本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種單環刺螠精子冷凍保存液及其制備方法。
背景技術：
在水產增養殖生產中，隨著人工授精技術的發展和種質資源保護的需要,水產經濟動物的精子體外保存技術研究日益受到關注。精子的體外保存可解決雌、雄成熟不同步問題，同時也降低了飼養大量親本所需的花費,對人工繁育、種質優選及精子代謝和生理等研究提供了技術平臺。單環刺螠肉味鮮美、營養豐富、價格適中，被稱為“裸體海參”，市場需求量不斷增加。近年來還發現單環刺螠體內存在多種生物活性肽，具有抗腫瘤、抗菌、免疫調節等功能。單環刺螠對海水中有害物質硫化物有較強的耐受與解毒能力，可對調節水質、緩解海洋污染起到一定積極的作用。由于過度捕撈導致單環刺螠的天然資源量銳減，已遠遠不能滿足人類的需求，因此亟待開展單環刺螠的人工增養殖。在單環刺螠人工繁殖生產中，如何同時獲取高質量的成熟精卵是一個主要問題。
原有專利技術已涉及到魚類(太平洋鱈魚、云斑尖塘鱧、棘頭梅童魚、斑點叉尾鮰、小黃魚、黃鱔等)和少數貝類(魁蚶、香港牡蠣等)，迄今尚無關于單環刺螠精子保存技術的專利。單環刺螠(Urechis unicinctus)隸屬于螠蟲動物門、螠綱、無管螠目、刺螠科，俗稱海腸。由于不同種類動物的精子具有不同的生物學特性，所以原有技術不適宜用于單環刺螠精子的保存。
技術實現要素：
為克服上述問題，本發明的目的在于提供一種單環刺螠精子冷凍保存液。
本發明的技術方案是通過下列方式實現的：
一種單環刺螠精子冷凍保存液，包括單環刺螠精子、保存劑與抗凍劑。
優選的，所述保存液pH為4-11，更優選6-9，進一步優選8-9，特別優選8。
優選的，所述保存液的鹽度為10-40，更優選20-35，進一步優選25-35，特別優選25-30。
優選的，所述保存劑包括中性鹽與弱堿性鹽。更優選的，所述中性鹽選自鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽或鎂鹽中的一種或多種。進一步的，所述中性鹽選自NaCl，KCl，CaCl2，MgCl2，Na2SO4，K2SO4，MgCl2.6H2O，MgCl2或NaH2PO4中的一種或多種，優選NaCl，KCl和CaCl2中的一種或多種，更優選的，所述中性鹽為NaCl，KCl和CaCl2的混合物，進一步優選的，所述混合物中NaCl，KCl和CaCl2的質量比為2500：20：21。
優選的，所述弱堿性鹽選自NaHCO3，或KHCO3，更優選的，所述中性鹽為NaCl，KCl和CaCl2的混合物，所述CaCl2與NaHCO3的質量比為10:1。
優選的，所述抗凍劑選自二甲基亞砜和/或甘油，更優選10％-15％V/V二甲基亞砜或5％-10％V/V甘油，進一步優選10％V/V二甲基亞砜或5％V/V甘油。
優選的，所述保存液進一步被凍干。
本發明的另一目的還在于提供一種制備所述單環刺螠精子冷凍保存液的方法，包括取材，精子活力鑒定，精子稀釋，降溫平衡，第一次預冷，第二次預冷，保存，解凍和洗脫步驟。
優選的，本發明的冷凍保存液的制備方法，包括如下步驟：
(1)取材：取單環刺螠成熟雄體，75％乙醇擦拭腎孔周圍體表，從腎孔吸取精液，置于廣口瓶中；
(2)精子活力鑒定：顯微鏡觀察，鏡檢單環刺螠精子激活率達到85％以上；
(3)精子稀釋：加入精子保存劑，稀釋成精子懸浮液；
(4)降溫平衡：于稀釋后精液中添加抗凍劑，震蕩混勻，分裝至凍存管中，于冷藏箱中降溫平衡；
(5)第一次預冷：在保溫瓶中放入支架，加入液氮，在裝有精子的凍存管平鋪于保溫瓶中的平篩網表面，蓋上保溫瓶蓋；
(6)第二次預冷：打開保溫瓶蓋，向保溫瓶中添加液氮，使液氮面接近平篩網面，蓋上保溫瓶蓋；
(7)保存：取出凍存管，迅速將其放入液氮罐中保存；
任選的，還包括(8)解凍和洗脫步驟：當需要使用所保存的精子標本時，打開液氮罐，將凍存管拎出，迅速放入水浴中解凍后，加入精子保存劑，震蕩混勻，離心，取得精子沉淀鏡檢后用于人工授精。
