本發明涉及微生物培養
技術領域：
，具體涉及一種減少液體菌種培養過程操作污染的方法。
背景技術：
：液體菌種是指用液體培養基，在生物發酵罐中，經過深層培養技術生產的液體形態的食用菌菌種。在蛹蟲草菌絲體等液體菌種在培養過程中，容易引入操作污染，最終造成培養的蛹蟲草菌絲體中含有較多雜菌，且現有培養過程中，操作污染不可控制，無法得到解決。而引入操作污染的方法較多，工作人員在操作過程中無法做到一一排查，很難提高最終成品菌種的純度。基于此，研究并開發設計一種減少液體菌種培養過程操作污染的方法。技術實現要素：本發明所要解決的技術問題是現有蛹蟲草菌絲體等液體菌種培養過程中引入污染最終導致成品中含雜菌較多，影響產品純度。本發明的目的在于提供一種減少液體菌種培養過程操作污染的方法，解決了培養過程中操作污染的技術問題。本發明通過下述技術方案實現：一種減少液體菌種培養過程操作污染的方法，包括以下操作步驟：)配制培養基將配制好的培養基分裝到培養管中；2)消毒滅菌對培養管中的培養基滅菌30—45分鐘；3)接種在無菌條件下，將第一連接管的兩端分別插入至第一培養瓶、第二培養瓶中，從培養管中選取菌種塊通過第一培養瓶的開口置于第一培養瓶的瓶內，封口，第一培養瓶內裝有固體培養基，第二培養瓶為空瓶，第一培養瓶內接種后，第一培養瓶內固體培養基通過第一連接管移入第二培養瓶中，在18—20℃下培養，培養3—5天即可；第三培養瓶中裝入液體培養基，第二培養瓶與第三培養瓶通過第二連接管連接，待第一培養瓶、第二培養瓶內有菌落出現時，將第三培養瓶中的液體培養基分別反壓至第一培養瓶、第二培養瓶內進行深層培養，然后將第一培養瓶、第二培養瓶內培養好的菌種通過密閉管道反壓至發酵罐中培養。在這個培養過程中，僅存在一次開口，即在將培養管中的菌種塊置于第一培養瓶瓶內這一操作中，在后續處理操作中將第一培養瓶內的固體培養基通入第二培養瓶，第三培養瓶的液體培養基分別反壓至第一培養瓶、第二培養瓶內，的操作均通過消毒滅菌處理的連接管完成，未對第一培養瓶、第二培養瓶、第三培養瓶進行開口操作過。同時，培養過程中應用到的容器、連接管均經過滅菌徹底處理，確保未引入污染。因此，整個操作過程中，有效避免了培養過程引入操作污染的問題，從根本上解決了液體菌種培養過程中操作污染引入的路徑。本發明技術方案中，第三培養瓶的類型還可為發酵罐，將接種后的第一培養瓶、第二培養瓶可直接壓入發酵罐中進行菌落大規模培養，實現全程控制無污染大生產。整個操作過程中，涉及到的容器均經過消毒滅菌處理，未引入操作污染，從而避免其中操作污染問題。在本技術方案中，第一培養瓶內接種的固體培養基，還可將其引入多個培養瓶內，進行接種，如第一培養瓶內的固體培養基通過消毒滅菌后的連接管分別通入至第一個培養瓶、第二個培養、第三個培養瓶、第四個培養瓶至第N個培養瓶，然后將裝有液體培養基的培養瓶內的培養基通過滅菌消毒后的連接管分別通入至上述已經裝有固體培養基的第一個培養瓶、第二個培養瓶、第三個培養瓶至第N個培養瓶進行深層培養，經深層培養后，再輸送至發酵罐中進行擴大規模培養。上述描述中涉及到深層培養方法為菌種接種到發酵容器內，使菌液細胞游離懸浮在液體培養基中，并進行生長培養的一種方法，該方法的具體操作步驟及其原理為所屬領域的公知常識，不再詳述。優選，所述菌種塊面積為4mmx5mm—6mmx6mm，在接種過程中，從培養管中選取的菌種塊的面積，可根據需要進行調整，只要能滿足接種的要求。菌種塊面積為4mmx5mm—6mmx6mm，接種到第一培養瓶內，選取的接種量不宜過大或過小，需滿足將其接種到第一培養瓶內后，能夠更好的萌發，促進菌種的生長。優選，所述培養管中選取的培養基體積為每支培養管體積的1/5-1/4。優選，所述步驟2)消毒滅菌的溫度為121℃、壓力為0.12MPa。對培養管中的培養基進行徹底消毒滅菌，避免在培養過程中引入污染。優選，所述步驟2)中，培養管經消毒滅菌，培養管與水平線呈15—45°，在室溫下，開始接種，在恒溫振蕩器中于23—24℃下靜置培養。優選，所述接種是在超凈工作臺上操作。超凈工作臺在進行操作前采用紫外燈消毒滅菌，從使用的容器上避免引入污染的路徑。優選，所述接種前對超凈工作臺紫外燈消毒20—30min。優選，所述第一培養瓶、第二培養瓶、第三培養瓶、第二連接管、第二連接管、培養管均經過消毒滅菌處理。本發明與現有技術相比，具有如下的優點和有益效果：(1)本發明采用的液體菌種的培養方法，整個培養過程實現零污染，培養獲得的蛹蟲草菌絲體等液體菌種為純度100％成品，無雜菌。