案中，這些細胞是哺乳動物細胞，如CHO細胞。可用于本文所述方法的示例性細胞類型包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、NS0鼠骨髓瘤細胞、人細胞和雜交瘤。在另一個示例性實施方案中，這些細胞是昆蟲細胞，如High Five^TM、S2(Schneider 2)、Sf9和Sf21。在一些實施方案中，細胞是包含編碼多肽(例如治療性蛋白質)的異源核酸的重組細胞。如本領域技術人員將理解的，這些細胞可以進一步包含重組質粒或其它有用的生物化合物。在一些實施方案中，待建庫的細胞可用于生產治療性蛋白質和生物產品，如抗體、抗體片段、酶、受體融合蛋白或其片段。

IV.真核細胞和細胞庫

本文還提供了包含多個容器的細胞庫，每個容器含有包含真核細胞(例如哺乳動物細胞、昆蟲細胞等)的冷凍培養基，所述真核細胞包含編碼多肽的核酸(例如異源核酸)，其中所述培養基在冷凍細胞之前具有約6.7至約8.5的pH。細胞庫可以是前庫(Prebank)、主細胞庫(MCB)或工作細胞庫(WCB)。前庫(Prebank)可以包含含有產生特定多肽的細胞的冷凍(例如，儲存在液氮冷凍器中)容器(例如，安瓿)，從其制備MCB。MCB可以包含含有衍生自Prebank次培養的細胞培養物的冷凍(例如，儲存在液氮冷凍器中)容器(例如安瓿)，從其獲得所有用于生產的后續細胞。MCB根據cGMP產生和儲存，并可用于生產多肽產物。WCB可以包含含有源自MCB次培養的細胞培養物的冷凍(例如，儲存在液氮冷凍器中)容器(例如安瓿)。WCB根據cGMP產生和儲存，并可用于生產多肽產物。在一些實施方案中，容器是安瓿。

如本文所述可以在冷凍培養基中冷凍并保存的真核細胞(例如哺乳動物細胞、昆蟲細胞等)可以包括可以培養和/或可用于產生多肽的任何真核細胞。在一些實施方案中，細胞是哺乳動物細胞，如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。CHO細胞可包括但不限于DHFR-CHO細胞(Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216(1980))，例如 CRL-9096^TM；和CHO-K1( CRL-61^TM)。

哺乳動物細胞的其它實例包括但不限于由SV40轉化的猴腎CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚腎細胞系(293或293細胞亞克隆用于在懸浮培養中生長，Graham等人，J.Gen Virol.36：59(1977))；幼倉鼠腎細胞(BHK，ATCC CCL 10)；小鼠支持細胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.23：243-251(1980))；猴腎細胞(CV1ATCC CCL 70)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宮頸癌細胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬腎細胞(MDCK，ATCC CCL 34)；大鼠(buffalo rat)肝細胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺細胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝細胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺腫瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI細胞(Mather等人，Annals N.Y.Acad.Sci.383：44-68(1982))；MRC 5細胞；FS4細胞；和人肝癌細胞系(Hep G2)。其它有用的哺乳動物宿主細胞系包括骨髓瘤細胞系，如NS0和Sp2/0。對于適合于抗體生產的某些哺乳動物宿主細胞系的綜述，參見例如Yazaki和Wu，Methods in Molecular Biology，248(B.K.C.Lo，編輯，Humana Press，Totowa，N.J.，2003)，第255-268頁。

在一些實施方案中，細胞是昆蟲細胞系，如High Five^TM、S2(Schneider 2)、Sf9和Sf21。

在一些實施方案中，本文所述的細胞(例如哺乳動物細胞或昆蟲細胞)包含編碼多肽的核酸(例如異源核酸)，并且所述細胞可用于產生多肽。在一些實施方案中，將核酸引入細胞中。可以使用本領域已知的用于將核酸引入細胞中的任何方法。例如，可以用包含一種或多種編碼多肽的核酸的載體(例如，表達載體)轉化細胞。在一些實施方案中，細胞是穩定的細胞系。在一些實施方案中，多肽選自抗體、抗體片段、酶和受體融合蛋白。

