本發明涉及卵巢組織冷凍保存，更詳細地說，本發明涉及寵物卵巢組織凍存與復蘇試劑以及寵物卵巢組織凍存與復蘇方法。
背景技術：
寵物(主要指作為伴侶動物的狗和貓)能夠陪伴人類，緩解日常生活中的壓力，愉悅心情，促進人類健康，成為家庭中的一員。隨著我國經濟的發展、老齡化程度的加重，對寵物的需求越來越大。寵物數量增加的同時，寵物食品、寵物用品、寵物培訓等產業得到了蓬勃的發展。寵物健康領域并沒有受到足夠的關注，也尚未形成規范。相比人類健康市場，寵物健康市場有很大的空間尚待挖掘。關愛寵物，關注寵物健康。
國內外一般推薦寵物在6到8月齡時進行絕育或去勢手術。主要優點包括避免很多與生殖激素相關疾病的發生，節省寵物主人在寵物生殖方面的時間花費，控制群體數量。
寵物的絕育是指雌性寵物的卵巢切除術或卵巢子宮切除術。對于寵物個體而言，絕育手術可以降低雌性寵物患乳腺癌的風險，消除子宮積膿的風險，避免卵巢囊腫、難產等疾病的發生。
然而，切除卵巢之后，目前都將卵巢組織丟棄，寵物不僅喪失了生殖能力，體內的激素水平也遭到了破壞。長期的激素水平失調會造成寵物精神狀態萎靡、行為異常，隨著年齡的增長往往導致肥胖等代謝疾病。寵物的運動系統發育也會受到影響，關節韌帶發育不良，骨質疏松等發病風險增高。
目前的處理方式無法給寵物二次選擇的機會，絕育就意味著喪失生殖力與破壞激素水平。相比人類健康領域，卵巢凍存和自體移植技術在不斷發展。理想的方式是通過凍存技術保存生殖力，在必要的時候可選擇性的進行自體移植，恢復生殖力和激素水平。寵物健康領域此類技術尚沒有得到開發和應用。
技術實現要素：
發明要解決的技術問題
本發明的目的是提供一種快速高效的寵物卵巢組織凍存與復蘇試劑以及凍存與復蘇方法。
用于解決上述技術問題的方案
本發明包含寵物卵巢組織凍存試劑和寵物卵巢組織復蘇試劑，成分明確穩定，保質期長，制備后可直接應用于寵物卵巢組織的凍存和復蘇，使用方便，組織復蘇活性高。本發明依托組織玻璃化凍存(快速凍存，直接從常溫進入液氮)理論技術，凍存試劑中聯合使用兩種低溫保護劑二甲基亞砜(DMSO)、丙二醇(PROH)，提高玻璃化效率的同時減低保護劑對細胞的毒性，首次將枸杞多糖(LBP)用于組織玻璃化凍存，在寵物卵巢組織凍存中效果遠優于傳統的蔗糖(SUC)；針對卵巢組織特性，復蘇試劑中首次添加維生素E(VE)和血管內皮生長因子(VEGF)，較大程度的提高了復蘇過程中的氧化應激對細胞造成的損傷。
本發明的第一方面，提供了寵物卵巢組織凍存試劑組，
所述寵物卵巢組織凍存試劑組包括：
(1)凍存試劑1：枸杞多糖2～7W/V％，二甲基亞砜6～14V/V％，丙二醇2～7V/V％，MEM培養基80～90V/V％；
(2)凍存試劑2：枸杞多糖8～10W/V％，二甲基亞砜6～20V/V％，丙二醇5～15V/V％，MEM培養基70～80V/V％；
(3)凍存試劑3：枸杞多糖15～20W/V％，二甲基亞砜6～20V/V％，丙二醇5～15V/V％，MEM培養基70～80V/V％。
較優的，所述凍存試劑組包括：
(1)凍存試劑1：枸杞多糖2～7W/V％，二甲基亞砜6～14V/V％，丙二醇2～7V/V％，MEM培養基80～90V/V％，聚乙烯吡咯烷酮0.1～0.5W/V％，葡萄糖1～10W/V％；
