一、技術領域
本發明涉及一種青貯玉米的四倍體誘導方法，屬于植物育種技術領域
二、
背景技術：
青貯玉米大多數品種營養價值高、單位面積生物學產量較高，具有氣味芳香、柔軟多汁、適口性好、原料中營養成分保存多、損失少等特點，是奶牛、肉牛一年四季特別是冬春季節的優良飼料。在“秸稈畜牧業”的形勢下，對于滿足奶牛、肉牛養殖業快速發展的飼草料需求，緩解草場壓力，青貯玉米在生產和利用上具有較大的潛力，也是解決我國糧飼供需矛盾，實現糧飼有效性供給的較好途徑。
自然界廣泛存在植物多倍體現象，多倍體具有繁茂性、碩大性、適應力強、生物產量高等優點，一直是育種家長期追求的目標。同源多倍體育種已在葡萄(宗樺，2008)、蘋果(康喜亮，2011)、水稻(符策強，2013)、扁蓿豆(王璐，2014)等多種作物中取得成功。但同源四倍體玉米應用于生產的報道還未見。四倍體玉米株型較大、葉片寬大肥厚、莖和根較粗壯、以及多果穗等特性，是極佳的青貯飼料來源。但是同源四倍體玉米誘導方法的報道較少，秋水仙素對種芽進行誘變是較為常見的方法。然而，在過去的研究中，同源四倍體玉米研究最重要的技術性難題就是染色體組多倍化的誘導頻率太低，以至于同源四倍體玉米的種質資源相當有限。同源四倍體玉米的誘導頻率太低的主要原因應該歸咎于傳統的種芽誘導技術和玉米種胚的形態結構，其原因主要包括以下兩個方面：
(1)種芽的結構較為復雜，在種芽的生長點外圍還包裹著胚芽鞘、不完全葉、第一片真葉、第二片真葉等多個組織，加倍溶液需要經過多個組織才能滲透到種芽的生長點并對其細胞產生染色體組多倍化的誘導作用，因此加倍溶液滲透到種芽的生長點細胞位置的難度較大。
(2)在種芽內具有不同染色體組倍性的生長點細胞的發育進度不一致，即二倍體分生細胞在生長發育上比多倍體分生細胞更有優勢，以致二倍體分生細胞所產生的一大批子細胞限制了多倍體分生細胞及其子細胞的生長發育速度，最后只能由大部分二倍體分生細胞所產生的一大批子細胞完成植株的形態建成，因此當代植株的玉米果穗被誘導的幾率很低。
以上兩方面原因導致利用傳統的種芽誘導法獲得同源四倍體玉米的頻率較低，因此探索一種提高四倍體青貯玉米誘導率的加倍技術，為四倍體青貯玉米研發和應用奠定基礎。
三、
技術實現要素：
鑒于現有技術四倍體青貯玉米誘導頻率太低的問題，本發明采用萌動期誘導和幼苗生長點誘導相結合，建立一種四倍體青貯玉米的誘導方法。該方法可以顯著提高同源四倍體青貯玉米的誘導頻率，以期在最短的時間內創制出更多的同源四倍體青貯玉米新種質，提高育種效率，縮短育種年限。
1.誘導方法：
(1)浸種：以二倍體玉米為試驗材料，20-25℃條件下浸泡24h。4℃條件下浸泡12h，移至20-25℃條件下浸泡2-3h，重復本步驟。
(2)加倍溶液萌動期處理：倒掉清水，加入加倍溶液中，4℃的冰箱中放置12h。
(3)紅外線照射：用清水沖洗種子，利用紅外線燈(50hz)照射20-30s，20-25℃條件下清水浸泡24h。
(4)加倍溶液苗期處理：將種子種植在育苗盆中，正常管理，待幼苗長至3-4葉時利用注射器向幼苗莖中的生長點注射加倍溶液0.5ml，間隔12h注射一次，共注射2-3次。
(5)倍性檢測及移栽：待幼苗長至五葉時，利用流式細胞儀進行倍性檢測，記錄檢測結果，并將檢測后的幼苗進行移栽。
2.有益效果
與傳統技術相比，本發明涉及的四倍體青貯玉米誘導方法具有如下優勢：
(1)將侵泡在清水中的種子，反復置于4℃和20-25℃，能有效提高種子活性，提高加倍效率；采用紅外線照射提高細胞內酶的活性，促進種子萌發；加倍溶液中加入0.3％的二甲基亞砜可以提高細胞膜的通透性，從而提高秋水仙素的誘導效率。
(2)將加倍溶液直接注入幼苗的生長點細胞，間隔12h處理一次，處理2-3次，這有助于提高不同染色體組倍性的生長點細胞的加倍概率，提高多倍體分生細胞及其子細胞的數目，從而提高多倍體幼苗的誘導頻率。
四、附圖說明
圖1加倍溶液注射幼苗生長點細胞
圖2加倍后胚芽變化情況，表1流式細胞儀檢測染色體加倍結果，表2品種間加倍率的方差分析
圖3加倍后植株田間表現
五、具體實施方式
(1)浸種：將青貯玉米的種子平鋪放入玻璃培養皿中，加入清水至剛剛沒過種子，20-25℃的培養箱中培養24h。取出培養皿，放入4℃的冰箱中12h，移至20-25℃的培養箱中培養2-3h，重復本步驟。
(2)加倍溶液萌動期處理：將培養皿中的清水倒掉，加入加倍溶液，沒過種子即可，4℃的冰箱中放置12h。
(3)紅外線照射：用清水沖洗種子，利用紅外線燈(50hz)每皿照射20-30s，加入清水后，在20-25℃培養24h。
(4)加倍溶液苗期處理：將種子種植在育苗盆中，正常管理，待幼苗長至3-4葉時利用1ml注射器向幼苗莖中的生長點部位注射加倍溶液0.5ml，直至溶液從葉心中滲出，間隔12h注射一次，共注射2-3次。注射方法如圖1所示。
(5)倍性檢測及移栽：待幼苗長至五葉時，利用流式細胞儀進行倍性檢測，檢測結果如表1所示，每次檢測30株，三次重復，遼單527，遼單青貯178和遼原一號加倍率分別為36.3％，20.5％和21％。品種間的f統計量值為2.55，對應的p值為0.139，因此在0.05水平下認為不同品種間的加倍率差異不顯著(表2)。加倍后，胚芽變得粗壯(圖2)。將檢測后的幼苗進行移栽，比較不同倍性間植株差異(圖3)。其中加倍后的四倍體植株(a)要高于對照組(b)，同時葉面積和葉片厚度也有一定增加；而經過秋水仙素處理后未加倍成功的植株(c)與對照組無明顯差異。