多肽的實例包括哺乳動物蛋白，如腎素；生長激素，包括人生長激素和牛生長激素；生長激素釋放因子；甲狀旁腺激素；促甲狀腺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰島素A鏈；胰島素B鏈；胰島素原；促卵泡激素；降鈣素；促黃體激素；胰高血糖素；凝血因子如因子VIIIC、因子IX、組織因子和血管性血友病因子；抗凝血因子如蛋白C；心房利鈉因子；肺表面活性劑；纖溶酶原激活劑，如尿激酶或人尿或組織型纖溶酶原激活物(t-PA)；鈴蟾肽；凝血酶；造血生長因子；腫瘤壞死因子-α和-β；腦啡肽酶；RANTES(調節激活正常T細胞表達和分泌)；人巨噬細胞炎性蛋白(MIP-1-α)；血清白蛋白如人血清白蛋白；Muellerian抑制物質；松弛素A鏈；松弛素B鏈；松弛素原(prorelaxin)；小鼠促性腺激素相關肽；微生物蛋白質，如β-內酰胺酶；DNase；IgE；細胞毒性T淋巴細胞相關抗原(CTLA)，如CTLA-4；抑制素；激活素；血管內皮生長因子(VEGF)；激素或生長因子的受體；蛋白A或D；類風濕因子；神經營養因子如骨源性神經營養因子(BDNF)、神經營養因子-3，-4，-5或-6(NT-3，NT-4，NT-5或NT-6)，或神經生長因子如NGF-b；血小板衍生生長因子(PDGF)；成纖維細胞生長因子如aFGF和bFGF；表皮生長因子(EGF)；轉化生長因子(TGF)如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1，TGF-β2，TGF-β3，TGF-β4或TGF-β5；胰島素樣生長因子-I和-II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-1(腦IGF-I)，胰島素樣生長因子結合蛋白(IGFBP)；CD蛋白如CD3，CD4，CD8，CD19和CD20；紅細胞生成素；骨誘導因子；免疫毒素；骨形態發生蛋白(BMP)；干擾素如干擾素-α，-β和-γ；集落刺激因子(CSF)，例如M-CSF，GM-CSF和G-CSF；白細胞介素(IL)，例如IL-1至IL-10；超氧化物歧化酶；T細胞受體；表面膜蛋白；衰變加速因子；病毒抗原，如，例如，AIDS包膜的一部分；轉運蛋白；尋靶受體；地址素；調節蛋白；整合素如CD11a，CD11b，CD11c，CD18，ICAM，VLA-4和VCAM；腫瘤相關抗原如CA125(卵巢癌抗原)或HER2，HER3或HER4受體；免疫粘附素；以及任何上述列出的蛋白質的片段和/或變體，以及與蛋白質(包括例如任何上述蛋白質)結合的抗體，包括抗體片段。

在一些實施方案中，本文所述的細胞(例如哺乳動物細胞或昆蟲細胞)包含編碼抗體的核酸。在一些實施方案中，抗體是單克隆抗體。修飾語“單克隆”表示抗體從基本上同質的抗體群獲得的特征，并且不應解釋為需要通過任何特定方法產生抗體。例如，根據本發明使用的單克隆抗體可以通過多種技術制備，包括例如雜交瘤方法(例如,Kohler和Milstein,Nature,256:495-97(1975)；Hongo等人,Hybridoma,14(3):253-260(1995),Harlow等人,Antibodies:A Laboratory Manual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,第二版 1988)；Hammerling等人,在Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681(Elsevier,N.Y.,1981)中),重組DNA方法(參見,例如美國專利號4,816,567),噬菌體展示技術(參見，例如,Clackson等人,Nature,352:624-628(1991)；Marks等人,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Sidhu等人,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等人,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004)；和Lee等人,J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004),和在具有部分或全部人免疫球蛋白基因座或編碼人免疫球蛋白序列的基因的動物中產生人或人樣抗體的技術(參見，例如WO 1998/24893；WO 1996/34096；WO 1996/33735；WO 1991/10741；Jakobovits等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2551(1993)；Jakobovits等人,Nature 362:255-258(1993)；Bruggemann等人,Year in Immunol.7:33(1993)；美國專利號5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425和 5,661,016；Marks等人,Bio/Technology 10:779-783(1992)；Lonberg等人,Nature 368:856-859(1994)；Morrison,Nature 368:812-813(1994)；Fishwild等人,Nature Biotechnol.14:845-851(1996)；Neuberger,Nature Biotechnol.14:826(1996)；和Lonberg和Huszar,Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995)。在一些實施方案中，抗體是人源化抗體、嵌合抗體、人抗體、源自文庫的抗體或多特異性抗體。在一些實施方案中，抗體是其抗原結合片段。抗原結合片段的實例包括Fab、Fab'、F(ab')₂和Fv片段；雙抗體；直連抗體；單鏈抗體分子；和由抗體片段形成的多特異性抗體。Fab片段含有重鏈和輕鏈可變結構域，并且還含有輕鏈的恒定結構域和重鏈的第一恒定結構域(CH1)。Fab'片段與Fab片段的不同在于通過在重鏈CH1結構域的羧基末端添加幾個殘基，包括來自抗體鉸鏈區的一個或多個半胱氨酸。Fab'-SH是本文對Fab'的命名，其中恒定結構域的半胱氨酸殘基帶有游離巰基。F(ab')₂抗體片段最初作為Fab'片段對產生，在Fab'片段對之間具有鉸鏈半胱氨酸。抗體片段的其它化學偶聯也是已知的。“Fv”是含有完整抗原結合位點的最小抗體片段。“單鏈Fv”或“scFv”抗體片段包含抗體的VH和VL結構域，其中這些結構域存在于單個多肽鏈中。通常，scFv多肽還包含VH和VL結構域之間的多肽接頭，其使得scFv能夠形成抗原結合所需的結構。關于scFv的綜述，參見，例如，Pluckthün，在The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，vol 113，Rosenburg and Moore編輯，(Springer-Verlag，New York，1994)，第269-315頁中。用于純化上述抗體的許多方法可以適合于純化抗原結合抗體片段。