進一步優選的，所述制備方法包括如下步驟：
(1)取材：取單環刺螠成熟雄體，75％乙醇擦拭腎孔周圍體表，用吸管從腎孔吸取精液，置于滅菌干燥后的廣口瓶中；
(2)精子活力鑒定：用吸管取1滴精液于載玻片上，加上1滴海水制成涂片，顯微鏡觀察，鏡檢單環刺螠精子激活率達到85％以上，可以用于冷凍保存；
(3)精子稀釋：加入相對于精液體積的20倍精子保存劑，稀釋至106個mL的精子懸浮液；
(4)降溫平衡：于稀釋后精液中添加抗凍劑，震蕩混勻，分裝至1.8mL凍存管中，于4℃冷藏箱中降溫平衡30min；
(5)第一次預冷：在保溫瓶中放入支架，加入液氮，使液氮面距離平篩網面5cm；在裝有精子的凍存管外系上1m長線繩，將凍存管平鋪于保溫瓶中的平篩網表面，蓋上保溫瓶蓋；
(6)第二次預冷：打開保溫瓶蓋，向保溫瓶中添加液氮，使液氮面接近平篩網面，蓋上保溫瓶蓋；
(7)保存：取出凍存管，迅速將其放入液氮罐中保存；
(8)解凍和洗脫：當需要使用所保存的精子標本時，打開液氮罐，捏住露在液氮罐外的線繩，將凍存管拎出，迅速放入水浴中解凍后，加入精子保存劑，震蕩混勻，1000r/min離心5min，取得白色精子沉淀鏡檢后用于人工授精。
優選的，步驟(1)中單環刺螠置于4℃的廣口瓶中備用。
優選的，步驟(3)中精子保存劑包括NaCl，KCl和CaCl2和NaHCO3，其中NaCl，KCl和CaCl2和NaHCO3的質量比為25.00：20：21：2.1，更優選的，保存劑包括NaCl 25.00g，KCl 0.20g，CaCl2 0.21g，NaHCO3 0.021g，將上述保存劑溶于1L蒸餾水中；進一步優選的，步驟(3)中蒸餾水的pH調至8。
優選的，步驟(4)中抗凍劑成分為10％V/V二甲基亞砜DMSO。
優選的，步驟(5)中支架采用鉛絲制成，鉛絲制成平篩網，其孔徑比凍存管略小，平篩網下部設有三條支柱；進一步優選的，步驟(5)中第一次預冷時間為20min；更進一步優選的，步驟(5)中第二次預冷時間為5min。
優選的，步驟(8)中水浴的溫度為38℃，更優選的，步驟(8)中加入精子保存劑的體積為凍精的三倍。
與現有技術相比，本發明是針對單環刺螠精子的生物學特點，篩選出適合單環刺螠精子的冷凍保存方法，可以長期有效地保存單環刺螠精子；實驗證明，利用本發明將單環刺螠精子在液氮中保存15d后，解凍后的精子存活率可達70％以上。本方法無需昂貴的儀器設備，操作簡單，成本低廉，效果好，為單環刺螠的人工授精工作提供了精子來源保障，并可用于單環刺螠的雜交育種、種質優選、雌核發育及物種保護等其他研究領域。
具體實施方式
為了進一步描述本發明的技術方案及所取得的技術效果，下面將結合具體實施例對本發明做進一步描述，但本發明的保護內容并非局限于下列具體實施例。
實施例1
(1)取材：單環刺螠在一年中有2個生殖期：春季(4月中下旬至5月底)和秋季(9月下旬至10月底)，可在此階段采集成熟的精子。取單環刺螠成熟雄體，75％乙醇擦拭腎孔周圍體表，用吸管從腎孔吸取精液，置于滅菌干燥后的廣口瓶中，4℃備用。
(2.1)精子活力鑒定方法：用吸管取1滴精液于載玻片上，加上1滴海水制成涂片，顯微鏡觀察。精子激活率以活動精子數量占全部精子數量的百分比計算，統計樣品的精子激活率；各實驗均重復3次，實驗數據用“平均數+標準差”表示；采用SPSS16.0軟件進行數據處理，并進行單因子方差分析(One-way ANOVA)，LSD(Least Significant Difference)多重比較和Duncan檢驗鏡，檢單環刺螠精子激活率達到85％以上，可以用于冷凍保存。
(2.2)pH對精子活力的影響：取2.5％NaCl溶液，用0.1mol L的NaOH和HCl溶液調節pH至4、5、6、7、8、9、10、11共8個pH梯度，依次為實驗1－8組。取新鮮精液，用不同pH的NaCl溶液激活，測其活力。
鹽度對精子活力的影響
