1.一種單環刺螠精子冷凍保存液,包括單環刺螠精子、保存劑與抗凍劑。
2.根據權利要求1所述的冷凍保存液,其特征在于,所述保存液pH為4-11,優選6-9,更優選8-9,特別優選8。
3.根據權利要求1所述的冷凍保存液,其特征在于,所述保存液的鹽度為10-40,優選20-35,更優選25-35,特別優選25-30。
4.根據權利要求1-3任意一項所述的冷凍保存液,其特征在于,所述保存劑包括中性鹽與弱堿性鹽。
5.根據權利要求4所述的冷凍保存液,其特征在于,所述中性鹽選自鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽或鎂鹽中的一種或多種。
6.根據權利要求5所述的冷凍保存液,其特征在于,所述中性鹽選自NaCl,KCl,CaCl2,MgCl2,Na2SO4,K2SO4,MgCl2.6H2O,MgCl2或NaH2PO4中的一種或多種,優選NaCl,KCl和CaCl2中的一種或多種,更優選的,所述中性鹽為NaCl,KCl和CaCl2的混合物,進一步優選的,所述混合物中NaCl,KCl和CaCl2的質量比為2500:20:21。
7.根據權利要求4所述的冷凍保存液,其特征在于,所述弱堿性鹽選自NaHCO3,或KHCO3,優選的,所述中性鹽為NaCl,KCl和CaCl2的混合物,所述CaCl2與NaHCO3的質量比為10:1。
8.根據權利要求1所述的冷凍保存液,其特征在于,所述抗凍劑選自二甲基亞砜和/或甘油,優選10%-15%V/V二甲基亞砜或5%-10%V/V甘油,更優選10%V/V二甲基亞砜或5%V/V甘油。
9.根據權利要求1所述的冷凍保存液,其特征在于,所述保存液進一步被凍干。
10.制備權利要求1-9任意一項所述冷凍保存液的方法,包括取材,精子活力鑒定,精子稀釋,降溫平衡,第一次預冷,第二次預冷,保存,解凍和洗脫步驟。
11.根據權利要求10所述的制備方法,包括如下步驟:
(1)取材:取單環刺螠成熟雄體,75%乙醇擦拭腎孔周圍體表,從腎孔吸取精液,置于廣口瓶中;
(2)精子活力鑒定:顯微鏡觀察,鏡檢單環刺螠精子激活率達到85%以上;
(3)精子稀釋:加入精子保存劑,稀釋成精子懸浮液;
(4)降溫平衡:于稀釋后精液中添加抗凍劑,震蕩混勻,分裝至凍存管中,于冷藏箱中降溫平衡;
(5)第一次預冷:在保溫瓶中放入支架,加入液氮,在裝有精子的凍存管平鋪于保溫瓶中的平篩網表面,蓋上保溫瓶蓋;
(6)第二次預冷:打開保溫瓶蓋,向保溫瓶中添加液氮,使液氮面接近平篩網面,蓋上保溫瓶蓋;
(7)保存:取出凍存管,迅速將其放入液氮罐中保存;
任選的,還包括(8)解凍和洗脫步驟:當需要使用所保存的精子標本時,打開液氮罐,將凍存管拎出,迅速放入水浴中解凍后,加入精子保存劑,震蕩混勻,離心,取得精子沉淀鏡檢后用于人工授精。
優選的,所述制備方法包括如下步驟:
(1)取材:取單環刺螠成熟雄體,75%乙醇擦拭腎孔周圍體表,用吸管從腎孔吸取精液,置于滅菌干燥后的廣口瓶中;
(2)精子活力鑒定:用吸管取1滴精液于載玻片上,加上1滴海水制成涂片,顯微鏡觀察,鏡檢單環刺螠精子激活率達到85%以上,可以用于冷凍保存;
(3)精子稀釋:加入相對于精液體積的20倍精子保存劑,稀釋至106個mL的精子懸浮液;
(4)降溫平衡:于稀釋后精液中添加抗凍劑,震蕩混勻,分裝至1.8mL凍存管中,于4℃冷藏箱中降溫平衡30min;
(5)第一次預冷:在保溫瓶中放入支架,加入液氮,使液氮面距離平篩網面5cm;在裝有精子的凍存管外系上1m長線繩,將凍存管平鋪于保溫瓶中的平篩網表面,蓋上保溫瓶蓋;
(6)第二次預冷:打開保溫瓶蓋,向保溫瓶中添加液氮,使液氮面接近平篩網面,蓋上保溫瓶蓋;
(7)保存:取出凍存管,迅速將其放入液氮罐中保存;
(8)解凍和洗脫:當需要使用所保存的精子標本時,打開液氮罐,捏住露在液氮罐外的線繩,將凍存管拎出,迅速放入水浴中解凍后,加入精子保存劑,震蕩混勻,1000r/min離心5min,取得白色精子沉淀鏡檢后用于人工授精。
12.根據權利要求11所述的制備方法,其特征在于,步驟(1)中單環刺螠置于4℃的廣口瓶中備用。
13.根據權利要求11所述的制備方法,其特征在于,步驟(3)中精子保存劑包括NaCl,KCl和CaCl2和NaHCO3,其中NaCl,KCl和CaCl2和NaHCO3的質量比為25.00:20:21:2.1,優選的,保存劑包括NaCl 25.00g,KCl 0.20g,CaCl2 0.21g,NaHCO3 0.021g,將上述保存劑溶于1L蒸餾水中;進一步優選的,步驟(3)中蒸餾水的pH調至8。
14.根據權利要求11所述的制備方法,其特征在于,步驟(4)中抗凍劑成分為10%V/V二甲基亞砜DMSO。
15.根據權利要求11所述的制備方法,其特征在于,步驟(5)中支架采用鉛絲制成,鉛絲制成平篩網,其孔徑比凍存管略小,平篩網下部設有三條支柱;
進一步優選的,步驟(5)中第一次預冷時間為20min;
更進一步優選的,步驟(5)中第二次預冷時間為5min。
16.根據權利要求11所述的制備方法,其特征在于,步驟(8)中水浴的溫度為38℃,進一步優選的,步驟(8)中加入精子保存劑的體積為凍精的三倍。