(2)凍存試劑2：枸杞多糖8～10W/V％，二甲基亞砜6～20V/V％，丙二醇5～15V/V％，MEM培養基70～80V/V％，聚乙烯吡咯烷酮0.1～0.5W/V％，葡萄糖1～10W/V％；
(3)凍存試劑3：枸杞多糖15～20W/V％，二甲基亞砜6～20V/V％，丙二醇5～15V/V％，MEM培養基70～80V/V％，聚乙烯吡咯烷酮0.1～0.5W/V％，葡萄糖1～10W/V％。
較優的，所述凍存試劑組包括：
(1)凍存試劑1：枸杞多糖6W/V％，二甲基亞砜10V/V％，丙二醇5V/V％，MEM培養基85V/V％；
(2)凍存試劑2：枸杞多糖9W/V％，二甲基亞砜12V/V％，丙二醇13V/V％，MEM培養基75V/V％；
(3)凍存試劑3：枸杞多糖18W/V％，二甲基亞砜12V/V％，丙二醇13V/V％，MEM培養基75V/V％。
更優的，所述凍存試劑組包括：
(1)凍存試劑1：枸杞多糖6W/V％，二甲基亞砜10V/V％，丙二醇5V/V％，MEM培養基85V/V％，聚乙烯吡咯烷酮0.3W/V％，葡萄糖5W/V％；
(2)凍存試劑2：枸杞多糖9W/V％，二甲基亞砜12V/V％，丙二醇13V/V％，MEM培養基75V/V％，聚乙烯吡咯烷酮0.3W/V％，葡萄糖5W/V％；
(3)凍存試劑3：枸杞多糖18W/V％，二甲基亞砜12V/V％，丙二醇13V/V％，MEM培養基75V/V％，聚乙烯吡咯烷酮0.3W/V％，葡萄糖5W/V％。
本發明的第二方面，提供了寵物卵巢組織復蘇試劑組，所述復蘇試劑組包括：
(1)復蘇試劑1：枸杞多糖35～55W/V％，維生素E 0.05～0.35V/V％，MEM培養基99.65～99.95V/V％；
(2)復蘇試劑2：枸杞多糖25～45W/V％，維生素E 0.05～0.35V/V％，MEM培養基99.65～99.95V/V％；
(3)復蘇試劑3：枸杞多糖15～35W/V％，維生素E 0.05～0.35V/V％，MEM培養基99.65～99.95V/V％；
(4)復蘇試劑4：枸杞多糖5～25W/V％，維生素E 0.05～0.35V/V％，MEM培養基99.65～99.95V/V％，血管內皮生長因子1～10μg/L。
較優的，所述復蘇試劑組包括：
(1)復蘇試劑1：枸杞多糖35～55W/V％，維生素E 0.05～0.35V/V％，MEM培養基99.65～99.95V/V％，聚乙烯吡咯烷酮0.1～0.5W/V％，葡萄糖1～10W/V％；
(2)復蘇試劑2：枸杞多糖25～45W/V％，維生素E 0.05～0.35V/V％，MEM培養基99.65～99.95V/V％，聚乙烯吡咯烷酮0.1～0.5W/V％，葡萄糖1～10W/V％；
(3)復蘇試劑3：枸杞多糖15～35W/V％，維生素E 0.05～0.35V/V％，MEM培養基99.65～99.95V/V％，葡萄糖1～10W/V％；
(4)復蘇試劑4：枸杞多糖5～25W/V％，維生素E 0.05～0.35V/V％，MEM培養基99.65～99.95V/V％，葡萄糖1～10W/V％，血管內皮生長因子1～10μg/L。
較優的，所述復蘇試劑組包括：
(1)復蘇試劑1：枸杞多糖40W/V％，維生素E 0.2V/V％，MEM培養基99.8％；
(2)復蘇試劑2：枸杞多糖30W/V％，維生素E 0.2V/V％，MEM培養基99.8％；
(3)復蘇試劑3：枸杞多糖20W/V％，維生素E 0.2V/V％，MEM培養基99.8％；