在一些實施方案中，由細胞(例如哺乳動物細胞或昆蟲細胞)中的核酸編碼的抗體，包括治療性和診斷性抗體。在本發明范圍內的抗體包括但不限于：抗HER2抗體，包括曲妥珠單抗(Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4285-4289(1992)，美國專利號5,725,856)；抗-CD20抗體，如美國專利號5,736,137中的嵌合抗-CD20“C2B8”如美國專利號5,721,108B1中的2H7抗體的嵌合或人源化變體，或Tositumomab抗IL-8(St John等人，Chest，103：932(1993)和國際公開號WO 95/23865)；抗-VEGF抗體，包括人源化和/或親和力成熟的抗-VEGF抗體，如人源化抗-VEGF抗體huA4.6.1(Kim等人,Growth Factors,7:53-64(1992)，國際公開號WO 96/30046和WO 98/45331，1998年10月15日公開)；抗-PSCA抗體(WO01/40309)；抗-CD40抗體，包括S2C6及其人源化變體(WO00/75348)；抗-CD11a(美國專利號5,622,700，WO98/23761，Steppe等人，Transplant Intl.4：3-7(1991)和Hourmant等人，Transplantation 58：377-380(1994))；抗-IgE(Presta等人，J.Immunol.151：2623-2632(1993)和國際公開號WO 95/19181)；抗-CD18(1997年4月22日發布的美國專利5,622,700，或1997年7月31日公開的WO 97/26912)；抗-IgE(包括E25，E26和E27；1998年2月3日發布的美國專利號5,714,338或1992年2月25日發布的美國專利號5,091,313，1993年3月4日公開的WO 93/04173，或1998年6月30日提交的國際申請號PCT/US98/13410，美國專利號5,714,338)；抗-Apo-2受體抗體(1998年11月19日公開的WO 98/51793)；抗-TNF-α抗體，包括cA2CDP571和MAK-195(參見1997年9月30日公布的美國專利號5,672,347，Lorenz等人，J.Immunol.156(4)：1646-1653(1996)和Dhainaut等人，Crit.Care Med.23(9)：1461-1469(1995))；抗組織因子(TF)(1994年11月9日授權的歐洲專利號0 420 937B1)；抗人α₄β₇整聯蛋白(1998年2月19日公開的WO 98/06248)；抗-EGFR(如1996年12月19日公開的WO 96/40210中的嵌合或人源化225抗體)；抗-CD3抗體如OKT3(1985年5月7日發布的美國專利號4,515,893)；抗-CD25或抗-tac抗體如CHI-621和(參見1997年12月2日發布的美國專利號5,693,762)；抗-CD4抗體如cM-7412抗體(Choy等人，Arthritis Rheum 39(1)：52-56(1996))；抗-CD52抗體如CAMPATH-1H(Riechmann等人，Nature 332：323-337(1988))；抗-Fc受體抗體，如Graziano等人，J.Immunol.155(10)：4996-5002(1995)中的針對Fc.gamma.RI的M22抗體；抗癌胚抗原(CEA)抗體如hMN-14(Sharkey等人，Cancer Res.55(23Suppl)：5935s-5945s(1995))；針對乳腺上皮細胞的抗體，包括huBrE-3、hu-Mc 3和CHL6(Ceriani等人，Cancer Res.55(23)：5852s-5856s(1995)；和Richman等人，Cancer Res.55(23Supp)：5916s-5920s(1995))；結合結腸癌細胞的抗體如C242(Litton等人，Eur J.Immunol.26(1)：1-9(1996))；抗-CD38抗體，例如AT 13/5(Ellis等人，J.Immunol.155(2)：925-937(1995))；抗-CD33抗體如Hu M195(Jurcic等人，Cancer Res 55(23Suppl)：5908s-5910s(1995)和CMA-676或CDP771；抗-CD22抗體如LL2或LymphoCide(Juweid等人，Cancer Res 55(23Suppl)：5899s-5907s(1995))；抗-EpCAM抗體如17-1A抗-GpIIb/IIIa抗體如abciximab或c7E3Fab抗RSV抗體如MEDI-493抗-CMV抗體如抗-HIV抗體如PRO542；抗肝炎抗體如抗-Hep B抗體抗-CA 125抗體OvaRex；抗獨特型GD3表位抗體BEC2；抗αvβ3抗體抗人腎細胞癌抗體如ch-G250；ING-1；抗人17-1A抗體(3622W94)；抗人結腸直腸腫瘤抗體(A33)；針對GD3神經節苷脂的抗人黑素瘤抗體R24；抗人鱗狀細胞癌(SF-25)；和抗人白細胞抗原(HLA)抗體如Smart ID10和抗HLA DR抗體Oncolym(Lym-1)。本文抗體的優選靶抗原是：HER2受體、VEGF、IgE、CD20、CD11a和CD40。