(2)本發明所述的液體菌種培養過程中減少操作污染的方法，可應用于大規模液體菌種的培養，且培養過程中僅有將培養管中的培養基接種到培養瓶中操作中的一次開口，其他操作中均不存在開口的操作，且其他相關操作均規范，有效避免在操作過程中引入操作污染的問題。附圖說明此處所說明的附圖用來提供對本發明實施例的進一步理解，構成本申請的一部分，并不構成對本發明實施例的限定。在附圖中：圖1為本發明中培養裝置結構示意圖；附圖中標記及相應的零部件名稱：1-第一培養瓶，2-第一連接管，3-第二培養瓶，4-第三培養瓶，5-第二連接管。具體實施方式為使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚明白，下面結合實施例和附圖，對本發明作進一步的詳細說明，本發明的示意性實施方式及其說明僅用于解釋本發明，并不作為對本發明的限定。實施例1：一種減少液體菌種培養過程操作污染的方法，包括以下操作步驟：以蛹蟲草菌絲體培養方法為例：1)配制培養基1L培養基中原料：土豆100-200g、葡萄糖20—30g、瓊脂20-30g，將培養基原料煮好后分裝到培養管中；培養基的原料還可為1L培養料中原料：土豆200g，麩皮15g，葡萄糖25g,瓊脂15g，硫酸鎂0.4g，將培養料煮好后分裝到培養管中，培養管為規格為15x20cm試管。2)消毒滅菌在溫度120℃、壓力0.12MPa下滅菌30—45分鐘；3)接種如圖1所示，在無菌條件下，將第一連接管2的兩端分別插入至第一培養瓶1、第二培養瓶3中，從培養管中選取菌種塊通過第一培養瓶1的開口置于第一培養瓶1的瓶內，封口，第一培養瓶1內裝有固體培養基，第二培養瓶3為空瓶，第一培養瓶1內接種后，第一培養瓶1內固體培養基通過第一連接管2通入第二培養瓶3中，在18—20℃下培養，培養3—5天即可；第三培養瓶3中裝入液體培養基，第二培養瓶3與第三培養瓶4通過第二連接管5連接，待第一培養瓶1、第二培養瓶3內有菌落出現時，將第三培養瓶4中的液體培養基分別反壓至第一培養瓶1、第二培養瓶3內進行深層培養，然后將第一培養瓶1、第二培養瓶3內培養好的菌種通過密閉管道反壓至發酵罐中培養；其中，所述菌種塊面積為4mmx5mm—6mmx6mm。其中，所述步驟2)中消毒滅菌的溫度為121℃、壓力為0.12MPa。其中，所述培養管中選取的培養基體積為每支培養管體積的1/5-1/4。其中，所述步驟2)中，培養管經消毒滅菌后，培養管與水平線呈15—45°，即成斜面，在室溫下，開始接種，然后在恒溫振蕩器中于23—24℃下靜置培養。其中，所述接種是在超凈工作臺上操作。其中，所述第一培養瓶1、第二培養瓶3、第三培養瓶4、第二連接管2、第二連接管5、培養管均經過消毒滅菌處理。其中，所述接種前對超凈工作臺紫外燈消毒25—30min。其中，所述第一培養瓶1、第二培養瓶3、第三培養瓶4、第二連接管2、第二連接管5、培養管均經過消毒處理。將培養的蛹蟲草菌絲體采用常規方法檢測，如根據蛹蟲草菌絲體的形態特征在顯微鏡下觀察，成品中是否含有其他雜質。除了采用顯微鏡根據菌種的形態觀察確定最終培養獲得的產品是否有雜質外，還可通過根據具體培養的菌種的物理化學方法進行檢測，確定其純度，是否含有其他雜質。采用上述方法檢測結果：本實施例1所述的培養方法獲得的菌種中未含有與菌種無關的雜菌。將步驟3)進入發酵罐內進行接種培養獲得的用蛹蟲體菌絲體，與采用常規方法進行培養獲得的蛹蟲體菌絲體，進行污染率、出菌絲率等參數的比較。其中現有常規方法培養具體操作過程：配制好培養基后，消毒滅菌，并分裝到培養管中，冷卻。然后采用接種鉤從培養管中選取一團芝麻大小的菌絲團，接種到培養瓶內，接入到多個培養瓶時，均采取從培養管中選取菌絲團的方式，進行接種，在這個過程中均需要打開培養瓶的開口，進行接種培養。常規操作方法與本實施例所述操作方法培養獲得的蛹蟲體菌絲體的檢測參數如下表1所示，菌種參數傳統培養方法本發明所述培養方法出菌絲時間(h)2010接種量30—40g20—25g出菌絲溫度(℃)16—2016—20菌絲培養時間(h)3015菌絲培養溫度(℃)20—2523—24污染率(％)100可知，采用本實施例所述的培養方法獲得的蛹蟲草菌絲體與傳統常規操作方法培養獲得的成品蛹蟲草菌絲體相比，采用本實施例培養制備獲得的菌絲體中無雜菌，整個培養過程零污染。以上所述的具體實施方式，對本發明的目的、技術方案和有益效果進行了進一步詳細說明，所應理解的是，以上所述僅為本發明的具體實施方式而已，并不用于限定本發明的保護范圍，凡在本發明的精神和原則之內，所做的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。當前第1頁1 2 3