(4)復蘇試劑4：枸杞多糖10W/V％，維生素E 0.2V/V％，MEM培養基99.8％，血管內皮生長因子1μg/L。
更優的，所述復蘇試劑組包括：
(1)復蘇試劑1：枸杞多糖40W/V％，維生素E 0.2V/V％，MEM培養基99.8％，聚乙烯吡咯烷酮0.3W/V％，葡萄糖5W/V％；
(2)復蘇試劑2：枸杞多糖30W/V％，維生素E 0.2V/V％，MEM培養基99.8％，聚乙烯吡咯烷酮0.3W/V％，葡萄糖5W/V％；
(3)復蘇試劑3：枸杞多糖20W/V％，維生素E 0.2V/V％，MEM培養基99.8％，葡萄糖5W/V％；
(4)復蘇試劑4：枸杞多糖10W/V％，維生素E 0.2V/V％，MEM培養基99.8％，葡萄糖5W/V％，血管內皮生長因子1μg/L。
本發明的第三個方面是提供一種寵物卵巢組織凍存復蘇試劑套裝，包括上述第一方面的凍存試劑組和第二方面的復蘇試劑組。
本發明的第四個方面是提供一種寵物卵巢組織凍存方法，包括：將離體寵物卵巢組織依次浸入上述第一方面的凍存試劑1、凍存試劑2、凍存試劑3中保持5分鐘以上之后，液氮存儲。
本發明的第五個方面是提供一種寵物卵巢組織復蘇方法，包括：將經凍存的離體寵物卵巢組織依次浸入上述第二方面的復蘇試劑1、復蘇試劑2中，在37±2℃各保持2分鐘以上，之后，移入上述第二方面的復蘇試劑3、復蘇試劑4中，室溫下各保持10分鐘以上。
發明效果
本發明的凍存復蘇試劑組可以使寵物卵巢組織短期(約一周)凍存、復蘇的活率達到90％以上，長期(約三年)凍存、復蘇的活率達到70％以上，能夠很好的冷凍保存生殖力。發明人首次將枸杞多糖引入凍存領域，首次將維生素E引入復蘇試劑，最后一步的復蘇試劑中首次加入微量的血管內皮生長因子，三種物質協同作用，取得了針對寵物卵巢組織凍存、復蘇的非常顯著的協同效果。本發明試劑成分明確，制備方便，利于大規模生產。
一直以來，組織玻璃化凍存領域研究重點在于針對不同的細胞和組織，尋找毒性較小的玻璃化溶液配比方案及提高降、復溫速率的方法。本發明中通過聯用兩種細胞保護劑二甲基亞砜和丙二醇，在保證效果的同時控制細胞保護劑對細胞造成的毒性。
本發明凍存試劑組包含3種試劑，復蘇試劑組包含4種試劑，梯度化升高和降低枸杞多糖的濃度較一步法效果優。
具體實施方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。
下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。
實施例1-5：寵物卵巢組織凍存試劑的制備
(1)以100ml凍存試劑1的制備為例：分別按照表1所示的量，量取二甲基亞砜(購自SIGMA)、丙二醇(購自SIGMA)、MEM培養基(購自GIBCO)放入250ml藍口瓶(購自蜀牛)，輕搖混勻，稱取枸杞多糖(購自斯諾特生物)、聚乙烯吡咯烷酮((簡稱PVP)購自SIGMA)、葡萄糖(購自SIGMA)加入上述瓶中，搖晃混勻。待固體全部溶解后用0.22μm濾器(購自MILLIPORE)過濾除菌，過濾至經過高壓滅菌的100ml藍口瓶(購自蜀牛)，4℃保存備用；