提供以下實施例以說明而非限制本發明。

實施例

實施例1：池pH、保持溫度和保持時間對解凍的細胞生存力的影響

堿添加方法控制建庫pH(小規模研究#1)

進行研究以測量從最壞情況進行簡單的pH調節和典型池條件(目標初始pH分別為6.2和6.7)增強解凍復蘇的可行性。研究了幾個pH調節目標以確定最佳的建庫pH。使用400(Nova Biomedical)儀器，溫度設置為37℃測量pH。類似地，使用公式1的pH計算基于37℃的樣品溫度。

通過離心使細胞沉淀。通過將細胞在消耗培養基(spent media)中重懸浮至100×10⁶個細胞/mL，為每個測試條件產生細胞池。將細胞池在37℃下攪拌，具有或不具有用于CO₂/O₂交換的氣體滲透膜，以將pH驅動至初始pH條件(6.2或6.7)。在達到初始pH目標時，將池快速冷卻至<10℃，并加入20％(v/v)DMSO冷凍介質(1:3份細胞培養液)。使用公式1計算所需的將pH調節到目標pH 6.9、7.1和7.3的1M碳酸鈉的體積，并進行最終離線pH測量以確認在模擬庫生成之前pH的適當增加(實際建庫pH為6.9、7.1/7.2和7.5)。

解凍結果顯示出高達68％的第1天生存力的顯著改善(對于從pH6.2調整至7.5，從24％至92％)(圖2A)，并且第4天PCV的改善高達0.64％(對于從pH 6.2調整至7.5，從0.17％至0.81％)(圖2B)。

公式1：計算為了pH調節添加的堿體積

V_Na2CO3＝0.0085·V_p·(pH_t-pH_i)

其中V_Na2CO3＝加入的1M碳酸鈉的體積，V_p＝池的體積，

pH_t＝目標pH，pH_i＝初始pH，

堿添加方法控制建庫pH(附加的小規模pH研究)

按照上述類似步驟，進行幾個研究以研究pH調節對其它細胞系的影響。

選擇涵蓋多種細胞類型(DP12，CHO-K1)的總共9個CHO細胞系。在建庫之前的幾天，根據標準方案維持細胞。通過離心使細胞沉淀，對于每個測試條件通過在消耗培養基中重懸至28％收集細胞體積(PCV)，產生約60-90mL的模擬池。在37℃下攪拌池，具有或不具有用于CO₂/O₂交換的氣體滲透膜，以將pH驅動至初始pH條件(6.2或6.7)。選擇這兩個初始pH設定點以模擬在中空纖維過濾器濃縮期間和之后經歷的潛在最壞情況和典型條件。在達到初始pH目標時，將池快速冷卻至<10℃，并加入20％(v/v)DMSO冷凍介質(1:3份細胞培養液)，達到21％的最終PCV。在使用公式1計算調整至pH 7.0、7.3、7.6或8.0所需加入的1M碳酸鈉的體積之后，進行pH調整。進行最終離線pH測量以確認在細胞庫產生之前pH的適當增加。

