本發明屬于組培技術領域，涉及一種利用組織培養技術獲得馬鈴薯松散型胚性愈傷組織的誘導方法。
背景技術：
馬鈴薯在我國的廣大農作物種子地區俗稱土豆，馬鈴薯作為可食用"可布菜"可飼養"可加工的糧食作物，是一種在我國具有高產量"高效益的適合廣大農作物地區耕作的糧食經濟作物。近年來，我國廣大地區通過對馬鈴薯的栽培與育種方面的廣泛研究，取得了較多的突破，尤其是在馬鈴薯的組織培養方面取得了突出的成績。
馬鈴薯生產上多利用塊莖進行種植，新品種推廣后，隨著種植年限的增加，病毒也隨著種薯無性世代繁殖的增加而在塊莖中積累，導致田間經常出現植株變矮、簇生，莖稈細弱，分枝減少；葉片縮皺、卷曲、變小；葉色黃綠相間、失綠、顏色不正常，生長衰退；塊莖變小、變形龜裂、內部壞死；產量逐年下降，品種的優良特性不斷喪失、生產潛力和商品價值受到嚴重影響，而且隨著使用年代的增加而急劇加重，最后失去種植價值，這種現象就是馬鈴薯種薯退化。目前，世界上公認馬鈴薯種薯退化是病毒危害造成的。
馬鈴薯脫毒的核心技術是莖尖組織培養(又叫分生組織培養)脫毒技術。是利用莖尖沒有病毒的特性，在無菌操作條件下，經過莖尖剝離脫去主要危害馬鈴薯的病毒病及真菌、細菌性病害，用人工配制的培養基，培育出無毒試管苗(將莖尖組培苗進行病毒檢測，淘汰仍帶有病毒的莖尖苗)。然后把試管苗在溫室或網棚內繁殖微型薯原原種，在隔離條件下，用原原種繁殖原種、用原種繁殖良種供生產使用。
目前，馬鈴薯脫毒培養主要依賴于莖尖脫毒技術，而采用松散型胚性愈傷組織進行組織脫毒的報道極少，其中有關于采用這一技術能否脫毒的爭議，也有建立馬鈴薯松散型胚性愈傷組織的困難障礙。關于采用愈傷組織培養進行植物組織脫毒的研究已經有些報道，并在一些植物研究中獲得了成功，但在馬鈴薯上還未見報道，因此可以初步判斷可能是由于馬鈴薯胚性愈傷組織難于誘導的原因。
技術實現要素：
本發明的目的在于克服現有技術的不足之處，提供一種馬鈴薯松散型胚性愈傷組織的誘導方法。本發明的目的就是建立一套馬鈴薯松散型胚性愈傷組織誘導體系，為馬鈴薯的脫毒培養奠定基礎，同時還可以用于體細胞誘變育種研究，為馬鈴薯的育種方法拓寬了途徑。
本發明實現目的的技術方案如下：
一種馬鈴薯松散型胚性愈傷組織的誘導方法，步驟如下：
⑴馬鈴薯外植體的準備
選擇帶有外皮的部分；并不要選擇帶芽的部位進行消毒處理；
⑵馬鈴薯松軟愈傷組織的誘導
將消毒處理好馬鈴薯外植體接種到事先配制好的1/2-1/4MS+1.0-2.0mg/L2,4-D+15-20g/L蔗糖的培養基上；進行松軟愈傷組織的誘導培養；每個容器中加入30-50ml培養基；培養條件為：24-25℃,24h光照；光照強度為1000Lux；經過30-40d培養；在馬鈴薯切塊的外圍就可以誘導出質地柔軟、淺白色的愈傷組織；
⑶馬鈴薯松散型愈傷組織的誘導
將誘導出的馬鈴薯松軟愈傷組織轉移到MS+0.5-1.0mg/LBA+0.25-0.5mg/L2,4-D+30g/L蔗糖的培養基上進行松散型愈傷組織的誘導；轉移愈傷組織過程中要小心；否則會弄傷軟的愈傷組織；使得愈傷組織過小而死亡；培養中10-14d繼代一次；在繼代過程中應盡可能選擇質地較硬的愈傷組織；將變色、細軟的愈傷組織在繼代過程中逐漸淘汰；每個容器中加入20-40ml培養基；培養條件為：23-24℃,24h光照；光照強度為2000-2500Lux；經過3-5次繼代培養；即可誘導出生長速度適中、質地較硬、結構松散的淺綠色愈傷組織；
⑷馬鈴薯松散型胚性愈傷組織的誘導
將步驟⑶中誘導出的馬鈴薯松散型愈傷組織在超凈臺中取出；轉接到MS+1.0-1.5mg/LBA+0.5-1.0mg/L2,4-D+30g/L蔗糖的培養基上進行松散型胚性愈傷組織的誘導；在愈傷組織培養過程中；每15-20d繼代一次；繼代時應選擇結構松散、顏色淺綠色并呈現顆粒狀的愈傷團保留下來；同時要結合顯微鏡進行鏡檢；進一步確定愈傷組織的胚性；經過5-8次繼代；大約100-120d時間；即可誘導出馬鈴薯松散型胚性愈傷組織；誘導時采用100ml三角瓶；由于繼代時間較長；本步驟要求在每個三角瓶中加入40ml的培養基；培養條件為：21-22℃,24h光照；光照強度為2500-3000Lux。
而且，所述步驟⑴的具體操作如下：