(2)以100ml凍存試劑2制備的為例：分別按照表1所示的量，量取二甲基亞砜(購自SIGMA)、丙二醇(購自SIGMA)、MEM培養基(購自GIBCO)放入250ml藍口瓶(購自蜀牛)，輕搖混勻，稱取枸杞多糖(購自斯諾特生物)、聚乙烯吡咯烷酮(購自SIGMA)、葡萄糖(購自SIGMA)加入上述瓶中，搖晃混勻。待固體全部溶解后用0.22μm濾器(購自MILLIPORE)過濾除菌，過濾至經過高壓滅菌的100ml藍口瓶(購自蜀牛)，4℃保存備用；
(3)以100ml凍存試劑3制備為例：分別按照表1所示的量，量取二甲基亞砜(購自SIGMA)、丙二醇(購自SIGMA)、MEM培養基(購自GIBCO)放入250ml藍口瓶(購自蜀牛)，輕搖混勻，稱取枸杞多糖(購自斯諾特生物)、聚乙烯吡咯烷酮(購自SIGMA)、葡萄糖(購自SIGMA)加入上述瓶中，搖晃混勻。待固體全部溶解后用0.22μm濾器(購自MILLIPORE)過濾除菌，過濾至經過高壓滅菌的100ml藍口瓶(購自蜀牛)，4℃保存備用。
本發明的寵物睪丸組織凍存試劑組包括三種試劑，其中的枸杞多糖濃度依次增大。
表1：凍存試劑的制備
實施例6-10：寵物卵巢組織復蘇試劑的制備
(1)以100ml復蘇試劑1的制備為例：分別按照表2所示的量，量取維生素E(油狀液體，純度標≥98％)(購自SIGMA)、MEM培養基(購自GIBCO)放入250ml藍口瓶(購自蜀牛)，輕搖混勻，稱取枸杞多糖(購自斯諾特生物)、聚乙烯吡咯烷酮(購自SIGMA)、葡萄糖(購自SIGMA)加入上述瓶中，搖晃混勻。待固體全部溶解后用0.22μm濾器(購自MILLIPORE)過濾除菌，過濾至經過高壓滅菌的100ml藍口瓶(購自蜀牛)，4℃保存備用；
(2)以100ml復蘇試劑2的制備為例：分別按照表2所示的量，量取維生素E(購自SIGMA)、MEM培養基(購自GIBCO)放入250ml藍口瓶(購自蜀牛)，輕搖混勻，稱取枸杞多糖(購自斯諾特生物)、聚乙烯吡咯烷酮(購自SIGMA)、葡萄糖(購自SIGMA)加入上述瓶中，搖晃混勻。待固體全部溶解后用0.22μm濾器(購自MILLIPORE)過濾除菌，過濾至經過高壓滅菌的100ml藍口瓶(購自蜀牛)，4℃保存備用；
(3)以100ml復蘇試劑3的制備為例：分別按照表2所示的量，量取維生素E(購自SIGMA)、MEM培養基(購自GIBCO)放入250ml藍口瓶(購自蜀牛)，輕搖混勻，稱取枸杞多糖(購自斯諾特生物)、葡萄糖(購自SIGMA)加入上述瓶中，搖晃混勻。待固體全部溶解后用0.22μm濾器(購自MILLIPORE)過濾除菌，過濾至經過高壓滅菌的100ml藍口瓶(購自蜀牛)，4℃保存備用；
(4)以100ml復蘇試劑4的制備為例：分別按照表2所示的量，量取維生素E(購自SIGMA)、MEM培養基(購自GIBCO)放入250ml藍口瓶(購自蜀牛)，輕搖混勻，稱取枸杞多糖(購自斯諾特生物)、葡萄糖(購自SIGMA)、血管內皮生長因子(購自SIGMA)加入上述瓶中，搖晃混勻。待固體全部溶解后用0.22μm濾器(購自MILLIPORE)過濾除菌，過濾至經過高壓滅菌的100ml藍口瓶(購自蜀牛)，4℃保存備用。
本發明的寵物卵巢組織復蘇試劑組包括四種試劑，其中的枸杞多糖濃度依次降低。
表2：復蘇試劑的制備
對照例
對照A組：除了在復蘇試劑中去除維生素E和血管內皮生長因子外，其他條件與實施例5和實施例10相同。
對照B組：在實驗對照A組基礎上將枸杞多糖換成等量的蔗糖，其他條件不變。
對照C組：除了將凍存和復蘇試劑中的枸杞多糖換成等量的蔗糖外，其他條件與實施例5和實施例10相同。
