本發明涉及植物生物工程組織培養技術領域。更具體地說，本發明涉及一種用精胺誘導煙草胚狀體的方法。
背景技術：
“胚狀體”(embryoid)是以體細胞組織或生殖細胞組織材料在特殊培養條件下，沒有經過有性的受精過程，卻經過了胚胎發育過程，所形成的具有合子胚之生理功能的特殊結構，實際是未來植株的雛形。胚狀體亦稱體(細胞)胚或無性胚，在生產上可以直接用于制造人工種子和生產再生植株(試管苗)；在理論研究上，是探索細胞分化、器官建成、個體發育，及其相關的解剖學和生理生化變化過程的重要材料。因此，獲得胚狀體的技術研究是植物生物學界的熱門領域之一。
煙草胚狀體的研究起步相對較晚，國內資料不多，特別是煙草胚狀體誘導技術的研究報告更少。具有代表性的有：王瑞庫等人【影響煙草花粉胚胎發生的某些因子-鐵鹽、蔗糖和腺素。黑龍江八一農墾大學學報，1991，(1)：21-27】及【影響煙草花粉胚胎發生的某些因子-氨基酸和激素。黑龍江八一農墾大學學報，1991，(2)：47-52】；司龍亭等人【煙草人工種子研究進展初報。沈陽農業大學學報，1991,22(1)35-40】；賈勇炯等人【在煙草花藥培養中誘導胚狀體發生的研究。四川大學學報(自然科學版)1996，33(5)：605-608】；潘莉等人。【煙草未授粉子房單倍體誘導及影響因素的研究。河南農業大學學報，1999,33(1)：48-52】；王連華等人【烤煙K326人工種子懸浮培養條件下體細胞胚胎的發生研究。種子，2002，(4)：10-12】；慕平利等人【煙草葉片直接再生-基因轉化體系的建立。河南農業科學，2005，(4)：27-29】。現有誘導煙草胚狀體的資料雖然分別涉及到MS,H,Nitsch,等不同的基本培養基；不同基因型的栽培品種；不同器官作外植體；固體或液體懸浮，等不同的培養方法。但是，其共同的研究結果主要表現為以下兩點：1、適量的2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)對煙草胚狀體的發生必不可少，增加鐵鹽、腺素(即腺嘌呤)、KT(激動素)、IAA(吲哚乙酸)和谷氨酰胺等，有利煙草胚狀體的發生和發育。由此可見，煙草胚狀體的誘導培養基都是由多種誘導劑成分復合配制而成，未見用單一誘導劑成功誘導煙草胚狀體的報導。2、現有培養基對煙草胚狀體的誘導周期長，效率低。而且原始外植體都要反復轉接到新培養基進行繼代培養，甚至多達5-6代的培養，長達3-4個月才發生胚狀體。
技術實現要素：
本發明的一個目的是解決至少上述問題，并提供至少后面將說明的優點。
本發明還有一個目的是提供一種用精胺誘導煙草胚狀體的方法，以精胺作誘導劑制備的誘導培養基比傳統的培養基誘導煙草胚狀體形成速度快、產量高、質量好，且原始外植體無需轉瓶進行繼代培養，即可直接達到生產煙草胚狀體的目的。
為了實現根據本發明的這些目的和其它優點，提供了一種用精胺誘導煙草胚狀體的方法，以精胺作誘導劑制備誘導培養基進行煙草葉片外植體的胚狀體誘導。
優選的是，所述的用精胺誘導煙草胚狀體的方法，所述誘導培養基為配方為：MS+精胺3.2-4.0mg/L，pH為5.8～6.0。
優選的是，所述的用精胺誘導煙草胚狀體的方法，所述煙草葉片外植體的獲取方法為：取由煙草種子獲得的無菌煙草植株，當其長至5、6片葉時，自上至下取第3片葉，在無菌條件下切成方片，即得煙草葉片外植體，備用。
優選的是，所述的用精胺誘導煙草胚狀體的方法，將自上至下的第3片葉在無菌條件下切除葉柄以上2mm和葉尖以下2mm的葉片部分，再沿其主脈兩側分切成5mm×5mm的方片作煙草葉片外植體。
優選的是，所述的用精胺誘導煙草胚狀體的方法，將所述煙草葉片外植體接種于滅菌后的誘導培養基中培養20天，獲得煙草胚狀體。
優選的是，所述的用精胺誘導煙草胚狀體的方法，所述誘導培養基中精胺的濃度為3.5mg/L。
本發明至少包括以下有益效果：
1)精胺(Spermine,Spm.)，屬于植物生長物質多胺類(polyamine)中的一種，是廣泛存在于高等植物界的純天然植物活性物質，對培養材料無毒副作用和殘留，本發明采用精胺添加于MS配制成單一的誘導培養基，剔除了傳統技術認為必不可少，卻又有害的物質2,4-D，大大簡化培養基的配制程序，節省物力人力，降低了培養成本；
2)本發明的誘導培養基以精胺作為唯一的誘導劑，針對雙子葉植物煙草的特殊生物學特性，在大量篩選試驗的基礎上，確定了精胺的適宜濃度，使得煙草葉片外植體在誘導培養基作用下進行脫分化形成愈傷組織之后直接再分化，高效優質地形成煙草胚狀體，本發明的誘導培養基比傳統的培養基誘導效果更好，煙草胚狀體形成速度快，20d即可發生，胚狀體的產量和質量顯著提高。
本發明的其它優點、目標和特征將部分通過下面的說明體現，部分還將通過對本發明的研究和實踐而為本領域的技術人員所理解。
具體實施方式