所有情況一式兩份解凍，一個安瓿解凍到每個容器中。結果表明，之前暴露于較低pH的所有細胞類型在建庫前調節至高于7.3的pH值時可以恢復。每個細胞系表現出對建庫pH的不同敏感性。在大多數情況下，調節至約7.5的pH導致第1天解凍生存力高于80％(圖3A-3F和圖4A-4B)。解凍后的生長率僅在所測試的pH范圍的較低端受到影響。有趣的是，測試的pH范圍的較高端(接近8.0-8.2)沒有負面影響解凍復蘇，盡管其顯著大于正常生理pH。

擴大研究(測試CHO-K1細胞類型)以獲得關于長期暴露于高pH的更多信息。這些研究測試了在(t0)pH調節之后即刻冷凍的模擬建庫(類似于所有以前的小規模測試情況)和在兩個小時后的第二時間點(t2)冷凍的模擬建庫。在保持2小時的期間，將微型池(每個情況約10mL)保持在浸沒于濕冰中的管中。在保持步驟中存在輕微的pH漂移，導致高達0.2pH單位的變化。這些研究結果表明，在本研究中暴露于測試的pH范圍兩小時沒有影響(圖6A-6B中顯示了一個實例)。

收獲期間冷凍細胞培養液的方法

采用“慢泵收獲”方法與冷卻熱交換器組合以將冷卻能力引入傳統的細胞建庫方法中。具體來說，“慢泵收獲”方法需要將典型的收獲流速從約4L/分鐘降低到600mL/分鐘以匹配對于傳統細胞建庫生產運行所記錄的收獲速率。將冷卻熱交換器管線，大小15'長度的15號鉑固化硅膠管完全浸沒在濕冰中，插入收獲流路中。在用水模擬運行期間獲得的溫度趨勢表明“冷卻收獲方法”能夠在中空纖維過濾器濃縮之前的最初30分鐘內將培養溫度降低至約12℃。基于10℃的數據，這種冷卻能力可能暫停細胞代謝并防止低pH漂移。

方法確認研究結果

細胞建庫方法。通過首先在批次/灌注細胞培養過程中積累懸浮-適應的CHO細胞、然后收獲細胞用于建庫來產生細胞庫。細胞的初始來源是來自MCB(用于WCB代)。該方法包括三個階段：細胞積累、收獲和細胞濃縮、以及細胞建庫。細胞積累步驟的目的是在單一批次中產生生產全尺寸MCB或WCB(分別為420×1mL或10mL安瓿)所需的細胞數。在初始放大期間和在搖擺生物反應器過程期間，在選擇性接種培養介質中培養細胞。收獲過程步驟用于通過中空纖維過濾器(HFF)將最終細胞培養液濃縮至用于建庫所需的細胞密度。隨后的匯集和填充過程用于制備細胞庫安瓿用于長期儲存。匯集過程保持在濕冰上，使得保持一定的溫度范圍(約5-10℃)。該過程的處理流程如圖1所示。

使用中空纖維濾筒進行收獲和細胞濃縮過程。離線pH趨勢顯示“冷卻收獲方法”在細胞濃縮過程中有效降低pH下降約0.35pH單位(對于原始和“冷凍”過程分別從至6.66)。在pH調節后，在早(0分鐘)和晚(120分鐘)時間點產生冷卻的細胞庫，以檢查細胞池保持pH的瞬時影響。

評估所得細胞庫在原代培養中的性能。使用系列1:250稀釋(1:10，然后1:25)將細胞庫安瓿解凍至搖瓶而不是生物反應器中。解凍結果成功地證明了目前的方法(冷卻收獲和pH調節)能夠遞送具有可接受的解凍性能的庫。然而，從原始過程產生的細胞庫經歷了生存力的下降，這些新的細胞庫是一致的，并且在第1天生存力范圍為79.1-85.3％(約65％改善)。當細胞隨時間保持在升高的pH下時，沒有觀察到不利影響。

分析顯示來自調節至較高pH的池的細胞尺寸較小(圖5)。這種觀察到的尺寸改變可能指示較高的pH引起細胞脫水(可能來自增加的滲透壓或允許細胞收縮的增加的細胞膜彈性，或兩者)。

結論

確定建庫pH對解凍后性能是最關鍵的，影響第1天解凍生存力高達65％。因此，設計對收獲和建庫步驟有促進作用的方法以減緩細胞暴露于低pH并改善對建庫pH的控制。最終，對該方法引入了兩種促進作用，包括：1)在收獲期間用硅膠管熱交換器冷卻細胞培養液；和2)使用pH調節步驟增加建庫pH至7.5。