(2.3)用NaCl和蒸餾水配制10、15、20、25、30、35、40共7個鹽度梯度，依次為實驗1－7組，各組pH均調節至8。取新鮮精液，用不同鹽度的NaCl溶液激活，測其活力。
(2.4)不同精子保存劑對精子冷凍保存的影響：精子保存劑采用下列9種，配方是在參考有關文獻中應用于魚類、蝦類、貝類等精子稀釋劑的基礎上，針對單環刺螠精子的生物學特點修改而成的；各保存劑的pH均調節至8，并加入10％DMSO。
保存劑I：無鈣離子人工海水-NaCl 21.63g，NaOH 0.19g，KCl 1.12g，MgSO4.7H2O 4.93g，H3BO3 0.53g，加蒸餾水定容至1000mL；
保存劑II：NaCl 25.00g，Na2SO43.90g，KCl 0.73g，MgCl2.6H2O 10.70g，NaHCO30.23g，加蒸餾水定容至1000mL；
保存劑III：NaCl 25.00g，KCl 0.60g，CaCl2 0.25g，MgCl2 0.35g，NaHCO3 0.20g，加蒸餾水定容至1000mL；
保存劑IV：NaCl 25.00g，KCl 0.20g，CaCl2 0.21g，NaHCO3 0.021g，加蒸餾水定容至1000mL；
保存劑V：NaCl 25.30g，NaH2PO4 0.22g，NaHCO3 0.25g，KCl 0.39g，CaCl2 0.13g，MgCl2.6H2O 0.23g，葡萄糖10g，加蒸餾水定容至1000mL；
保存劑VI：NaCl 8.00g，KCl 1.00g，葡萄糖15.00g，加蒸餾水定容至1000mL；
保存劑VII：過濾海水(鹽度25)；
保存劑VIII：NaCl 0.075g，KCl 0.005g，CaCl2 0.001g，NaHCO3 0.002g，加蒸餾水定容至1000mL；
保存劑IX：生理鹽水(0.9％NaCl)；
將步驟1中取得的精液分別加入9種相對于精液體積的20倍精子保存劑，稀釋至106個mL的精子懸浮液，于4℃冰箱中降溫平衡30min，再經兩次預冷：第一次樣品距液氮表面5cm處，預冷20min，第二次樣品于液氮表面預冷5min。然后將裝有樣品的凍存管放入液氮罐中保存；注意將貼有標簽的線繩頂端露在液氮罐外，注明標本名稱及凍存時間。
解凍方法：打開液氮罐，捏住露在液氮罐外的線繩，將凍存管拎出，迅速放入38℃水浴中解凍后，加入凍精3倍體積的精子保存劑，震蕩混勻，1000r/min離心5min，取得白色精子沉淀用海水激活檢測其活力。
不同抗凍劑對精子冷凍保存的影響
在(2.4)所篩選出的最適保存劑的基礎上，以二甲基亞砜DMSO和甘油作為冷凍保護劑，設置對照組以及10個不同的保護劑濃度和保護劑組合：實驗0組不加抗凍劑；實驗1－4組分別含DMSO(V/V)5％、10％、15％、20％；實驗5－8組分別含甘油(V/V)5％、10％、15％、20％；實驗9組分別含DMSO和甘油各10％；實驗10組分別含DMSO和甘油各20％，其余步驟同(2.4)。
(3.1)pH對精子活力的影響：pH對精子活力的影響見表1；從表1中可以看出，單環刺螠精子對酸性環境的耐受力要低于堿性環境。精子激活率以pH8組最高，可達95.61％；其次以pH9組和pH7組激活率較高。隨著pH的下降和升高，精子激活率急劇下降，pH11組僅為8.06％，pH4組精子激活率為0。
表1 pH對單環刺螠精子激活率的影響(平均值±標準差)
注：單因子方差分析，表中上標小寫不同字母表示不同pH處理組間有顯著差異(P<0.05)，下同。
(3.2)鹽度對精子活力的影響：從表2可以看出，在不同濃度的NaCl溶液處理下，鹽度25和30兩組的精子激活率無顯著性差異，分別達到92.44％和90.78％；其次為鹽度35和20組激活率分別為85.37％和74.76％。當鹽度為40或小于等于15時，精子激活率顯著下降，鹽度10組精子激活率僅為6.85％。
表2 鹽度對單環刺螠精子激活率的影響(平均值±標準差)