下面結合具體實施例對本發明做進一步的詳細說明，以令本領域技術人員參照說明書文字能夠據以實施。
需要說明的是，下述實施方案中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法，所述試劑和材料，如無特殊說明，均可從商業途徑獲得。
實施例1：
一種用精胺誘導煙草胚狀體的方法，包括以下步驟：
步驟一、外植體準備：取由煙草種子獲得的無菌煙草植株，在無菌條件下，將煙草葉片切成方片作為外植體，備用，方片可切成大小約為5mm×5mm；
步驟二、誘導培養基制備：以MS為基本培養基，添加精胺3.2mg/L，調整培養基pH為5.8～6.0，滅菌后備用；
步驟三、誘導培養：將步驟一獲得的煙草外葉片植體接入步驟二的誘導培養基中，培養20天。
實施例2：
步驟一、外植體準備：取由煙草種子獲得的無菌煙草植株，當其長至5、6片葉時，自上至下取第3片葉，在無菌條件下，切成方片作為外植體，備用，方片可切成大小約為5mm×5mm；
步驟二、誘導培養基制備：以MS為基本培養基，添加精胺3.5mg/L，調整培養基pH為5.8～6.0，滅菌后備用；
步驟三、誘導培養：將步驟一獲得的煙草葉片外植體接入步驟二的誘導培養基中，培養20天。
無菌煙草植株長至5、6片葉時，自上至下的第3葉為充分成熟健壯的功能葉，細胞代謝旺盛，生命力強，相比其他煙草葉片，作為外植體培養更易發生脫分化、再分化形成胚狀體。
實施例3：
步驟一、外植體準備：取由煙草種子獲得的無菌煙草植株，當其長至5、6片葉時，自上至下取第3片葉，在無菌條件下，切除葉柄以上2mm和葉尖以下2mm的葉片部分，留葉片中間部分，再沿其主脈兩側分切成5mm×5mm的方片作為外植體，備用，需要說明的是，前述的沿主脈切片是指棄用了葉片兩側靠邊緣的葉片部分，只要主脈兩側的葉片部分；
步驟二、誘導培養基制備：以MS為基本培養基，添加精胺4.0mg/L，調整培養基pH為5.8～6.0，滅菌后備用；
步驟三、誘導培養：將步驟一獲得的煙草葉片外植體接入步驟二的誘導培養基中，培養20天。
無菌煙草植株長至5、6片葉時，自上至下的第3葉為充分成熟健壯的功能葉，細胞代謝旺盛，生命力強，在切除葉片的上下兩端以及在沿主脈兩邊切取5mm×5mm的方片的同時也切除了葉片左右兩側邊緣的葉片部分，這種操作有利保證所用的煙草葉片外植體從外部形態到內在代謝水平都更為均勻一致，能有效減少實驗結果的材料誤差。
對比例1：
為了說明本發明的用精胺誘導煙草胚狀體的方法的效果，本發明的發明人以實施例3的方法，將誘導培養基中的精胺濃度依次設定為三組：3.2mg/L、3.5mg/L、4.0mg/L，并以傳統誘導培養基(其配方為：MS+精胺0.0+2,4-D 0.1mg/L+IAA0.1mg/L+KT0.1mg/L)為對照組(CK)。在上述四組中每組接種10瓶，每瓶接種取3個方片。在常規條件下誘導培養煙草胚狀體，并統計不同試驗組培養10天的出愈率和培養20天的胚狀體發生率、轉綠自養率、肉眼可辨體胚數/方片，以及出現首胚天數。
其中：
出愈率(％)＝出愈方片數/接種方片數×100％，不論方片污染與否及出愈多少；
出現首胚天數：每天定時觀察1次，記錄出現首個肉眼(借助放大鏡)可辨胚狀體所需天數；
培養20d終止試驗，在上述四組中每組隨機取3瓶無污染者，統計：胚狀體發生率(％)＝出胚狀體方片數/接種方片數×100％；肉眼可辨胚狀體數/方片；轉綠自養率(％)＝轉綠胚狀體數/胚狀體數/方片×100％。均不考慮胚狀體的具體形態。所有指標均記錄3瓶的平均值。
結果見表1。
表1.用精胺誘導煙草胚狀體的實施案例及與傳統技術的效果對比
注：表中案例4(對照)的配方是參考王連華，等(2002)和慕平利，等(2005)的研究結果擬定。
轉綠自養率(％)被視為評價胚狀體質量的重要指標之一。
通過表1中各案例的對比可見，用精胺作為單一誘導劑配制的煙草胚狀體誘導培養基，其效果全面優于由2,4-D，IAA和KT復配成的誘導培養基，不僅胚狀體發生快，無需更換培養基反復繼代培養，節省大量時間和人工，而且產量高、質量好。這至少與其徹底擺脫了2,4-D的毒副作用有關。在綜合考慮成本與收益的情況下，其中以精胺濃度3.5mg·L-1最為適宜。本發明所建立的用精胺誘導煙草胚狀體的技術體系，有利改變“適量的2,4-D對煙草胚狀體的發生必不可少”這一傳統觀念。
盡管本發明的實施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說明書和實施方式中所列運用，它完全可以被適用于各種適合本發明的領域，對于熟悉本領域的人員而言，可容易地實現另外的修改，因此在不背離權利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發明并不限于特定的細節和這里示出與描述的實施例。