取馬鈴薯塊莖在自來水中反復沖洗；用解剖刀切取馬鈴薯塊莖；要選擇帶有外皮的部分；并不要選擇帶芽的部位；將切下的馬鈴薯塊莖放到超凈臺中；再用解剖刀切成直徑大約為5-10mm的小塊；然后采用70％的乙醇浸泡塊莖30S；再用40％的安替福民水溶液進行表面消毒處理；消毒時間為20Min；消毒結束后；將塊莖在無菌水中反復沖洗5次；每次10Min；然后用無菌的吸水紙將多余的水分吸干；并用解剖刀將塊莖最外部的一層組織切除。
本申請的優點和積極效果如下：
本發明的目的就是要采用這一脫毒新途徑建立馬鈴薯無毒苗培養體系，為生產上獲得優質無毒的馬鈴薯種源。采用松散型胚性愈傷組織進行脫毒培養的方法較其它依靠愈傷組織脫毒的方法具有以下幾點優勢：一是，松散型胚性愈傷組織中細胞間彼此聯系較少，為病毒在細胞間的轉移制造了障礙；二是，松散型胚性愈傷組織比一般愈傷組織生長速度要快，病毒在細胞間的傳播會因此受到抑制，會經過多代分化后獲得無毒的細胞；三是胚性愈傷組織很容易獲得再生苗，一旦愈傷組織脫毒，即可通過胚狀體再生的方式獲得再生苗；四是松散型胚性愈傷組織再生方式多為單細胞再生，因此不會由于再生芽中沒有脫毒細胞的影響而使得再生苗再次感染帶毒，從而簡化了脫毒步驟，節省了時間、提高了效率。因此總的來看就是可以獲得高效、優質的無毒材料。
具體實施方式
下面通過具體實施例對本發明作進一步詳述，以下實施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本發明的保護范圍。
實施例1
一種馬鈴薯松散型胚性愈傷組織的誘導方法，步驟如下：
⑴馬鈴薯愈傷組織培養外植體的準備
將“中薯5號”馬鈴薯在自來水中反復沖洗，用解剖刀切取馬鈴薯塊莖，要選擇帶有外皮的部分，并不要選擇帶芽的部位。將切下的馬鈴薯塊莖放到超凈臺中，再用解剖刀切成直徑大約為5mm的小塊。然后采用70％的乙醇浸泡塊莖30S，再用40％的安替福民水溶液進行表面消毒處理。消毒時間為20Min，消毒結束后，將塊莖在無菌水中反復沖洗5次，每次10Min，然后用無菌的吸水紙將多余的水分吸干，并用解剖刀將塊莖最外部的一層組織切除，因為這些組織在消毒液的作用下容易褐變死亡，影響愈傷組織誘導效果。處理后的馬鈴薯塊莖即可作為愈傷組織初步誘導的外植體。
⑵馬鈴薯松軟愈傷組織的誘導
將消毒處理好的馬鈴薯塊莖外植體接種到事先配制好的1/4MS+1.0mg/L2,4-D+15g/L蔗糖的松軟愈傷組織誘導培養基上。采用100ml三角瓶作為培養容器，每個三角瓶中加入30ml培養基。培養條件為：25℃,24h光照，光照強度為1000Lux。經過40d培養，就可以誘導出質地柔軟、淺白色的愈傷組織。
⑶馬鈴薯松散型愈傷組織的誘導
將誘導出的馬鈴薯松軟愈傷組織轉移到MS+0.5mg/LBA+0.25mg/L2,4-D+30g/L蔗糖的培養基上進行松散型愈傷組織的誘導。轉移愈傷組織過程中要小心，否則會弄傷軟的愈傷組織，使得愈傷組織過小而死亡。培養中10d繼代一次，在繼代過程中應盡可能選擇質地較硬的愈傷組織，將變色、細軟的愈傷組織在繼代過程中逐漸淘汰。采用100ml三角瓶作為培養容器，每個三角瓶中加入20ml培養基。培養條件為：24℃,24h光照，光照強度為2000Lux。經過3-5次繼代培養，即可誘導出生長速度適中、質地較硬、結構松散的淺綠色愈傷組織。
⑷馬鈴薯松散型胚性愈傷組織的誘導
將上一步驟中誘導出的馬鈴薯松散型愈傷組織在超凈臺中取出，在超凈臺中用解剖刀切成直徑為5mm的小塊，小心地轉移到轉接到MS+1.0mg/LBA+0.5mg/L2,4-D+30g/L蔗糖的松散型胚性愈傷組織誘導培養基上進行再次培養。在愈傷組織培養過程中，每20d繼代一次，繼代時應選擇結構松散、顏色淺綠色并呈現顆粒狀的愈傷團保留下來。同時要結合顯微鏡進行鏡檢，進一步確定愈傷組織的胚性。經過5-8次繼代，大約120d時間，待處理中出現胚性愈傷組織時停止試驗。愈傷組織從外觀上出現了較大的變化，其中一些愈傷組織表面出現瘤狀顆粒，結構松散、質地緊密，在顯微鏡下可以看到愈傷組織細胞個體較小、細胞質濃度增大、細胞核較大，細胞處于旺盛的分裂狀態，表現出高度的胚性狀態。誘導試驗采用100ml三角瓶，在每個三角瓶中加入40ml的培養基。培養條件為：22℃,24h光照，光照強度為2500Lux。