傳統對照組，采用文獻試劑和方法凍存，簡述如下：凍存試劑中包括2mol/L二甲基亞砜、2mol/L丙二醇、不同濃度的蔗糖，復蘇試劑中包含0.5～0.125mol/L蔗糖，具體操作步驟見文獻中的玻璃化凍存方案(李宇彬,周燦權,楊國奮,等.人卵巢組織兩種超低溫凍存方法的研究[J].中山大學學報醫學科學版,2006,27(6):704-708.)。
表3：
效果試驗：
1.寵物卵巢組織凍存、復蘇試劑的短期效果驗證
(1)卵巢組織的獲取：在寵物主、寵物醫生知情同意的情況下，分別收集6～8月齡寵物狗進行絕育手術時切除下來的卵巢組織。20分鐘內，剔除多余的脂肪、筋膜，修剪成1～2cm厚度的組織片，浸泡在含有10％血清(購自GIBCO)的DMEM培養基(購自GIBCO)中，置于冰上。
(2)卵巢組織的切片：用手術刀片將卵巢組織片進一步修剪，厚度控制在0.8～1.2mm，長度控制在5～10mm，寬度控制在2～5mm。修剪操作全程在10％血清DMEM中冰上操作，于30分鐘內完成。
預留部分組織切片不進行后續的凍存復蘇操作，用作為后續對照試驗的未凍存組織切片(以下簡稱“新鮮對照組”)。
(3)卵巢組織的凍存與復蘇：隨機取出(2)中的卵巢組織切片3片，使用無菌紗布吸干凈多余水分。將組織切片浸入實施例1的凍存試劑1中，常溫10分鐘。組織切片取出后，繼續使用無菌紗布吸干凈多余水分，移入凍存試劑2中，常溫20分鐘。同樣的操作移入凍存試劑3中，常溫30分鐘。取出組織切片，放置于金屬銅網條上，使用無菌紗布吸干凈多余水分。立即投入事先準備好的無菌液氮中，5分鐘后即可將組織切片連同銅網條轉入事先預冷的凍存管中，液氮存儲。1周后，準備復蘇凍存組織，37℃水浴箱預熱實施例6的復蘇試劑1、復蘇試劑2。液氮中取出組織切片連同銅網條迅速置入復蘇試劑1中，輕搖，37℃2分鐘，可見組織切片從銅網條上脫落，將組織切片移入復蘇試劑2中，37℃5分鐘。然后依次將組織切片移入復蘇試劑3、復蘇試劑4中，室溫各10分鐘(簡稱為實施例1+6)。
同樣的條件下進行實施例2+7、實施例3+8、實施例4+9、實施例5+10、對照A組、對照B組、對照C組、傳統對照組的實驗。
(4)組織培養上清雌二醇檢測及正常原始卵泡計數：將(3)中各實施例、對照組以及(2)中的新鮮對照組的組織切片分別置入細胞培養6孔板1個孔中培養，2ml 10％DMEM培養基，37℃，5％CO2細胞培養箱中培養48小時。收取500ul上清，使用雌二醇(E2)檢測試劑盒(購自IMMUNOCLONE)檢測卵巢組織雌二醇分泌量。組織切片用常規石蠟包埋后制作HE染色切片，顯微鏡下統計100個原始卵泡，統計正常原始卵泡數量。各實驗分別重復三次，取平均值作為實驗結果，實驗結果如表4所示，表4反映凍存1周后復蘇組織雌二醇分泌功能情況以及短期凍存復蘇正常原始卵泡占比情況。無論上清雌二醇分泌情況還是正常原始卵泡占比，實施例凍存復蘇后的結果都接近新鮮對照組，并且各實施例結果優于對照A組、對照B組、對照C組以及傳統對照組，說明本發明的枸杞多糖、維生素E、血管內皮生長因子協同作用，對凍存復蘇活率的提高具有顯著效果。
表4：凍存、復蘇試劑的短期效果
注：實施例1+6表示實施例1的凍存試劑+實施例6的復蘇試劑組合使用，下同。