(3.3)不同精子保存劑對精子冷凍保存的影響：不同保存劑對冷凍保存單環刺螠精子激活率的影響見表3；各組精子初始存活率均為93.16％。平衡30min后，各試驗組精子激活率即出現差異：保存劑III、IV、VII、VIII、IX的精子激活率超過80％，其中以保存劑IV組最高，為89.92％；保存劑I、II、V、VI的精子激活率均低于80％，以保存劑II精子激活率最低，僅為59.14％。冷凍保存24h后，以保存劑IV組的解凍后精子激活率最高，達84.83％，其次是保存劑VIII組，解凍后精子激活率達71.18％，以保存劑VI組精子激活率最低，僅為46.51％，降幅達46.65％。
表3 不同保存劑對冷凍保存單環刺螠精子激活率的影響(平均值±標準差)
注：單因子方差分析(One-way ANOVA)和Duncan檢驗。表中上標不同字母表示組間有顯著差異(P<0.05)
(3.4)不同抗凍劑對精子冷凍保存效果的影響：從表4可見，對照組未添加任何抗凍劑直接冷凍，冷凍24h后精子激活率僅為21.53％，保存15d后精子激活率降幅達83.97％。各試驗組中，以試驗2組(DMSO，10％)的精子激活率最高，冷凍24h后精子激活率達77.15％，保存15d后仍能達到71.28％。其次是試驗5組(甘油，5％)，保存15d后的精子激活率為56.69％。
從同一保護劑、不同添加濃度之間的比較發現，DMSO濃度從5％－10％之間，隨著DMSO添加量的增加，精子激活率呈現升高趨勢，但當DMSO濃度達到15％及以上時，精子激活率明顯下降。添加甘油各組精子激活率與甘油濃度呈顯著負相關(r＝0.986，P<0.01)。以等比例添加DMSO和甘油的試驗9組和10組，其精子激活率均較低，尤其試驗10組精子激活率降幅較大，達到66.89％。
表4 不同抗凍劑對冷凍保存單環刺螠精子激活率的影響(平均值±標準差)
注：單因子方差分析(One-way ANOVA)和Duncan檢驗。表中上標不同字母表示有顯著差異(P<0.05)
實施例2
參考實施例1的冷凍液制備方法，完成下列制備工藝：
(1)取材：在4月中下旬至5月底，或9月下旬至10月底，取單環刺螠成熟雄體，75％乙醇擦拭腎孔周圍體表，用吸管從腎孔吸取精液，置于滅菌干燥后的廣口瓶中，4℃備用；
(2)精子活力鑒定：用吸管取1滴精液于載玻片上，加上1滴海水制成涂片，顯微鏡觀察。精子激活率以活動精子數量占全部精子數量的百分比計算。當鏡檢單環刺螠精子激活率達到85％以上，進行下述冷凍步驟；
(3)精子稀釋：加入相對于精液體積的20倍精子保存劑，稀釋至106個/mL的精子懸浮液。所述的精子保存劑配制方法為：NaCl 25.00g，KCl 0.20g，CaCl2 0.21g，NaHCO3 0.021g，溶于1L蒸餾水中，pH調至8；
(4)降溫平衡：將精子懸浮液加入抗凍劑15％二甲基亞砜DMSO－V/V分裝至1-2mL凍存管中，于4℃冰箱中降溫平衡30min；
(5)第一次預冷：在保溫瓶中放入凍存管支架，然后向保溫瓶中加入液氮，使液氮表面距離凍存管支架表面5cm；將降溫平衡處理過的凍存管用頂端貼有標簽的長線繩做好標記(注明標本名稱及凍存時間)后，平放于凍存管支架上，蓋上保溫瓶蓋，預冷20min；
(6)第二次預冷：打開保溫瓶蓋，向保溫瓶中添加液氮，使液氮面接近平篩網面，蓋上保溫瓶蓋，第二次預冷5min；
(7)凍存：從保溫瓶中取出凍存管，迅速將其放入液氮罐中保存，將線繩頂端標簽露在液氮罐外；
(8)解凍和洗脫：當需要使用所保存的精子標本時，打開液氮罐，捏住露在液氮罐外的線繩，將凍存管拎出，迅速放入38℃水浴中解凍后，加入凍精3倍體積的精子保存劑，震蕩混勻，1000r/min離心5min，取得白色精子沉淀鏡檢后用于人工授精。
實驗例單環刺螠精子冷凍實驗。
按實施例2所述的單環刺螠精子冷凍保存方法所述的步驟進行冷凍保存；15d后，打開液氮罐，捏住露在液氮罐外的長線繩，將凍存管拎出，按實施例2步驟(8)所述的方法進行解凍和洗脫，按實施例2步驟(2)所述的方法進行活力檢測，檢測精子激活率為71％。