此外，本發明采用同樣的方法收集6～8月齡寵物貓進行絕育手術時切除下來的卵巢組織，進行了上述(1)-(4)的凍存和復蘇試驗，冷凍試劑為實施例5，復蘇試劑為實施例10，結果顯示雌二醇分泌量為58pmol/L，正常原始卵泡百分比為92％。
2.寵物卵巢組織凍存、復蘇試劑的長期效果驗證
(1)卵巢組織的獲取：在寵物主、寵物醫生知情同意的情況下，分別收集6～8月齡寵物狗進行絕育手術時切除下來的卵巢組織。20分鐘內，剔除多余的脂肪、筋膜，修剪成1～2cm厚度的組織片，浸泡在含有10％血清(購自GIBCO)的DMEM培養基(購自GIBCO)中，置于冰上。
(2)卵巢組織的切片：用手術刀片將卵巢組織片進一步修剪，厚度控制在0.8～1.2mm，長度控制在5～10mm，寬度控制在2～5mm。修剪操作全程在10％血清DMEM中冰上操作，于30分鐘內完成。
(3)卵巢組織的凍存與復蘇：取出(2)中的卵巢組織切片18片，隨機分成6組，每組3片，使用無菌紗布吸干凈多余水分。取5組組織切片分別浸入5組實施例的凍存試劑1中，常溫10分鐘。組織切片取出后，繼續使用無菌紗布吸干凈多余水分，移入凍存試劑2中，常溫20分鐘。同樣的操作移入凍存試劑3中，常溫30分鐘。取出組織切片，放置于金屬銅網條上，使用無菌紗布吸干凈多余水分。立即投入事先準備好的無菌液氮中，5分鐘后即可將組織切片連同銅網條轉入事先預冷的凍存管中，液氮存儲。設置不同的時間點復蘇組織，時間點設置為0.5年、1年、2年、3年。準備復蘇凍存組織時，37℃水浴箱預熱復蘇試劑1、復蘇試劑2。液氮中取出組織片連同銅網條迅速置入復蘇試劑1中，輕搖，37℃2分鐘，可見組織切片從銅網條上脫落，將組織片切移入復蘇試劑2中，37℃5分鐘。然后依次將組織切片移入復蘇試劑3、復蘇試劑4中，室溫各10分鐘。
取1組組織切片進行傳統對照組的試驗，采用文獻試劑和方法凍存，簡述如下：凍存試劑中包括2mol/L二甲基亞砜、2mol/L丙二醇、不同濃度的蔗糖，復蘇試劑中包含0.5～0.125mo l/L蔗糖，具體操作步驟見文獻中的玻璃化凍存方案(李宇彬,周燦權,楊國奮,等.人卵巢組織兩種超低溫凍存方法的研究[J].中山大學學報醫學科學版,2006,27(6):704-708.)。
(4)組織培養上清雌二醇檢測及正常原始卵泡計數：將各實施例和傳統對照組的組織切片分別置入細胞培養6孔板1個孔中培養，2ml 10％DMEM培養基，37℃，5％CO2細胞培養箱中培養48小時。收取500u l上清，使用雌二醇(E2)檢測試劑盒(購自IMMUNOCLONE)檢測卵巢組織雌二醇分泌量。組織片用常規石蠟包埋后制作HE染色切片，顯微鏡下統計100個原始卵泡，統計正常原始卵泡數量。每個時間點隨機設置3個組織樣品。實驗結果如表5所示，表5反映凍存0.5、1、2、3年后復蘇組織雌二醇分泌功能情況以及長期凍存復蘇正常原始卵泡占比情況。由表5可知，本發明實施例組效果在長期保存條件下遠優于傳統對照組，并且各組凍存效果在1年左右稍有變化后趨于穩定，說明玻璃化凍存技術的優劣主要體現在組織出入液氮時的保護，組織存儲于液氮后保存效果較為穩定。
表5：凍存、復蘇試劑的長期效果
以上已對本發明創造的較佳實施例進行了具體說明，但本發明創造并不限于所述實施例，熟悉本領域的技術人員在不違背本發明創造精神的前提下還可作出種種的等同的變型或替換，這些等同的變型或替換均包含在本申請權利要求所限定的范圍內。